一種高活力原代軟骨細(xì)胞的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種原代軟骨細(xì)胞的制備方法，尤其涉及一種高活力原代軟骨細(xì)胞的 制備方法，該方法可以顯著提高軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng)的效率。
【背景技術(shù)】
[0002] 原代軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)一般經(jīng)過(guò)3-4次傳代擴(kuò)增后，細(xì)胞形態(tài)逐漸變的肥大， 軟骨細(xì)胞特異性基因如II型膠原和蛋白多聚糖等表達(dá)丟失，這些都不利于科研研宄需要。 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠，通常取傳代1-2次的細(xì)胞，這就需要大量軟骨細(xì)胞。
[0003] 傳統(tǒng)的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法，一般包括如下步驟：
[0004] 出生24小時(shí)內(nèi)的幼鼠，取四肢關(guān)節(jié)處軟骨，PBS清洗干凈，眼科剪刀剪碎，加5ml的 0. 1 % II型膠原酶于37°C消化1-1. 5小時(shí)，取上清后，1000 rpm離心10分鐘沉淀上清液中的 細(xì)胞，組織沉淀再加5ml的0. 1 % II型膠原酶消化1-1. 5小時(shí)，重復(fù)此過(guò)程至少4-5次。細(xì) 胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37°C，5% 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0005] 目前原代培養(yǎng)過(guò)程中，原代軟骨細(xì)胞不易從軟骨基質(zhì)上脫落下來(lái)，造成得率不高 的問(wèn)題，因此亟需研發(fā)一種提高原代軟骨細(xì)胞得率的培養(yǎng)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種高活力原代軟骨細(xì)胞的制備方法，為克服現(xiàn) 有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)改進(jìn)關(guān)鍵的培養(yǎng)步驟，得到大量的軟骨細(xì)胞。通過(guò)提高軟骨 細(xì)胞原代培養(yǎng)的得率，顯著減少基礎(chǔ)科研中所需的動(dòng)物及提高臨床人體軟骨標(biāo)本的使用效 率，為研宄骨關(guān)節(jié)炎的研宄奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，提高科研效率。
[0007] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種高活力原代軟骨細(xì)胞的制備方法，包括如 下步驟：
[0008] 步驟1，取幼鼠四肢關(guān)節(jié)處軟骨，剔除干凈軟組織，剩余透明的軟骨組織，放入盛有 PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中，清洗數(shù)次，直至殘留的血液漂洗干凈；
[0009] 步驟2,加入0. 1 %質(zhì)量分?jǐn)?shù)的II型膠原酶保持組織在切割過(guò)程中的濕潤(rùn)，采用手 術(shù)專用的刀片進(jìn)行軟骨組織切碎；
[0010] 步驟3,用0. 1%的II型膠原酶加入切碎的軟骨組織中，移入無(wú)菌離心管中，置于 恒溫?fù)u床中搖動(dòng)；置于離心機(jī)中1500-2000rpm，離心10-15min，棄去上清液，留下細(xì)胞沉 淀，加入0. 1 %的II型膠原酶繼續(xù)放置搖床中消化，用Iml槍頭吹打數(shù)次后，軟骨細(xì)胞從軟 骨基質(zhì)上脫離下來(lái)，置于離心機(jī)中1500-2000rpm，離心10-15min，留取軟骨細(xì)胞沉淀；
[0011] 步驟4,將軟骨細(xì)胞沉淀種植于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基 中，得到高活力原代軟骨細(xì)胞。
[0012] 作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟2中，所述采用手術(shù)專用的刀片進(jìn)行軟骨組織 切碎需要5min。
[0013] 作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟3中，所述置于恒溫?fù)u床中搖動(dòng)具體為：置于 37°C的150rpm恒溫?fù)u床中，搖動(dòng)3小時(shí)吹打一次。
[0014] 作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟3中，所述加入0. 1%的II型膠原酶繼續(xù)放置搖 床中消化具體為消化1小時(shí)。
[0015] 作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟3中，步驟3中，所述用Iml槍頭吹打10-20次， 直至看不到組織團(tuán)塊為止。
[0016] 作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟4中，所述將軟骨細(xì)胞沉淀種植于培養(yǎng)皿中，細(xì) 胞密度為70% -80%。
[0017] 作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟4中，將軟骨細(xì)胞沉淀種植于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)于 含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，1小時(shí)后細(xì)胞進(jìn)行換液和拍照，光鏡下，見(jiàn)細(xì)胞均貼壁， 細(xì)胞呈短棒形。
[0018] 步驟3中，所述離心機(jī)可以是水平離心機(jī)或垂直離心機(jī)，優(yōu)選水平離心機(jī)。
