本發(fā)明涉及一種細胞培養(yǎng)方法，特別是涉及一種用于腫瘤治療的nk細胞培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
癌癥是目前困擾人類的最為重大的疾病之一，無論發(fā)病率還是死亡率均呈持續(xù)上升趨勢。我國具有13.7億的龐大人口，據(jù)統(tǒng)計顯示，2015年我國約有4292,000例癌癥新發(fā)病例，其中2814,000例死亡；，癌癥治療問題亟待解決；腫瘤臨床治療基本以手術(shù)、放療和化療為主，但手術(shù)和放療雖然在控制腫瘤的局部病灶方面有很好的療效，但在預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移方面顯得無能為力，而腫瘤的免疫學(xué)治療可以彌補傳統(tǒng)治療手段的這一不足，給癌癥治療帶來新的曙光。
腫瘤免疫學(xué)治療是通過激發(fā)或調(diào)動機體的免疫系統(tǒng)，增強腫瘤微環(huán)境抗腫瘤免疫力，從而達到控制和殺死癌細胞的目的。目前，腫瘤免疫學(xué)治療已成為繼手術(shù)治療，放、化療之后的第四種癌癥治療模式，正逐漸為人們所接受。這些方法可以清除、殺死少量的術(shù)后殘留或擴散的癌細胞，提高、鞏固癌癥治療的效果，減少癌癥的復(fù)發(fā)。
自然殺傷細胞(naturalkillercell,nk)，屬淋巴細胞譜系，是機體的一種重要免疫細胞，主要分布于外周血中，占pbmc5～10％(臍帶血中nk細胞含量約為7％左右，淋巴結(jié)和骨髓中也有nk，但水平較外周血低)。nk細胞其對靶細胞的識別無mhc限制性,無需預(yù)先致敏即可直接殺傷癌細胞,也可分泌細胞因子調(diào)節(jié)其他免疫細胞的功能,是機體天然免疫的主要承擔(dān)者,也是獲得性細胞免疫的核心調(diào)節(jié)細胞,在腫瘤免疫、抗病毒感染及清除非己細胞中發(fā)揮重要作用。有研究證明自然殺傷細胞其實不僅是天然免疫系統(tǒng)中的重要作用成分，它同樣具有獲得性免疫細胞的一些特征。在免疫系統(tǒng)中，nk細胞反應(yīng)的速度比t細胞和b細胞要快，其作用機制主要是識別靶細胞，通過釋放穿孔素、顆粒酶和分泌多種細胞因子，迅速溶解某些癌細胞，發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫和造血作用以及直接殺傷靶細胞的作用。但由于nk細胞在人外周血中的含量低及腫瘤組織中分布頻率較低，極大的限制了nk細胞作為過繼免疫細胞在臨床上的應(yīng)用。目前，國內(nèi)外已經(jīng)有大量的學(xué)者對nk細胞的培養(yǎng)進行了研究，但是常規(guī)技術(shù)主要是在體外培養(yǎng)體系中加入il-2、il-12和ifn-γ等細胞因子來促進nk細胞的擴增，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后，nk細胞的純度和數(shù)量均不理想，因此也不能滿足實際的應(yīng)用；另外，這種方法因子需求量較大，成本較高，培養(yǎng)效果不穩(wěn)定，不適合體外大規(guī)模的應(yīng)用。另一種技術(shù)是以腫瘤滋養(yǎng)層促進nk細胞擴增的方法雖然能夠獲得大量的高純度的的細胞，但是安全性問題卻是其無法繞過的門檻。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種用于腫瘤治療的nk細胞培養(yǎng)方法，這種方法可在體外培養(yǎng)條件下獲得大量的、應(yīng)用安全的、純度較高的以及殺傷活性強的nk細胞，從而使得該細胞達到能夠安全有效的應(yīng)用于臨床的質(zhì)量指標(biāo)。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明用于腫瘤治療的nk細胞培養(yǎng)方法，其特征在于依次包括如下步驟：1）分離單核細胞：在原血中加入等體積的生理鹽水，吹打均勻；根據(jù)血液體積計算需要的離心管的個數(shù)，離心管中分別加入ficoll；用移液管把稀釋后的血樣緩緩加入到盛有ficoll的離心管中，每管加入血液，旋緊蓋子離心，注意血液要加到淋巴分離液的上層，切勿打破分界面。
將上述離心好的樣品輕輕取出離心機放入生物安全柜，在光照下可以看到樣品在離心管里大致分成四層，從上到下依次為生理鹽水血漿層、單核細胞層、ficoll層、粒細胞紅細胞層；用移液管小心將血漿層盡量吸棄干凈，然后沿離心管壁小心將單核細胞層吸取轉(zhuǎn)移到若干離心管中，等體積添加生理鹽水，旋緊蓋子顛倒混勻。
