本發(fā)明涉及干細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，特別涉及一種干細(xì)胞培養(yǎng)體系及其培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞。在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞。根據(jù)干細(xì)胞所處的發(fā)育階段分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。根據(jù)干細(xì)胞的發(fā)育潛能分為三類：全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞和單能干細(xì)胞。干細(xì)胞是一種未充分分化，尚不成熟的細(xì)胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫(yī)學(xué)界稱為“萬用細(xì)胞”。
公開號為CN103305466A的中國專利《一種保持高細(xì)胞活率的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)方法》公開了一種保持高細(xì)胞活率的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)方法,在無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，對神經(jīng)干細(xì)胞交替進行懸浮與貼壁培養(yǎng)。
但是這種保持高細(xì)胞活率的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)方法存在以下缺點:在培養(yǎng)基內(nèi)交替進行懸浮與貼壁培養(yǎng),神經(jīng)干細(xì)胞所處的環(huán)境與體內(nèi)自然生長的狀態(tài)想去甚遠,導(dǎo)致在體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞在培養(yǎng)室逐漸喪失了原有的性狀,在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能方面都于其在體內(nèi)自然生長的狀態(tài)想去甚遠。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種干細(xì)胞培養(yǎng)體系及其培養(yǎng)方法，具有模擬體內(nèi)微環(huán)境的效果。
本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)的：一種干細(xì)胞培養(yǎng)體系，由下到上依次包括飼養(yǎng)層細(xì)胞、設(shè)置于所述飼養(yǎng)層細(xì)胞上方的一層用于分離飼養(yǎng)層細(xì)胞和干細(xì)胞的細(xì)胞篩網(wǎng)、三維培養(yǎng)基，所述三維培養(yǎng)基包括由Matrigel制作而成的三維支架和完全培養(yǎng)基，所述完全培養(yǎng)基包括DMEM培養(yǎng)基、FCS、β-疏基乙醇、LIF、谷氨酰胺和胰島素。
干細(xì)胞是一類具有高度自我復(fù)制能力和多向分化潛能的原值未特化細(xì)胞的統(tǒng)稱，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的科研。在體外二維培養(yǎng)時，貼壁生長，與體內(nèi)環(huán)境相差較大，容易造成細(xì)胞凋亡和畸變?，F(xiàn)有多種商業(yè)化的干細(xì)胞，本發(fā)明采用商購的干細(xì)胞，不涉及任何倫理道德。Matrigel是從富含胞外基質(zhì)擔(dān)保的EHS小鼠腫瘤中分離出來的重組基質(zhì)成分，Matrigel的主要成分是層黏連蛋白，一種可溶性的大分子蛋白質(zhì)，層黏連蛋白上存在供干細(xì)胞表面黏附分子的結(jié)合位點，供干細(xì)胞結(jié)合和粘附，進而形成供細(xì)胞附著和生長的類似腳手架的多孔結(jié)構(gòu)，使干細(xì)胞能依附于三維支架進行三維生長和遷移。通過在培養(yǎng)體系中模擬體內(nèi)的三維環(huán)境，在干細(xì)胞增殖培養(yǎng)時，降低凋亡率，使干細(xì)胞呈現(xiàn)高核質(zhì)比，增強干細(xì)胞的分化能力和驅(qū)化因子的表達。