[0019] 在本發(fā)明中，所述"原代軟骨細(xì)胞"是指直接從出生24小時(shí)的幼鼠四肢關(guān)節(jié)提取 和培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞。
[0020] 所述"含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基"是指90ml的DMEM高糖培養(yǎng)基加 IOml的 胎牛血清（FBS)。
[0021] 所述"手術(shù)專用的刀片"是指帶有刀柄的那種可裝卸的一次性無(wú)菌刀片。
[0022] 所述"PBS緩沖液"是指磷酸鹽緩沖液，用于細(xì)胞傳代或原代制備時(shí)的一種緩沖液。
[0023] 和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明主要在于軟骨組織塊的剪碎 和離心速度上進(jìn)行改進(jìn)，同時(shí)最后增加了 Iml槍頭吹打的步驟。在操作中發(fā)現(xiàn)團(tuán)塊的大小 對(duì)膠原酶消化的程度有很大差異，通過(guò)手術(shù)刀片可迅速的剪碎組織，使組織塊盡可能小，利 于酶的消化，縮短了在酶中消化的時(shí)間，避免酶對(duì)細(xì)胞的損傷。同時(shí)既往研宄中，一般用 1000 rpm的速度離心軟骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞由于消化后，在一定較高濃度的軟骨基質(zhì)中，常規(guī) 的離心方法不容易沉淀軟骨細(xì)胞，通過(guò)增加離心速度（將離心速度提高至1500-2000rpm)， 使離心速度在合適大小，又不至于破壞軟骨細(xì)胞，從而提高軟骨細(xì)胞的得率，同時(shí)保持軟骨 細(xì)胞的活力。最后增加槍頭吹打的環(huán)節(jié)，使軟骨細(xì)胞進(jìn)一步從附著的軟骨基質(zhì)上脫離下來(lái)。
[0024] 與傳統(tǒng)的軟骨細(xì)胞提取方法相比，本發(fā)明方法在時(shí)間上縮短一半，在軟骨細(xì)胞的 得率上提高至少提高了 10倍（參見(jiàn)本發(fā)明實(shí)施例4的表1)，且經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所得軟骨細(xì)胞有 良好的增殖率和細(xì)胞形態(tài)。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中制得的原代軟骨細(xì)胞的光鏡示意圖。
[0026] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中制得的原代軟骨細(xì)胞的增殖曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0028] 實(shí)施例1
[0029] 1.出生24h，雌雄不限幼鼠6只，取其四肢關(guān)節(jié)處軟骨，盡量剔除干凈軟組織，剩余 透明的軟骨組織，放入盛有PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中，清洗數(shù)次，直至殘留的血液漂洗干凈。 PBS緩沖液的制備：PBS片劑購(gòu)自于Biowest公司，將PBS片劑直接溶于水獲得PBS緩沖液。
[0030] 2.加入少量（約11111)0.1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的11型膠原酶（06885,518111&-41(11^11)保持 組織在切割過(guò)程中的濕潤(rùn)，由于軟骨組織富有彈性，且來(lái)源于幼鼠，組織塊比較小，一般的 眼科剪，剪碎時(shí)容易滑脫，也不容易剪碎，直接影響膠原酶消化的程度，最終影響軟骨細(xì)胞 的得率。本發(fā)明則采用手術(shù)專用的刀片（購(gòu)自上海醫(yī)療器械（集團(tuán)）有限公司）進(jìn)行樣品 切碎，由于刀片鋒利，明顯比剪刀易于切碎，一般此過(guò)程需要5min，大大縮短此過(guò)程所需時(shí) 間。0. 1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的II型膠原酶的制備：稱量0.1 g的市場(chǎng)購(gòu)買的II型膠原酶粉末溶解于 100ml PBS溶液中。
[0031] 3.剪碎后，用0. 1 %的II型膠原酶加入切碎的軟骨組織中，移入50ml無(wú)菌離心 管中，置于37°C的150rpm恒溫?fù)u床中，搖動(dòng)3小時(shí)左右，吹打一次。置于水平離心機(jī)中 1500rpm，離心10min，棄去上清液，留下細(xì)胞沉淀，加入0. 1 %的II型膠原酶繼續(xù)放置搖床 中，消化1小時(shí)，用Iml槍頭吹打10次后，軟骨細(xì)胞從軟骨基質(zhì)上脫離下來(lái)，置于水平離心 機(jī)中1500rpm，離心15min，留取軟骨細(xì)胞沉淀。
[0032] 4.將軟骨細(xì)胞沉淀分別種植于6-8個(gè)IOcm直徑的培養(yǎng)皿，約70% -80%的密度， 培養(yǎng)于含10% FBS (胎牛血清）的DMEM高糖培養(yǎng)基（FBS為胎牛血清，購(gòu)自Biowest公司， DMEM高糖培養(yǎng)基也購(gòu)自Biowest公司）中，約1小時(shí)后，細(xì)胞進(jìn)行換液和拍照。光鏡下，可 見(jiàn)細(xì)胞均貼壁，細(xì)胞呈短棒形，約70% -80%的細(xì)胞密度（見(jiàn)圖1)。對(duì)提取的細(xì)胞進(jìn)行增殖 檢測(cè)，按照2000個(gè)細(xì)胞/孔的密度種植于96孔板中，于檢測(cè)第一天至第七天的490處的吸 光度值，從圖2所示的增殖曲線看，可以看出，隨著時(shí)間推后，0D490值逐漸增大，提示軟骨 細(xì)胞在不斷增殖。進(jìn)一步表明，通過(guò)此方法提取的軟骨細(xì)胞具備增殖能力。
[0033] 實(shí)施例2
[0034] 1.出生24h，雌雄不限幼鼠6只，取其四肢關(guān)節(jié)處軟骨，盡量剔除干凈軟組織，剩余 透明的軟骨組織，放入盛有PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中，清洗數(shù)次，直至殘留的血液漂洗干凈。 PBS緩沖液的制備：PBS片劑購(gòu)自