2）單核細胞洗滌：將上述收集好的細胞稀釋液進行離心，棄上清；用生理鹽水定容混合均勻，離心；重復(fù)洗滌細胞1次，離心前吸取樣本，赤蘚紅染色計數(shù)；最后收集得到的沉淀即為單核細胞。
3）nk細胞培養(yǎng)；根據(jù)前步驟中測得的細胞總數(shù)，加入okm100培養(yǎng)基，使細胞的接種濃度為2-4×106/ml，重懸；將用nk細胞因子包被好的培養(yǎng)瓶中的包被液吸出，再將細胞懸液轉(zhuǎn)移到包被過的培養(yǎng)瓶中，再加入自體滅活血清；旋緊瓶蓋，置于培養(yǎng)箱中37℃，5%co2培養(yǎng)。
day1-12nk細胞前期擴增：細胞生長到一定密度培養(yǎng)基顏色變黃時，需進行擴大培養(yǎng)。nk細胞在前期培養(yǎng)時，必須使用營養(yǎng)成分高含有il-2的okm100培養(yǎng)基，每次擴增需加自體血清。
nk細胞后期擴增：在nk細胞后期擴大培養(yǎng)時使用okm200培養(yǎng)基，使用方法與okm100一樣，最后擴增到1×109以上即可；最后一次擴繁用培養(yǎng)袋培養(yǎng)。
day12無菌檢測：細胞收獲前兩天，要對培養(yǎng)體系做無菌檢測；將細胞培養(yǎng)袋放入生物安全柜中，擠壓袋子，混勻體系，打開培養(yǎng)袋取樣管蓋子，用注射器抽取細胞樣本，做微生物檢測。
4）day14收獲：（1）從培養(yǎng)箱中取出細胞培養(yǎng)袋，置于生物安全柜中，將細胞懸液從細胞培養(yǎng)袋中轉(zhuǎn)入若干離心管中，擰緊蓋子，配平后置于離心機中，離心，棄上清，用渦旋振蕩器振散細胞團塊。
（2）用已加入適量人血白蛋白的生理鹽水洗前步離心管，將前述離心管內(nèi)細胞懸液并入另一離心管中，離心，棄上清，用渦旋振蕩器振散細胞團塊。
（3）用已加入適量人血白蛋白的生理鹽水洗前步離心管，合并前述離心管內(nèi)細胞懸液，吸取細胞樣本于取樣離心管中，交予質(zhì)量人員進行細胞計數(shù)，用生理鹽水將合并離心管內(nèi)細胞懸液定容，離心，棄上清，用渦旋振蕩器振散細胞團塊。
（4）加入生理鹽水混勻細胞，加入適量人血白蛋白；取出細胞樣品，交給質(zhì)量部進行內(nèi)毒素及微生物檢測，并留樣凍于冰箱待后續(xù)檢測；細胞懸液過細胞篩后，通過注射器將細胞懸液轉(zhuǎn)入細胞轉(zhuǎn)移袋中，封口，待出廠檢測合格即為成品。
本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中nk細胞擴增后數(shù)量、純度不理想、成本較高等問題，可在體外培養(yǎng)條件下獲得大量的、應(yīng)用安全的、純度較高的以及殺傷活性強的nk細胞，從而使得該細胞達到能夠安全有效的應(yīng)用于臨床的質(zhì)量指標(biāo)。
作為優(yōu)化，所述出廠檢測是如下細胞檢驗：細胞數(shù)量與活性檢測，細胞無菌檢測，支原體檢測，內(nèi)毒素檢測，細胞表型檢測。
作為優(yōu)化，所述細胞數(shù)量與活性檢測：是將細胞樣本混勻，取10μl細胞懸液用10μl赤蘚紅染色，經(jīng)血球計數(shù)板進行多次計數(shù)，根據(jù)平均值算出細胞的數(shù)量與活性，細胞數(shù)量達到1-3×109,細胞活性≧90%為合格。
所述細胞無菌檢測：是將細胞樣本混勻，取適量分別接種到硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和大豆酪蛋白流體培養(yǎng)基中，置于37℃生化培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，48-72h后觀察結(jié)果，培養(yǎng)基仍為澄清則說明結(jié)果為陰性。
所述支原體檢測：將day12操作中取的細胞樣本混勻，取適量用支原體檢測試劑盒進行支原體檢測。
所述內(nèi)毒素檢測：是用鱟試劑凝膠法對細胞樣本進行檢測，內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)≤0.25eu；操作如下：準(zhǔn)品處理：向內(nèi)毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)品加入bet水進行稀釋，按照鱟試劑規(guī)格稀釋成2λ的液體備用；鱟試劑處理：設(shè)置一組陰性對照一組陽性對照，加上day14收獲操作中取的細胞樣本，每組兩支，加入0.1mlbet水溶解，陽性對照組加入0.1ml2λ的標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對照組加入0.1mlbet水；放在37℃培養(yǎng)箱中30min-60min，觀察結(jié)果，陽性對照凝結(jié)，陰性對照和供試品組不凝結(jié)則說明供試品內(nèi)毒素合格。