Matrigel除了層黏蛋白外，還包括多種細(xì)胞外基質(zhì)、蛋白酶和生長因子成分，通過這些物質(zhì)的協(xié)同作用參與干細(xì)胞的生長、分化、遷移和組織形成，并能誘導(dǎo)干細(xì)胞表達必要的蛋白質(zhì)以附著于三維支架上，從而促進細(xì)胞與三維支架之間、細(xì)胞與細(xì)胞之間更好的連接，因此，Matrigel相比于其他三維支架更能發(fā)揮生物學(xué)調(diào)節(jié)功能，能更好地模擬干細(xì)胞在體內(nèi)所處的微環(huán)境。
干細(xì)胞在用于科研時，需經(jīng)過增殖擴大后再進行分化培養(yǎng)。在增值擴大培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)體系需要滿足兩個基本條件，一是促進細(xì)胞的分裂增殖，二是抑制細(xì)胞的分化。在干細(xì)胞培養(yǎng)過程中，DMEM培養(yǎng)基是一種含有各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基，用于供給干細(xì)胞培養(yǎng)過程中所需的各種營養(yǎng)成分。在完全培養(yǎng)基中加入β-疏基乙醇，β-疏基乙醇具有促進干細(xì)胞增殖分裂的作用。谷氨酰胺是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)和核酸所必需的物質(zhì)，在干細(xì)胞增殖培養(yǎng)時對谷氨酰胺的要求較高，缺乏時容易造成干細(xì)胞的凋亡。干細(xì)胞增殖時是進行連續(xù)分裂進行增殖，增殖時需要合成蛋白質(zhì)和核酸，而DMEM培養(yǎng)基是不含有核苷酸，而核苷酸又是細(xì)胞合成核酸的原料，因此加入核苷酸保證干細(xì)胞分裂時有充足的原料。在干細(xì)胞增殖時胰島素樣生長因子具有顯著的促進作用，但是在實際過程中存在提取十分困難，胰島素與胰島素樣生長因子不僅結(jié)構(gòu)類似，功能上也一致，通過用胰島素代替胰島素樣生長因子，來實現(xiàn)對干細(xì)胞增殖的促進作用。通過加入DMEM培養(yǎng)基、核苷酸、谷氨酰胺等為干細(xì)胞增殖提供足夠的原料，用β-疏基乙醇和胰島素協(xié)同作用促進干細(xì)胞的增殖，使干細(xì)胞數(shù)量在培養(yǎng)時能快速擴大。
LIF的英文全稱為Leukemia Inhibitory Factor,中文譯為白血病抑制因子,其為一種具有多種功能的細(xì)胞因子,但其最重要的應(yīng)用是維持胚胎干細(xì)胞等的未分化狀態(tài)。在培養(yǎng)體系的下方設(shè)置一層飼養(yǎng)層細(xì)胞，飼養(yǎng)層細(xì)胞是一些特定的細(xì)胞如顆粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞等已在體外培養(yǎng)的細(xì)胞，在經(jīng)有絲分裂阻斷處理后得到的細(xì)胞單層，飼養(yǎng)層細(xì)胞大部分可用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。一般對飼養(yǎng)層細(xì)胞的要求為不分裂不增殖而保持代謝活性，分泌干細(xì)胞在體外存活增殖所述必須的生長因子，是干細(xì)胞培養(yǎng)，特別是胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)中用到的生長增殖促進劑和分化抑制劑。通過LIF和飼養(yǎng)層細(xì)胞的聯(lián)合作用，共同抑制干細(xì)胞在培養(yǎng)過程中不會被分化。
在干細(xì)胞和飼養(yǎng)層細(xì)胞共同培養(yǎng)時，干細(xì)胞沿三維支架遷移和延伸時會接觸或進入飼養(yǎng)層細(xì)胞中，雖然兩種細(xì)胞之間的結(jié)合力較弱，但在后續(xù)的增殖及分化試驗中分離時卻十分困難，耗時耗力。通過在飼養(yǎng)層細(xì)胞上方設(shè)置一層細(xì)胞篩網(wǎng)，既能使飼養(yǎng)層細(xì)胞分泌的生長因子透過細(xì)胞篩網(wǎng)之間的孔徑滲透到培養(yǎng)基內(nèi)，又能防止干細(xì)胞與飼養(yǎng)層細(xì)胞接觸，實現(xiàn)飼養(yǎng)層細(xì)胞和干細(xì)胞的隔離培養(yǎng)，不僅方便分離，而且也能避免飼養(yǎng)層細(xì)胞混入干細(xì)胞內(nèi)后形成安全隱患，提高生物安全性。
