本發(fā)明涉及體外組織細(xì)胞分離
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種快速高效分離軟骨細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
：軟骨是由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成的無血管組織，軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細(xì)胞類型，其主要功能是通過分泌II型膠原(typeIIcollagen)及蛋白多糖(aggrecan，Acan)等保持關(guān)節(jié)軟骨的功能。在正常生理?xiàng)l件下，軟骨細(xì)胞的合成和分解代謝維持著動(dòng)態(tài)平衡；而軟骨細(xì)胞主要依靠關(guān)節(jié)的運(yùn)動(dòng)和擠壓吸收營養(yǎng)物質(zhì)，所以軟骨損傷后自我修復(fù)能力比較弱，其損傷后的修復(fù)一直以來都是醫(yī)學(xué)界的難題之一。近來年隨著組織工程技術(shù)和新型生物材料的出現(xiàn)，自體軟骨細(xì)胞移植在治療軟骨損傷在國內(nèi)外都有相關(guān)應(yīng)用。臨床上，軟骨組織材料不足，軟骨細(xì)胞量有限，且培養(yǎng)增值能力不足限制了其發(fā)展。針對(duì)軟骨組織材料的不足，從有限的軟骨組織中提取足夠量及活性高的軟骨細(xì)胞成為后續(xù)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵。目前，軟骨細(xì)胞分離方法較為常見的是通過Ⅱ型膠原酶消化法來進(jìn)行獲取，但是該方法存在較多的缺點(diǎn)，主要包括：(1)Ⅱ型膠原酶雖然屬于溫性消化酶，但是依然存在對(duì)細(xì)胞的損傷作用，特別在消化過度的時(shí)候，對(duì)細(xì)胞的損傷十分明顯；(2)Ⅱ型膠原酶易受溫度、PH、其他蛋白酶等方面的影響而發(fā)生變性，所以Ⅱ型膠原酶在使用的過程中極易出現(xiàn)活性喪失，降低消化作用，嚴(yán)重的將導(dǎo)致無法實(shí)現(xiàn)對(duì)軟骨細(xì)胞的消化分離。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種快速高效分離軟骨細(xì)胞的方法，通過添加相關(guān)保護(hù)劑，緩沖其他外源性蛋白酶對(duì)Ⅱ型膠原酶的分解作用，保證Ⅱ型膠原酶活性，同時(shí)對(duì)軟骨細(xì)胞起到良好的保護(hù)作用，有效防止其在消化過程中受到損傷，有利于得到數(shù)量更多、活性更高的軟骨原代細(xì)胞。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)該目的：一種快速高效分離軟骨細(xì)胞的方法，包括如下步驟：a、獲取軟骨組織樣本；b、將獲取的軟骨組織樣本用加入雙抗的PBS清洗后轉(zhuǎn)入容器中；c、向軟骨組織樣本中加入少量的Ⅱ型膠原酶溶液，用手術(shù)剪將軟骨組織樣本剪碎；d、向軟骨組織樣本中加入一定量Ⅱ型膠原酶溶液，同時(shí)加入人血白蛋白，置于37℃搖床上以100～200rpm的轉(zhuǎn)速消化30-120min；e、向軟骨組織樣本中添加氨磷汀溶液，繼續(xù)置于37℃搖床上以100～200rpm的轉(zhuǎn)速消化2-4h；f、收集消化液，經(jīng)篩網(wǎng)過濾后，濾液再經(jīng)離心沉淀后得到軟骨細(xì)胞。其中，所述步驟a獲取的軟骨組織樣本保存在入雙抗的PBS中。作為優(yōu)選的，所述步驟b中對(duì)軟骨組織樣本清洗2～3遍后轉(zhuǎn)入以50mL燒杯中。其中，所述步驟c具體為：向軟骨組織樣本中加入1～2mL的Ⅱ型膠原酶溶液，用手術(shù)剪將軟骨組織樣本剪碎至1mm3。作為優(yōu)選的，所述步驟d中Ⅱ型膠原酶溶液的加入量為軟骨組織樣本體積的5～10倍，人血白蛋白的加入量為軟骨組織樣本和Ⅱ型膠原酶溶液體積之和的0.5～2％。作為優(yōu)選的，所述步驟e中氨磷汀溶液的加入量為軟骨組織樣本和Ⅱ型膠原酶溶液體積之和的2～5％。作為優(yōu)選的，所述步驟f具體為：將收集的消化液經(jīng)200目的篩網(wǎng)過濾，濾液再經(jīng)200～400g離心沉淀，得到軟骨細(xì)胞。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明的快速高效分離軟骨細(xì)胞的方法，通過在消化前期添加人血白蛋白，緩沖其他外源性蛋白酶對(duì)Ⅱ型膠原酶的分解作用，保證Ⅱ型膠原酶不受損傷及具有較高的活性；在消化后期進(jìn)一步添加氨磷汀溶液，對(duì)軟骨細(xì)胞起到良好的保護(hù)作用，有效防止其在消化過程中受到損傷，有利于得到數(shù)量更多、活性更高的軟骨原代細(xì)胞。附圖說明圖1為對(duì)比例1的細(xì)胞形態(tài)圖。圖2為對(duì)比例2的細(xì)胞形態(tài)圖。圖3為實(shí)施例1的細(xì)胞形態(tài)圖。圖4為實(shí)施例2的細(xì)胞形態(tài)圖。圖5為實(shí)施例3的細(xì)胞形態(tài)圖。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。實(shí)施例1。