所述細胞表型檢測：根據(jù)每種抗體1x106個細胞計算需要的細胞數(shù)，并采用陰性對照管，生理鹽水洗滌細胞，標(biāo)記抗體，在4℃孵育30min，生理鹽水清洗1-2次，去除未標(biāo)記的抗體，流式細胞儀進行檢測，將檢測結(jié)果用相關(guān)軟件進行分析，cd3-cd56+所占的比例≧70%-80%即為合格。
作為優(yōu)化，培養(yǎng)過程中對全血、第一次細胞接種、細胞轉(zhuǎn)袋培養(yǎng)、細胞收獲前兩天、出廠時分別做一次如下血平板檢測。
細胞數(shù)量與活性檢測：將細胞樣本混勻，取10μl細胞懸液用10μl赤蘚紅染色，經(jīng)血球計數(shù)板進行多次計數(shù)，根據(jù)平均值算出細胞的數(shù)量與活性，細胞數(shù)量達到1-3×109,細胞活性≧90%為合格。
細胞無菌檢測：是將細胞樣本混勻，取適量分別接種到硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和大豆酪蛋白流體培養(yǎng)基中，置于37℃生化培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，48-72h后觀察結(jié)果，培養(yǎng)基仍為澄清則說明結(jié)果為陰性。
作為優(yōu)化，在1）分離單核細胞前先進行如下準(zhǔn)備步驟：分離前準(zhǔn)備：操作中所需物品都用75%酒精消毒后才能放入生物安全柜；物品放入安全柜時要從右手進入，用完后從左手出；廢液缸放在左手邊，一般常用的物品如槍頭、移液器、移液管、剪刀、止血鉗等放在右手邊；不常用的物品可放在左手靠里的位置；操作過程中，不許左右手交叉操作，不許將手放在打開的無菌容器或培養(yǎng)瓶的上方。
全血檢驗與血樣保存：根據(jù)淋巴細胞絕對值計算采血量，將采血管用75%酒精噴灑消毒后放入生物安全柜，顛倒混勻；開啟采血管，用10ml移液管將血液從采血管中轉(zhuǎn)移至250ml離心管中，反復(fù)吹打混勻后取出約0.5ml血液到用于微生物檢測；取1ml血液于1.5ml凍存管中，保存在-80℃冰箱，作為檔案以備后續(xù)檢驗。
血漿處理：將盛有血液的250ml離心管放入離心機中，配平后，2500rpm離心10min，升10降10；離完心將上層血漿轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，蓋緊蓋子，貼封口膜，置于56℃水浴鍋中滅活30min，滅活后，3000rpm離心10min，棄沉淀，留上清；將處理好的血漿置于4℃保存待用。
作為優(yōu)化，步驟1）分離單核細胞中：所述離心管為50ml離心管，離心管中分別加入ficoll的數(shù)量為15ml，把稀釋后的血樣緩緩加入到盛有ficoll的離心管中的所述移液管為25ml移液管，每管加入血液的數(shù)量為30ml，所述離心為7升4降2000rpm離心20min，將血漿層盡量吸棄干凈的移液管為10ml移液管。
作為優(yōu)化，步驟2）單核細胞洗滌中：收集好的細胞稀釋液進行的離心是1600rpm離心10min，用生理鹽水定容混合均勻后的離心是1200rpm離心8min，離心前吸取的樣本數(shù)量是0.5ml。
作為優(yōu)化，步驟3）nk細胞培養(yǎng)中；加入自體滅活血清是加入5-10%體積比的自體滅活血清，每次擴增加自體血清的數(shù)量為1-5%體積比，抽取細胞樣本是用2ml注射器抽取約0.5ml細胞樣本。
作為優(yōu)化，步驟4）day14收獲是：（1）步驟中：所述離心管是250ml離心管，所述離心是2000rpm離心5min；（2）步驟中：用已加入適量人血白蛋白的生理鹽水洗前步離心管是用25ml×3次已加入適量人血白蛋白的生理鹽水洗離心管，將前述離心管內(nèi)細胞懸液并入另一離心管中，離心是細胞懸液并入另一離心管中，共75ml；依此操作，將離心管并為兩個，2000rpm離心5min；（3）步驟中：用已加入適量人血白蛋白的生理鹽水洗前步離心管是用50ml×2次已加入適量人血白蛋白的生理鹽水洗離心管；合并前述離心管內(nèi)細胞懸液，吸取細胞樣本于取樣離心管中是合并細胞懸液，共100ml，吸取約0.5ml細胞樣本于