通過用DMEM培養(yǎng)基、谷氨酰胺、核苷酸、組成的完全培養(yǎng)基，為干細(xì)胞培養(yǎng)時提供充足的原料，Matrigel中層黏連蛋白形成模擬體內(nèi)的三維環(huán)境的支架，Matrigel中的種細(xì)胞外基質(zhì)、蛋白酶和生長因子成分和飼養(yǎng)層細(xì)胞分泌的生長因子組成模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的生物成分，通過三維支架和生物成分模擬出干細(xì)胞在體內(nèi)所處的細(xì)胞外基質(zhì)，使干細(xì)胞培養(yǎng)時在體外環(huán)境與其在體內(nèi)相似，從而避免環(huán)境因素而導(dǎo)致細(xì)胞畸變甚至歪曲科研實驗結(jié)果。飼養(yǎng)層細(xì)胞和β-疏基乙醇、胰島素共同作用促進干細(xì)胞的增殖，飼養(yǎng)層細(xì)胞又和LIF協(xié)同作用，抑制干細(xì)胞在增殖時發(fā)生分化。
本發(fā)明的進一步設(shè)置為：所述完全培養(yǎng)基以DMEM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，包括15％的所述FCS，所述β-疏基乙醇濃度為0.1mmol/ml，所述LIF濃度為1.5×103U/ml，所述谷氨酰胺濃度為200ug/ml，所述胰島素濃度為10-50ng/ml。
通過采用上述技術(shù)方案，LIF濃度為1.5×103U/ml,避免使LIF保持有效的生物活性，胰島素濃度為10-50ng/ml,濃度不會過早而造成毒性較高而影響，β-疏基乙醇濃度為0.1mmol/ml，使β-疏基乙醇濃度具有促進干細(xì)胞增殖的活性。
本發(fā)明的進一步設(shè)置為：所述完全培養(yǎng)基還包括0.1ug/ml的胎球蛋白。
通過采用上述技術(shù)方案，胎球蛋白是一種發(fā)現(xiàn)胎牛血清的蛋白質(zhì)，兩條肽鏈自同一前體切割產(chǎn)生并以一對二硫鍵相連，現(xiàn)有技術(shù)中公開了多種從胎牛血清中分離出胎球蛋白的方法。胎球蛋白在加入干細(xì)胞培養(yǎng)體系后，能提高干細(xì)胞的活性，對干細(xì)胞的增殖具有促進作用。
本發(fā)明的進一步設(shè)置為：所述完全培養(yǎng)基還包括0.4uM的愛帕琳肽。
通過采用上述技術(shù)方案，愛帕琳肽是一種由人類染色體上的APLIN基因產(chǎn)生的多肽，可以采用商購或合成的愛帕琳肽，通過加入到培養(yǎng)體系后，能提高干細(xì)胞的增殖活性，促進干細(xì)胞在三維支架上的增殖和遷移。
本發(fā)明的進一步設(shè)置為：所述完全培養(yǎng)基還包括0.5uM的Blebbistatin。
通過采用上述技術(shù)方案，Blebbistatin是一種選擇性的肌球蛋白ATP酶抑制劑，對干細(xì)胞在增值過程中的分化具有抑制作用，通過與飼養(yǎng)層細(xì)胞、β-疏基乙醇等聯(lián)合作用，共同抑制干細(xì)胞在增值時的分化和畸形。
本發(fā)明的進一步設(shè)置為：所述完全培養(yǎng)基還包括濃度為100ng/ml硫酸乙酰肝素2。
通過采用上述技術(shù)方案，硫酸乙酰肝素2是一種碳水化合物，它是細(xì)胞表面某些蛋白質(zhì)的包被物，對干細(xì)胞特別是胚胎干細(xì)胞的正常增殖和潛能非常重要，缺少硫酸乙酰肝素2時，促進干細(xì)胞更新的三種主要細(xì)胞外因子Wnt、FGF、BMP無法正確向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號，導(dǎo)致干細(xì)胞生長緩慢，并且會自動分化成其他細(xì)胞。雖然Matrigel內(nèi)含有硫酸乙酰肝素2，但是為保證干細(xì)胞的正常增殖和更新，向完全培養(yǎng)基內(nèi)加入硫酸乙酰肝素2，保證硫酸乙酰肝素2有充足的含量。
本發(fā)明的進一步設(shè)置為：所述完全培養(yǎng)基還包括10ug/ml的維生素E。
通過采用上述技術(shù)方案，通過在完全培養(yǎng)基內(nèi)加入維生素E，為干細(xì)胞提供維生素，同時維生素E具有抗氧化的作用。
本發(fā)明的進一步設(shè)置為：所述DMEM培養(yǎng)基為高糖型。
通過采用上述技術(shù)方案，相比于低糖濃度的DMEM培養(yǎng)基，高濃度的糖會提高干細(xì)胞的增殖速度，在增殖培養(yǎng)中縮短培養(yǎng)周期和時間。
本發(fā)明的進一步設(shè)置為：所述細(xì)胞篩網(wǎng)孔徑為1um-100um。
