lncRNAs篩選方法、ADSCs、軟骨細胞誘導(dǎo)分化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的涉及一種IncRNAs篩選方法、存在差異表達的 ADSCs所含的IncRNAs、高軟骨分化能力的ADSCs、軟骨細胞的誘導(dǎo)分化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 關(guān)節(jié)軟骨的損傷和病變是臨床常見疾病，可以發(fā)生于任何年齡和性別。由于關(guān)節(jié) 軟骨組織缺少血管系統(tǒng)，淋巴系統(tǒng)和神經(jīng)支配，本身不含祖細胞，軟骨細胞又被包圍在致密 細胞基質(zhì)中，組織損傷后自行修復(fù)能力很差，一旦發(fā)生損傷，會導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫脹和疼痛，加速 骨關(guān)節(jié)炎的進展。
[0003]目前，臨床上的關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)方法主要有軟骨清理成形術(shù)、軟骨下鉆空術(shù) 等關(guān)節(jié)表面重建方法，以及骨膜移植等生物治療方法。它們對延緩關(guān)節(jié)退化和修復(fù)關(guān)節(jié)一 定功能具有重要作用，但修復(fù)后的軟骨組織無論在生物學(xué)還是在生物力學(xué)上均與原來的軟 骨有所不同，并易發(fā)生軟化退變，導(dǎo)致療效下降。近年來隨著細胞培養(yǎng)技術(shù)、移植技術(shù)及生 物材料科學(xué)的發(fā)展，組織工程學(xué)得到了迅速發(fā)展，為修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損提供了一個新的治 療途徑。軟骨組織工程技術(shù)是在體外培養(yǎng)、擴增軟骨種子細胞，并且以較高濃度將其種植于 具有良好的生物相容性和降解性的支架材料上構(gòu)建組織工程軟骨，然后植入到組織缺損部 位，完成組織的修復(fù)和重建。
[0004] 種子細胞是軟骨組織工程學(xué)中的基本要素之一也是首要環(huán)節(jié)，選擇理想的種子細 胞是組織工程學(xué)中的關(guān)鍵。理想的種子細胞需具備以下條件：①來源廣泛、取材方便、對機 體損傷少。②在體外培養(yǎng)中具有較強的增殖傳代能力、保持良好的生物學(xué)活性和表型表達 穩(wěn)定。③植入體內(nèi)能耐受機體免疫、高質(zhì)量地修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損并能保持良好的遠期療效。 目前用于軟骨組織工程的種子細胞主要有軟骨細胞、胚胎干細胞以及間充質(zhì)干細胞等。
[0005] 軟骨細胞由于增殖能力較低，體外培養(yǎng)擴增困難且極易發(fā)生去分化現(xiàn)象，限制了 其在臨床上的應(yīng)用。
[0006] 胚胎干細胞雖然具有高度的分化潛能，體外能誘導(dǎo)分化成軟骨細胞，但是將胚胎 干細胞應(yīng)用于軟骨組織工程需要解決如下問題：①保證足夠細胞數(shù)目和細胞活性的同時防 止其致瘤性。②影響胚胎干細胞分化的條件，提高定向分化效率以及分化可控性。③胚胎 干細胞衍生物移植導(dǎo)致的免疫排斥。④胚胎干細胞的臨床應(yīng)用所面臨的倫理學(xué)問題。
[0007] 間充質(zhì)干細胞是具有向多種細胞系分化潛能的間充質(zhì)前體細胞，與其它來源間充 質(zhì)干細胞相比，脂肪來源間充質(zhì)干細胞（ADSCs)具有以下優(yōu)點：①不涉及倫理問題；②取材 方便，來源充足，通過抽脂術(shù)即可大量獲取，對供區(qū)影響小，并發(fā)癥少；③分離培養(yǎng)簡單，容 易獲得，可在體外大量快速增殖；④在一系列誘導(dǎo)因子作用下可定向分化為軟骨細胞；⑤ 免疫原性低，組織相容性好，能適應(yīng)體內(nèi)環(huán)境，ADSCs生成的軟骨可以避免免疫排斥反應(yīng)。
[0008] ADSCs在體外需要經(jīng)過誘導(dǎo)才能分化為軟骨細胞。這種誘導(dǎo)包括添加許多不同的 生長因子、分化因子、激素和細胞因子。主要的有轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-βΙ，TGF-0 3)，胰島 素樣生長因子（IGF-I)，地塞米松，骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族（BMPs)等。ADSCs向軟骨細胞分化 過程中的細胞內(nèi)的作用機制目前還不是很清楚。目前ADSCs體外成軟骨誘導(dǎo)分化方法還有 許多需要完善的地方，主要缺點有：體外誘導(dǎo)分化時間長；誘導(dǎo)分化獲得的軟骨細胞成熟 度不高。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)出快速、高效地誘導(dǎo)脂肪干細胞成軟骨分化的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種IncRNAs篩選方法、存在 差異表達的ADSCs所含的IncRNAs和高軟骨分化能力的ADSCs。以克服現(xiàn)有體外定向誘導(dǎo) 分化成軟骨細胞方法存在誘導(dǎo)分化時間長，獲得的軟骨細胞成熟度不高的缺陷。