1.5ml離心管中；用生理鹽水將合并離心管內(nèi)細胞懸液定容，離心是用生理鹽水將細胞懸液定容至250ml，2000rpm離心5min；（4）步驟中：加入生理鹽水混勻細胞是加入100ml生理鹽水混勻細胞，加入適量人血白蛋白是加入適量人血白蛋白使人血白蛋白終濃度為1%，取出細胞樣品是取出約1.5ml細胞樣品，留樣凍于冰箱待后續(xù)檢測是留樣凍于-80℃冰箱待后續(xù)檢測，細胞懸液過細胞篩是細胞懸液過100μm的細胞篩，通過注射器將細胞懸液轉(zhuǎn)入細胞轉(zhuǎn)移袋中是通過60ml注射器將100ml細胞懸液轉(zhuǎn)入細胞轉(zhuǎn)移袋中，封口是用封管熱合器封口。
作為優(yōu)化，1）分離單核細胞前先進行如下生產(chǎn)前準(zhǔn)備：1）對于生產(chǎn)車間，要提前進行各項潔凈室驗證，包括沉降菌、浮游菌和塵埃粒子的驗證，通過驗證后，才可以投入使用。
2）nk細胞刺激因子okm-25應(yīng)用無菌pbs稀釋100-200倍后，取5-10ml加入到75cm2細胞培養(yǎng)瓶內(nèi),然后將細胞培養(yǎng)瓶放平，于室溫條件下過夜，然后轉(zhuǎn)入4℃冰箱內(nèi)保存待用。
3）潔凈室通風(fēng)循環(huán)系統(tǒng)預(yù)先運行并正常工作30min，進入潔凈室打開生物安全柜紫外燈設(shè)置30min，打開整個潔凈區(qū)紫外燈進行消毒滅菌；水浴鍋打開設(shè)置工作溫度為56℃。
4）將淋巴細胞分離液以及無血清培養(yǎng)基（okm100）置于冰箱外部恢復(fù)室溫。
本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中nk細胞擴增后數(shù)量、純度不理想、成本較高等問題，可在體外培養(yǎng)條件下獲得大量的、應(yīng)用安全的、純度較高的以及殺傷活性強的nk細胞，從而使得該細胞達到能夠安全有效的應(yīng)用于臨床的質(zhì)量指標(biāo)。
采用上述技術(shù)方案后，本發(fā)明用于腫瘤治療的nk細胞培養(yǎng)方法具有可在體外培養(yǎng)條件下獲得大量的、應(yīng)用安全的、純度較高的以及殺傷活性強的nk細胞，從而使得該細胞達到能夠安全有效的應(yīng)用于臨床的質(zhì)量指標(biāo)的優(yōu)點。
具體實施方式
本發(fā)明用于腫瘤治療的nk細胞培養(yǎng)方法依次包括如下步驟：1）分離單核細胞：在原血中加入等體積的生理鹽水，吹打均勻；根據(jù)血液體積計算需要的離心管的個數(shù)，離心管中分別加入ficoll；用移液管把稀釋后的血樣緩緩加入到盛有ficoll的離心管中，每管加入血液，旋緊蓋子離心，注意血液要加到淋巴分離液的上層，切勿打破分界面。
將上述離心好的樣品輕輕取出離心機放入生物安全柜，在光照下可以看到樣品在離心管里大致分成四層，從上到下依次為生理鹽水血漿層、單核細胞層、ficoll層、粒細胞紅細胞層；用移液管小心將血漿層盡量吸棄干凈，然后沿離心管壁小心將單核細胞層吸取轉(zhuǎn)移到若干離心管中，等體積添加生理鹽水，旋緊蓋子顛倒混勻。
2）單核細胞洗滌：將上述收集好的細胞稀釋液進行離心，棄上清；用生理鹽水定容混合均勻，離心；重復(fù)洗滌細胞1次，離心前吸取樣本，赤蘚紅染色計數(shù)；最后收集得到的沉淀即為單核細胞。
3）nk細胞培養(yǎng)；根據(jù)前步驟中測得的細胞總數(shù)，加入okm100培養(yǎng)基，使細胞的接種濃度為2-4×106/ml，重懸；將用nk細胞因子包被好的培養(yǎng)瓶中的包被液吸出，再將細胞懸液轉(zhuǎn)移到包被過的培養(yǎng)瓶中，再加入自體滅活血清；旋緊瓶蓋，置于培養(yǎng)箱中37℃，5%co2培養(yǎng)。
day1-12nk細胞前期擴增：細胞生長到一定密度培養(yǎng)基顏色變黃時，需進行擴大培養(yǎng)；nk細胞在前期培養(yǎng)時，必須使用營養(yǎng)成分高含有il-2的okm100培養(yǎng)基，每次擴增需加自體血清。
nk細胞后期擴增：在nk細胞后期擴大培養(yǎng)時使用okm200培養(yǎng)基，使用方法與okm100一樣，最后擴增到1×109以上即可；最后一次擴繁用培養(yǎng)袋培養(yǎng)。
day12無菌檢測：細胞收獲前兩天，要對培養(yǎng)體系做無菌檢測；將細胞培養(yǎng)袋放入生物安全柜中，擠壓袋子，混勻體系，打開培養(yǎng)袋取樣管蓋子，用注射器抽取細胞樣本，做微生物檢測。