通過采用上述技術(shù)方案，細(xì)胞篩網(wǎng)根據(jù)培養(yǎng)干細(xì)胞大小的不同，選擇合適孔徑的篩網(wǎng)對干細(xì)胞進行隔離培養(yǎng)。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種用上述干細(xì)胞培養(yǎng)體系培養(yǎng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)的：一種用如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)體系培養(yǎng)干細(xì)胞的方法，a)在培養(yǎng)容器內(nèi)制備一層飼養(yǎng)層細(xì)胞；b)將一層細(xì)胞篩網(wǎng)固定于培養(yǎng)容器內(nèi)且位于飼養(yǎng)層細(xì)胞上方；c)制備干細(xì)胞懸液，與Matrigel等比例混合后，加入到培養(yǎng)容器內(nèi),靜置；d)向培養(yǎng)容器內(nèi)加入完全培養(yǎng)基，每天更換一次完全培養(yǎng)基。
通過采用上述技術(shù)方案，飼養(yǎng)細(xì)胞位于培養(yǎng)容器底部，通過細(xì)胞篩網(wǎng)與干細(xì)胞進行隔離培養(yǎng)，將干細(xì)胞制作懸液后，與Matrigel等比例混合后形成三維培養(yǎng)體系，最后向培養(yǎng)容器內(nèi)加入完全培養(yǎng)基，液態(tài)的完全培養(yǎng)基浸入到三維支架內(nèi)部，為附著于三維支架上的干細(xì)胞提供養(yǎng)分。
綜上所述，本發(fā)明具有以下有益效果：采用Matrigel和飼養(yǎng)細(xì)胞分泌的生長因子共同模擬出干細(xì)胞在體內(nèi)所處的細(xì)胞外基質(zhì)，使細(xì)胞在體外生活環(huán)境和其在體內(nèi)相似，保證細(xì)胞的增殖和正常形態(tài)，同時通過飼養(yǎng)層細(xì)胞和β-疏基乙醇、胰島素共同作用促進干細(xì)胞的增殖，飼養(yǎng)層細(xì)胞又和LIF協(xié)同作用，抑制干細(xì)胞在增殖時發(fā)生分化，使干細(xì)胞在保持增殖活性的同時不會發(fā)生分化，其次，在飼養(yǎng)層細(xì)胞上方設(shè)置一層細(xì)胞篩網(wǎng)，將干細(xì)胞和飼養(yǎng)層細(xì)胞進行隔離培養(yǎng)，便于后續(xù)的細(xì)胞分離，達到了模擬體內(nèi)細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、干細(xì)胞活性高、生物安全性高、分離方便的效果。
具體實施方式
具體實施例僅僅是對本發(fā)明的解釋，其并不是對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀完本說明書后可以根據(jù)需要對本實施例做出沒有創(chuàng)造性貢獻的修改，但只要在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)都受到專利法的保護。
實施例1：一種干細(xì)胞培養(yǎng)體系的培養(yǎng)方法，包括a),在培養(yǎng)容器內(nèi)制備一層飼養(yǎng)層細(xì)胞，商購MEF細(xì)胞，配置MEF生長培養(yǎng)基，用高糖培養(yǎng)基和10％FCS配制；準(zhǔn)備一只15ml離心管，加5ml預(yù)熱MEF生長培養(yǎng)基，取一只液氮凍存的MEF細(xì)胞，37攝氏度水浴中輕輕振蕩，細(xì)胞融化后轉(zhuǎn)移到離心管中；離心后收集細(xì)胞，懸于10mlMEF生長培養(yǎng)基，接種150mm組織培養(yǎng)皿，加MEF生長培養(yǎng)基至25ml，37攝氏度孵育至細(xì)胞長滿。細(xì)胞長滿后加入絲裂霉素C，吸掉培養(yǎng)基，加入新配制的含10ug/ml的絲裂霉素C的MEF生長培養(yǎng)基。37攝氏度孵育2.5小時，其中絲裂霉素C母液，2ml絲裂霉素C溶于5ml無菌PBS。母液用鋁箔包裹，使用時用MEF生長培養(yǎng)基稀釋至終濃度10ug/ml。孵育的同時準(zhǔn)備明膠處理的滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)皿；去掉培養(yǎng)基，10mlPBS沖洗三次，完全去除絲裂霉素C，加入10ml胰酶溶液，37攝氏度孵育5分鐘。加入3mlMEF生長培養(yǎng)基，吹吸分散細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至15ml離心管。離心收集細(xì)胞，懸于10mlMEF生長培養(yǎng)基，計數(shù)細(xì)胞。絲裂霉素處理的MEF細(xì)胞以合適密度接種明膠包被的培養(yǎng)容器內(nèi)。
b)將一層細(xì)胞篩網(wǎng)固定于培養(yǎng)容器內(nèi)，且位于飼養(yǎng)層細(xì)胞的上方。細(xì)胞篩網(wǎng)的孔徑間隙為1um。