[0010] 本發(fā)明另一目的在于提供一種軟骨細胞的誘導(dǎo)分化方法，以克服現(xiàn)有體外定向誘 導(dǎo)分化成軟骨細胞方法存在誘導(dǎo)分化時間長，獲得的軟骨細胞成熟度不高的缺陷。
[0011] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，作為本發(fā)明的一個方面，提供了一種IncRNAs篩選方法， 包括如下步驟：
[0012] 將ADSCs進行定向誘導(dǎo)分化成軟骨細胞處理，并分別取樣所述定向誘導(dǎo)分化第X 天、Y天、Z天的細胞；其中，X < Y < Z，且X彡0 ;
[0013] 利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)RNA-seq深度測序技術(shù)分別對所述定向誘導(dǎo)分化第X天、Y天、Z天 的所述細胞和成熟軟骨細胞進行IncRNAs測序；
[0014] 利用生物信息學(xué)分析方法對所述IncRNAs測序的結(jié)果進行分析，篩選出ADSCs與 成熟軟骨細胞存在差異表達的IncRNAs。
[0015] 作為本發(fā)明的另一方面，提供了一種ADSCs所含的IncRNAs，所述IncRNAs為H19、 Scube3、N0NRATG00281 中的至少一種。
[0016] 作為本發(fā)明的再一方面，提供了一種高軟骨分化能力的ADSCs。所述ADSCs含有 IncRNAs，且所述IncRNAs是由本發(fā)明IncRNAs篩選方法篩選出存在差異表達的IncRNAs或 為本發(fā)明所述的ADSCs所含的IncRNAs ;
[0017] 其中，所述存在差異表達的IncRNAs為H19、Scube3、N0NRATG00281中的至少一種。
[0018] 作為本發(fā)明的又一方面，提供了一種軟骨細胞的誘導(dǎo)分化方法，包括對本發(fā)明高 軟骨分化能力的ADSCs進行成軟骨分化的步驟。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明IncRNAs篩選方法采用RNA高通量測序和生物信息學(xué)方 法能有效篩選出ADSCs與成熟軟骨細胞存在差異表達的特定IncRNAs，以便被作為基因修 飾的研究目標(biāo)，為獲得具有高軟骨分化能力的ADSCs提供了基礎(chǔ)。
[0020] 本發(fā)明 ADSCs 所含的 IncRNAs 為 H19、Scube3、N0NRATG00281 中的至少一種，優(yōu)選 為H19。因此，采用其修飾其他該ADSCs，能獲得具有高軟骨分化能力的ADSCs，使得被修飾 后的ADSCs具有快速高效的分化成軟骨細胞，使得誘導(dǎo)分化獲得的軟骨細胞成熟度高。
[0021] 本發(fā)明高軟骨分化能力的ADSCs由于被本發(fā)明IncRNAs篩選方法篩選出的存在差 異表達的IncRNAs或者直接采用本發(fā)明ADSCs所含的IncRNAs修飾，因此，其能在體外快 速、高效地分化成軟骨細胞，使得誘導(dǎo)分化獲得的軟骨細胞成熟度高。
[0022] 本發(fā)明軟骨細胞的誘導(dǎo)分化方法是以上述本發(fā)明高軟骨分化能力的ADSCs為基 礎(chǔ)進行誘導(dǎo)分化，從而有效提高了其誘導(dǎo)分化成軟骨細胞的速率，并提高了分化獲得的軟 骨細胞成熟度高。
【附圖說明】
[0023] 圖1為發(fā)明實施例將ADSCs成軟骨誘導(dǎo)第0、3、7天的樣本層次聚類分析及熱圖繪 制；
[0024] 圖2為發(fā)明實施例篩選出的3個IncRNA在誘導(dǎo)第0天、3天、7天的差異表達；
[0025] 圖3為本發(fā)明實施例將篩選出的含lncRNA-H19的ADSCs在功能缺失性研究中成 軟骨誘導(dǎo)分化第7天的阿爾辛藍染色結(jié)果；其中，圖a.對照ADSCs ;圖b. RNAiH19-ADSCs ;
[0026] 圖4為本發(fā)明實施例將篩選出的含lncRNA-H19的ADSCs在功能缺失性研究中成 軟骨誘導(dǎo)分化第7天細胞表面II型膠原表達百分比；
[0027] 圖5為本發(fā)明實施例將篩選出的含lncRNA-H19的ADSCs在功能獲得性研究中成 軟骨誘導(dǎo)分化第7天的阿爾辛藍染色結(jié)果；其中，圖a.對照ADSCs ;圖b. H19-ADSCs ;
[0028] 圖6為本發(fā)明實施例將篩選出的含lncRNA-H19的ADSCs在功能缺失性研究中成 軟骨誘導(dǎo)分化第7天細胞表面II型膠原表達百分比。
【具體實施方式】
[0029] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對 本發(fā)明作進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不 用于限定本發(fā)明。
[0030] -方面，本發(fā)明實施例提供了一種IncRNAs篩選方法，包括如下步驟：
[0031] 步驟SOl :將ADSCs進行定向誘導(dǎo)分化成軟骨細胞處理，并分別取樣所述定向誘導(dǎo) 分化第X天、Y天、Z天的細胞；其中，X < Y < Z，且X彡0 ;