4）day14收獲：（1）從培養(yǎng)箱中取出細胞培養(yǎng)袋，置于生物安全柜中，將細胞懸液從細胞培養(yǎng)袋中轉(zhuǎn)入若干離心管中，擰緊蓋子，配平后置于離心機中，離心，棄上清，用渦旋振蕩器振散細胞團塊。
（2）用已加入適量人血白蛋白的生理鹽水洗前步離心管，將前述離心管內(nèi)細胞懸液并入另一離心管中，離心，棄上清，用渦旋振蕩器振散細胞團塊。
（3）用已加入適量人血白蛋白的生理鹽水洗前步離心管，合并前述離心管內(nèi)細胞懸液，吸取細胞樣本于取樣離心管中，交予質(zhì)量人員進行細胞計數(shù)，用生理鹽水將合并離心管內(nèi)細胞懸液定容，離心，棄上清，用渦旋振蕩器振散細胞團塊。
（4）加入生理鹽水混勻細胞，加入適量人血白蛋白；取出細胞樣品，交給質(zhì)量部進行內(nèi)毒素及微生物檢測，并留樣凍于冰箱待后續(xù)檢測；細胞懸液過細胞篩后，通過注射器將細胞懸液轉(zhuǎn)入細胞轉(zhuǎn)移袋中，封口，待出廠檢測合格即為成品。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中nk細胞擴增后數(shù)量、純度不理想、成本較高等問題，可在體外培養(yǎng)條件下獲得大量的、應(yīng)用安全的、純度較高的以及殺傷活性強的nk細胞，從而使得該細胞達到能夠安全有效的應(yīng)用于臨床的質(zhì)量指標(biāo)。
具體是所述出廠檢測是如下細胞檢驗：細胞數(shù)量與活性檢測，細胞無菌檢測，支原體檢測，內(nèi)毒素檢測，細胞表型檢測。
更具體是所述細胞數(shù)量與活性檢測：是將細胞樣本混勻，取10μl細胞懸液用10μl赤蘚紅染色，經(jīng)血球計數(shù)板進行多次計數(shù)，根據(jù)平均值算出細胞的數(shù)量與活性，細胞數(shù)量達到1-3×109,細胞活性≧90%為合格。
所述細胞無菌檢測：是將細胞樣本混勻，取適量分別接種到硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和大豆酪蛋白流體培養(yǎng)基中，置于37℃生化培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，48-72h后觀察結(jié)果，培養(yǎng)基仍為澄清則說明結(jié)果為陰性。
所述支原體檢測：將day12操作中取的細胞樣本混勻，取適量用支原體檢測試劑盒進行支原體檢測。
所述內(nèi)毒素檢測：是用鱟試劑凝膠法對細胞樣本進行檢測，內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)≤0.25eu；操作如下：準(zhǔn)品處理：向內(nèi)毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)品加入bet水進行稀釋，按照鱟試劑規(guī)格稀釋成2λ的液體備用；鱟試劑處理：設(shè)置一組陰性對照一組陽性對照，加上day14收獲操作中取的細胞樣本，每組兩支，加入0.1mlbet水溶解，陽性對照組加入0.1ml2λ的標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對照組加入0.1mlbet水；放在37℃培養(yǎng)箱中30min-60min，觀察結(jié)果，陽性對照凝結(jié)，陰性對照和供試品組不凝結(jié)則說明供試品內(nèi)毒素合格。
所述細胞表型檢測：根據(jù)每種抗體1x106個細胞計算需要的細胞數(shù)，并采用陰性對照管，生理鹽水洗滌細胞，標(biāo)記抗體，在4℃孵育30min，生理鹽水清洗1-2次，去除未標(biāo)記的抗體，流式細胞儀進行檢測，將檢測結(jié)果用相關(guān)軟件進行分析，cd3-cd56+所占的比例≧70%-80%即為合格。
具體是：培養(yǎng)過程中對全血、第一次細胞接種、細胞轉(zhuǎn)袋培養(yǎng)、細胞收獲前兩天、出廠時分別做一次如下血平板檢測。
細胞數(shù)量與活性檢測：將細胞樣本混勻，取10μl細胞懸液用10μl赤蘚紅染色，經(jīng)血球計數(shù)板進行多次計數(shù)，根據(jù)平均值算出細胞的數(shù)量與活性，細胞數(shù)量達到1-3×109,細胞活性≧90%為合格。
細胞無菌檢測：是將細胞樣本混勻，取適量分別接種到硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和大豆酪蛋白流體培養(yǎng)基中，置于37℃生化培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，48-72h后觀察結(jié)果，培養(yǎng)基仍為澄清則說明結(jié)果為陰性。