一種快速高效分離軟骨細(xì)胞的方法，包括如下步驟：獲取10g軟骨組織樣本，向其中添加1mLⅡ型膠原酶，用加入雙抗的PBS清洗后剪碎至1mm3，然后加入軟骨組織樣本5倍體積的Ⅱ型膠原酶置于37℃搖床，同時(shí)添加0.5％人血白蛋白，以100rpm轉(zhuǎn)速消化30min；然后添加3％的氨磷汀溶液，繼續(xù)以100rpm轉(zhuǎn)速消化4h；消化后200目濾網(wǎng)過濾，離心沉淀，收集軟骨細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)施例2。一種快速高效分離軟骨細(xì)胞的方法，包括如下步驟：獲取10g軟骨組織樣本，向其中添加1.5mLⅡ型膠原酶，用加入雙抗的PBS清洗后剪碎至1mm3，然后加入軟骨組織樣本8倍體積的Ⅱ型膠原酶置于37℃搖床，同時(shí)添加2％人血白蛋白，以150rpm轉(zhuǎn)速消化100min；然后添加2％的氨磷汀溶液，繼續(xù)以100rpm轉(zhuǎn)速消化2h；消化后200目濾網(wǎng)過濾，離心沉淀，收集軟骨細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)施例3。一種快速高效分離軟骨細(xì)胞的方法，包括如下步驟：獲取10g軟骨組織樣本，向其中添加2mLⅡ型膠原酶，用加入雙抗的PBS清洗后剪碎至1mm3，然后加入軟骨組織樣本10倍體積的Ⅱ型膠原酶置于37℃搖床，同時(shí)添加1％人血白蛋白，以200rpm轉(zhuǎn)速消化80min；然后添加5％的氨磷汀溶液，繼續(xù)以100rpm轉(zhuǎn)速消化3h；消化后200目濾網(wǎng)過濾，離心沉淀，收集軟骨細(xì)胞計(jì)數(shù)。對(duì)比例1。獲取10g軟骨組織樣本，向其中添加1mLⅡ型膠原酶，用加入雙抗的PBS清洗后剪碎至1mm3，然后加入Ⅱ型膠原酶后置于4℃環(huán)境下消化12h，消化后200目濾網(wǎng)過濾，離心沉淀，收集軟骨細(xì)胞計(jì)數(shù)。對(duì)比例2。獲取10g軟骨組織樣本，向其中添加1mLⅡ型膠原酶，用加入雙抗的PBS清洗后剪碎至1mm3，然后加入Ⅱ型膠原酶后置于37℃搖床，以150rpm轉(zhuǎn)速消化4h，消化后200目濾網(wǎng)過濾，離心沉淀，收集軟骨細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)施例1～3及對(duì)比例1～2的軟骨細(xì)胞計(jì)數(shù)及活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示：表1細(xì)胞計(jì)數(shù)及活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析：由表1的數(shù)據(jù)可知，與采用常規(guī)分離方法的對(duì)比例1、2相比，采用本發(fā)明分離方法的實(shí)施例1～3獲得的原代軟骨細(xì)胞的數(shù)量及活率均明顯高于常規(guī)分離方法，說明本發(fā)明的快速高效分離軟骨細(xì)胞的方法，通過添加相關(guān)保護(hù)劑，緩沖其他外源性蛋白酶對(duì)Ⅱ型膠原酶的分解作用，保證Ⅱ型膠原酶活性，同時(shí)對(duì)軟骨細(xì)胞起到良好的保護(hù)作用，有效防止其在消化過程中受到損傷，有利于得到數(shù)量更多、活性更高的軟骨原代細(xì)胞。分別對(duì)實(shí)施例1～3以及對(duì)比例1～2獲得的軟骨細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證：對(duì)以上5組分離的原代軟骨細(xì)胞，各取1*106個(gè)細(xì)胞，加入含10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基接種于培養(yǎng)皿，接種密度1*105/mL；接種后每3天換液一次，長滿80％進(jìn)行傳代培養(yǎng)，分別觀察第10天(P2代)細(xì)胞形態(tài)及計(jì)數(shù)總細(xì)胞量。實(shí)施例1～3及對(duì)比例1～2培養(yǎng)后的軟骨細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示，各組的培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)如圖1～5所示：表2培養(yǎng)后細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)組別細(xì)胞量(106)對(duì)比例16.228對(duì)比例26.437實(shí)施例110.672實(shí)施例211.028實(shí)施例310.825結(jié)果分析：由表2的數(shù)據(jù)可知，實(shí)施例1～3的細(xì)胞增殖速度明顯快于對(duì)比例1、2，且由細(xì)胞形態(tài)圖1～5所示，實(shí)施例1～3的細(xì)胞形態(tài)良好，說明采用本發(fā)明的方法分離獲得的原代軟骨細(xì)胞增殖能力和增殖后細(xì)胞狀態(tài)明顯優(yōu)于現(xiàn)有方法。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁1 2 3