c)選用商購的小鼠胚胎干細(xì)胞作為試驗的干細(xì)胞，制備干細(xì)胞懸液，將干細(xì)胞離心后收集細(xì)胞沉淀，加入5ml預(yù)熱至37攝氏度的完全培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，選取5ml干細(xì)胞懸液與5mlMatrigel混合均勻后加入到培養(yǎng)容器內(nèi)，靜置5分鐘。完全培養(yǎng)基成分按以下表1中的比例進行配置。
d)向培養(yǎng)容器內(nèi)加入10ml完全培養(yǎng)基，每天更換一次完全培養(yǎng)基。換液時吸取10ml完全培養(yǎng)基后，加入10ml完全培養(yǎng)基。
細(xì)胞凋亡率檢測：從培養(yǎng)容器內(nèi)取懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞0.3ml，放在流式細(xì)胞儀測定試管中，用液氮凍結(jié)，室溫下溶解，然后加入3mmol/L的PI30ul,5分鐘后，用流式細(xì)胞儀檢測，并將檢測結(jié)果在表1中列出。各實施例與對比例之間采用t檢驗，以α＝0.05為檢驗水準(zhǔn)，采用SPSS17.0數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，計量資料用均數(shù)(x±s)表示。
核質(zhì)比檢測：核質(zhì)比高是干細(xì)胞的重要形態(tài)特征之一，用來鑒定干細(xì)胞是否分化。從培養(yǎng)容器內(nèi)取懸浮液5ml,吹打成單細(xì)胞懸液，離心后棄上清，37攝氏度孵育5分鐘，加固定液，固定液由甲醇：冰醋酸＝3:1混勻，制作成涂片，用HE染色后，用Image Pro plus 5軟件進行分析，得出核質(zhì)比，并將檢測加過在表1中列出。其中實施例與對比例采用t檢驗，以α＝0.05為檢驗水準(zhǔn)，采用SPSS17.0數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，計量資料用均數(shù)(x±s)表示，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。
實施例2：一種干細(xì)胞培養(yǎng)體系的培養(yǎng)方法，與實施例1的不同之處在于，完全培養(yǎng)基成分按照以下表1的成分配置，并進行細(xì)胞凋亡率和核質(zhì)比檢測后將結(jié)果在表1中列出。
實施例3：一種干細(xì)胞培養(yǎng)體系的培養(yǎng)方法，與實施例1的不同之處在于，完全培養(yǎng)基成分按照以下表1的成分配置，并進行細(xì)胞凋亡率和核質(zhì)比檢測后將結(jié)果在表1中列出。
實施例4：一種干細(xì)胞培養(yǎng)體系的培養(yǎng)方法，與實施例1的不同之處在于，完全培養(yǎng)基成分按照以下表1的成分配置，并進行細(xì)胞凋亡率和核質(zhì)比檢測后將結(jié)果在表1中列出。
實施例5：一種干細(xì)胞培養(yǎng)體系的培養(yǎng)方法，與實施例1的不同之處在于，完全培養(yǎng)基成分按照以下表1的成分配置，并進行細(xì)胞凋亡率和核質(zhì)比檢測后將結(jié)果在表1中列出。
實施例6：一種干細(xì)胞培養(yǎng)體系的培養(yǎng)方法，與實施例1的不同之處在于，完全培養(yǎng)基成分按照以下表1的成分配置，并進行細(xì)胞凋亡率和核質(zhì)比檢測后將結(jié)果在表1中列出。
對比例1：一種干細(xì)胞培養(yǎng)體系的培養(yǎng)方法，與實施例1的不同之處在于，完全培養(yǎng)基成分按照以下表1的成分配置，采用現(xiàn)有二維技術(shù)進行培養(yǎng)，不加入Matrigel，并進行細(xì)胞凋亡率和核質(zhì)比檢測后將結(jié)果在表1中列出。
對比例2：一種干細(xì)胞培養(yǎng)體系的培養(yǎng)方法，與實施例1的不同之處在于，完全培養(yǎng)基成分按照以下表1的成分配置，并進行細(xì)胞凋亡率和核質(zhì)比檢測后將結(jié)果在表1中列出。
對比例3：一種干細(xì)胞培養(yǎng)體系的培養(yǎng)方法，與實施例1的不同之處在于，完全培養(yǎng)基成分按照以下表1的成分配置，制備飼養(yǎng)層細(xì)胞，并進行細(xì)胞凋亡率和核質(zhì)比檢測后將結(jié)果在表1中列出。
對比例4：一種干細(xì)胞培養(yǎng)體系的培養(yǎng)方法，與實施例1的不同之處在于，完全培養(yǎng)基成分按照以下表1的成分配置，并進行細(xì)胞凋亡率和核質(zhì)比檢測后將結(jié)果在表1中列出。
對比例5：一種干細(xì)胞培養(yǎng)體系的培養(yǎng)方法，與實施例1的不同之處在于，完全培養(yǎng)基成分按照以下表1的成分配置，并進行細(xì)胞凋亡率和核質(zhì)比檢測后將結(jié)果在表1中列出。
表1