具體是：在1）分離單核細胞前先進行如下準(zhǔn)備步驟：分離前準(zhǔn)備：操作中所需物品都用75%酒精消毒后才能放入生物安全柜；物品放入安全柜時要從右手進入，用完后從左手出；廢液缸放在左手邊，一般常用的物品如槍頭、移液器、移液管、剪刀、止血鉗等放在右手邊；不常用的物品可放在左手靠里的位置；操作過程中，不許左右手交叉操作，不許將手放在打開的無菌容器或培養(yǎng)瓶的上方。
全血檢驗與血樣保存：根據(jù)淋巴細胞絕對值計算采血量，將采血管用75%酒精噴灑消毒后放入生物安全柜，顛倒混勻；開啟采血管，用10ml移液管將血液從采血管中轉(zhuǎn)移至250ml離心管中，反復(fù)吹打混勻后取出約0.5ml血液到用于微生物檢測；取1ml血液于1.5ml凍存管中，保存在-80℃冰箱，作為檔案以備后續(xù)檢驗。
血漿處理：將盛有血液的250ml離心管放入離心機中，配平后，2500rpm離心10min（升10降10）。離完心將上層血漿轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，蓋緊蓋子，貼封口膜，置于56℃水浴鍋中滅活30min，滅活后，3000rpm離心10min，棄沉淀，留上清；將處理好的血漿置于4℃保存待用。
具體是：步驟1）分離單核細胞中：所述離心管為50ml離心管，離心管中分別加入ficoll的數(shù)量為15ml，把稀釋后的血樣緩緩加入到盛有ficoll的離心管中的所述移液管為25ml移液管，每管加入血液的數(shù)量為30ml，所述離心為7升4降2000rpm離心20min，將血漿層盡量吸棄干凈的移液管為10ml移液管。
具體是：步驟2）單核細胞洗滌中：收集好的細胞稀釋液進行的離心是1600rpm離心10min，用生理鹽水定容混合均勻后的離心是1200rpm離心8min，離心前吸取的樣本數(shù)量是0.5ml。具體是：步驟3）nk細胞培養(yǎng)中；加入自體滅活血清是加入5-10%體積比的自體滅活血清，每次擴增加自體血清的數(shù)量為1-5%體積比，抽取細胞樣本是用2ml注射器抽取約0.5ml細胞樣本。
具體是：步驟4）day14收獲是：（1）步驟中：所述離心管是250ml離心管，所述離心是2000rpm離心5min；（2）步驟中：用已加入適量人血白蛋白的生理鹽水洗前步離心管是用25ml×3次已加入適量人血白蛋白的生理鹽水洗離心管，將前述離心管內(nèi)細胞懸液并入另一離心管中，離心是細胞懸液并入另一離心管中，共75ml；依此操作，將離心管并為兩個，2000rpm離心5min；（3）步驟中：用已加入適量人血白蛋白的生理鹽水洗前步離心管是用50ml×2次已加入適量人血白蛋白的生理鹽水洗離心管；合并前述離心管內(nèi)細胞懸液，吸取細胞樣本于取樣離心管中是合并細胞懸液，共100ml，吸取約0.5ml細胞樣本于1.5ml離心管中；用生理鹽水將合并離心管內(nèi)細胞懸液定容，離心是用生理鹽水將細胞懸液定容至250ml，2000rpm離心5min；（4）步驟中：加入生理鹽水混勻細胞是加入100ml生理鹽水混勻細胞，加入適量人血白蛋白是加入適量人血白蛋白使人血白蛋白終濃度為1%，取出細胞樣品是取出約1.5ml細胞樣品，留樣凍于冰箱待后續(xù)檢測是留樣凍于-80℃冰箱待后續(xù)檢測，細胞懸液過細胞篩是細胞懸液過100μm的細胞篩，通過注射器將細胞懸液轉(zhuǎn)入細胞轉(zhuǎn)移袋中是通過60ml注射器將100ml細胞懸液轉(zhuǎn)入細胞轉(zhuǎn)移袋中，封口是用封管熱合器封口。
具體是：1）分離單核細胞前先進行如下生產(chǎn)前準(zhǔn)備：1）對于生產(chǎn)車間，要提前進行各項潔凈室驗證，包括沉降菌、浮游菌和塵埃粒子的驗證，通過驗證后，才可以投入使用。
2）nk細胞刺激因子okm-25應(yīng)用無菌pbs稀釋100-200倍后，取5-10ml加入到75cm2細胞培養(yǎng)瓶內(nèi),然后將細胞培養(yǎng)瓶放平，于室溫條件下過夜，然后轉(zhuǎn)入4℃冰箱內(nèi)保存待用；
3）潔凈室通風(fēng)循環(huán)系統(tǒng)預(yù)先運行并正常工作30min，進入潔凈室打開生物安全柜紫外燈設(shè)置30min，打開整個潔凈區(qū)紫外燈進行消毒滅菌；水浴鍋打開設(shè)置工作溫度為56℃。
4）將淋巴細胞分離液以及無血清培養(yǎng)基（okm100）置于冰箱外部恢復(fù)室溫。
本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中nk細胞擴增后數(shù)量、純度不理想、成本較高等問題，可在體外培養(yǎng)條件下獲得大量的、應(yīng)用安全的、純度較高的以及殺傷活性強的nk細胞，從而使得該細胞達到能夠安全有效的應(yīng)用于臨床的質(zhì)量指標(biāo)。更詳細說明如下。
生產(chǎn)前準(zhǔn)備：1.1、對于生產(chǎn)車間，要提前進行各項潔凈室驗證，包括沉降菌、浮游菌和塵埃粒子的驗證。通過驗證后，才可以投入使用。
1.2、nk細胞刺激因子okm-25應(yīng)用無菌pbs稀釋100-200倍后，取5-10ml加入到75cm2細胞培養(yǎng)瓶內(nèi),然后將細胞培養(yǎng)瓶放平，于室溫條件下過夜，然后轉(zhuǎn)入4℃冰箱內(nèi)保存待用。
1.3、潔凈室通風(fēng)循環(huán)系統(tǒng)預(yù)先運行并正常工作30min，進入潔凈室打開生物安全柜紫外燈設(shè)置30min，打開整個潔凈區(qū)紫外燈進行消毒滅菌。水浴鍋打開設(shè)置工作溫度為56℃。
1.4、將淋巴細胞分離液以及無血清培養(yǎng)基（okm100）置于冰箱外部恢復(fù)室溫。
人外周血單核細胞分離：2.1分離前準(zhǔn)備：在操作中，所需物品都需要用75%酒精消毒后才能放入生物安全柜。物品放入安全柜時要從右手進入，用完后從左手出。廢液缸放在左手邊，一般常用的物品如槍頭、移液器、移液管、剪刀、止血鉗等放在右手邊；不常用的物品可放在左手靠里的位置。操作過程中，不許左右手交叉操作，不許將手放在打開的無菌容器或培養(yǎng)瓶的上方。
全血檢驗與血樣保存：根據(jù)淋巴細胞絕對值計算采血量，計算公式：采血量（ml）=80/淋巴細胞絕對值。將采血管用75%酒精噴灑消毒后放入生物安全柜，顛倒混勻。開啟采血管，用10ml移液管將血液從采血管中轉(zhuǎn)移至250ml離心管中，反復(fù)吹打混勻后取出約0.5ml血液到用于微生物檢測；取1ml血液于1.5ml凍存管中，保存在-80℃冰箱，作為檔案以備后續(xù)檢驗。
血漿處理：將盛有血液的250ml離心管放入離心機中，配平后，2500rpm離心10min，升10降10；離完心將上層血漿轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，蓋緊蓋子，貼封口膜，置于56℃水浴鍋中滅活30min，滅活后，3000rpm離心10min，棄沉淀，留上清。將處理好的血漿置于4℃保存待用。
分離單核細胞：在原血中加入等體積的生理鹽水，吹打均勻；根據(jù)血液體積計算需要的50ml離心管的個數(shù)，離心管中分別加入15mlficoll；用25ml移液管把稀釋后的血樣緩緩加入到盛有ficoll的離心管中，每管加入30ml血液，旋緊蓋子，2000rpm離心20min（升7降4）。注意血液要加到淋巴分離液的上層，切勿打破分界面。
將上述離心好的樣品輕輕取出離心機放入生物安全柜，在光照下可以看到樣品在離心管里大致分成四層，從上到下依次為生理鹽水血漿層、單核細胞層、ficoll層、粒細胞紅細胞層。用10ml移液管小心將血漿層盡量吸棄干凈，然后沿離心管壁小心將單核細胞層吸取轉(zhuǎn)移到若干50ml離心管中，等體積添加生理鹽水，旋緊蓋子顛倒混勻。
單核細胞洗滌：將上述收集好的細胞稀釋液進行離心，1600rpm離心10min，棄上清；用生理鹽水定容到45ml，混合均勻，1200rpm離心8min；重復(fù)洗滌細胞1次，離心前吸取約0.5ml樣本，赤蘚紅染色計數(shù)。最后收集得到的沉淀即為單核細胞。
細胞培養(yǎng)：根據(jù)前步驟中測得的細胞總數(shù)，加入okm100培養(yǎng)基，使細胞的接種濃度為2-4×106/ml，重懸。將用nk細胞因子包被好的培養(yǎng)瓶中的包被液吸出，再將細胞懸液轉(zhuǎn)移到包被過的培養(yǎng)瓶中，再加入5-10%自體滅活血清。旋緊瓶蓋，置于培養(yǎng)箱中37℃，5%co2培養(yǎng)。
細胞前期擴增：細胞生長到一定密度培養(yǎng)基顏色變黃時，需進行擴大培養(yǎng)。nk細胞在前期培養(yǎng)時，必須使用營養(yǎng)成分高的okm100培養(yǎng)基，每次擴增需加自體血清（根據(jù)自體血清體積加1-5%）。因為okm培養(yǎng)基中已含有il-2，所以nk細胞在使用okm培養(yǎng)基進行培養(yǎng)時，不需要再添加任何細胞因子。
細胞后期擴增：在nk細胞后期擴大培養(yǎng)時可以使用okm200培養(yǎng)基，使用方法與okm100一樣，最后擴增到1×109以上即可。最后一次擴繁可以用培養(yǎng)袋培養(yǎng)。
無菌檢測：細胞收獲前兩天，要對培養(yǎng)體系做無菌檢測。將細胞培養(yǎng)袋放入生物安全柜中，擠壓袋子，混勻體系，打開培養(yǎng)袋取樣管蓋子，用2ml注射器抽取約0.5ml細胞樣本，做微生物檢測。
收獲：1）從培養(yǎng)箱中取出細胞培養(yǎng)袋，置于生物安全柜中，將細胞懸液從細胞培養(yǎng)袋中轉(zhuǎn)入若干250ml離心管中，擰緊蓋子，配平后置于離心機中，2000rpm離心5min，棄上清，用渦旋振蕩器振散細胞團塊。
2）用25ml×3次生理鹽水（已加入適量人血白蛋白）洗離心管，細胞懸液并入另一離心管中，共75ml；依此操作，將四個離心管并為兩個，2000rpm離心5min，棄上清，用渦旋振蕩器振散細胞團塊。
3）用50ml×2次生理鹽水（已加入適量人血白蛋白）洗離心管，合并細胞懸液，共100ml，吸取約0.5ml細胞樣本于1.5ml離心管中，交予質(zhì)量人員進行細胞計數(shù)，用生理鹽水將細胞懸液定容至250ml，2000rpm離心5min，棄上清，用渦旋振蕩器振散細胞團塊。
4）加入100ml生理鹽水混勻細胞，加入適量人血白蛋白（終濃度為1%）；取出約1.5ml細胞樣品，交給質(zhì)量部進行內(nèi)毒素及微生物檢測，并留樣凍于-80℃冰箱待后續(xù)檢測，細胞懸液過100μm的細胞篩后，通過60ml注射器連接100ml細胞轉(zhuǎn)移袋，將細胞懸液轉(zhuǎn)入細胞轉(zhuǎn)移袋中，用封管熱合器封口，待出廠檢測。
細胞檢驗：4.1細胞數(shù)量與活性檢測：將細胞樣本混勻，取10μl細胞懸液用10μl赤蘚紅染色，經(jīng)血球計數(shù)板進行多次計數(shù)，根據(jù)平均值算出細胞的數(shù)量與活性，細胞數(shù)量要求1-3×109,細胞活性要求≧90%。
細胞無菌檢測：將細胞樣本混勻，取適量分別接種到硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和大豆酪蛋白流體培養(yǎng)基中，置于37℃生化培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，48-72h后觀察結(jié)果，培養(yǎng)基仍為澄清則說明結(jié)果為陰性。
除此之外，還需要對全血、第一次細胞接種、細胞轉(zhuǎn)袋培養(yǎng)、細胞收獲前兩天、出廠時分別做一次血平板檢測。用這兩種方法可以監(jiān)控細胞有無細菌污染，并方便排查原因。
支原體檢測：支原體個體小，較一般細菌更難檢測，本公司用支原體檢測試劑盒進行檢測。方法是將day12操作中取的細胞樣本混勻，取適量用于支原體檢測。
內(nèi)毒素檢測：本公司用鱟試劑凝膠法對細胞樣本進行檢測。內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)≤0.25eu。操作如下：1）準(zhǔn)品處理：向內(nèi)毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)品加入bet水進行稀釋，按照鱟試劑規(guī)格稀釋成2λ的液體備用。2）鱟試劑處理：設(shè)置一組陰性對照一組陽性對照，加上day14收獲操作中取的細胞樣本，每組兩支，加入0.1mlbet水溶解，陽性對照組加入0.1ml2λ的標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對照組加入0.1mlbet水。3）放在37℃培養(yǎng)箱中30min-60min，觀察結(jié)果，陽性對照凝結(jié)，陰性對照和供試品組不凝結(jié)則說明供試品內(nèi)毒素合格。
細胞表型檢測：根據(jù)每種抗體1x106個細胞計算需要的細胞數(shù)，需要陰性對照管，生理鹽水洗滌細胞，標(biāo)記抗體，在4℃孵育30min，生理鹽水清洗1-2次，去除未標(biāo)記的抗體，流式細胞儀進行檢測，將檢測結(jié)果用相關(guān)軟件進行分析，cd3-cd56+所占的比例≧70%-80%。
本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中nk細胞擴增后數(shù)量、純度不理想、成本較高等問題，可在體外培養(yǎng)條件下獲得大量的、應(yīng)用安全的、純度較高的以及殺傷活性強的nk細胞，從而使得該細胞達到能夠安全有效的應(yīng)用于臨床的質(zhì)量指標(biāo)。