一種體外膠質(zhì)疤痕形成模型及其構(gòu)建方法與應用
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于細胞生物學的技術(shù)領域，具體涉及一種可以在體外模擬中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后膠質(zhì)疤痕形成的模型及其構(gòu)建方法，為膠質(zhì)疤痕形成的機制研宄及相關(guān)治療研宄提供體外細胞水平的實驗模型。
【背景技術(shù)】
[0002]中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時，會引起靜止的星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變成反應性星形膠質(zhì)細胞，并圍繞損傷部位伸出星狀粗大突起；同時，腦(脊)膜纖維細胞也會迀移到損傷處，分布在損傷組織與反應性星形膠質(zhì)細胞之間，排列緊密；反應性星形膠質(zhì)細胞會向腦(脊)膜纖維細胞伸出指狀突起，彼此結(jié)合；兩種細胞共同分泌并形成特殊的細胞外基質(zhì)，細胞及細胞外基質(zhì)共同形成較為致密的癥痕組織(Shearer MC, Fawcett JW.The astrocyte/meningeal cell interface—a barrier to successful nerve regenerat1n ? CellTissue Res.2001 ;305:267-273.)。疤痕組織封閉損傷組織，使其與正常組織隔離(Sofroniew MV.Molecular dissect1n of reactive astrogl1sis and glial scarformat1n.Trends Neurosc1.2009 ;32:638-647.Voskuhl RRj Peterson RS，Song B，AoY，Morales LBj Tiwar1-Woodruff Sj Sofroniew MV.Reactive astrocytes form scar-likeperivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammat1n of theCNS J Neurosc1.2009 ；29:11511-11522.)0
[0003]疤痕組織一般分膠質(zhì)疤痕和纖維疤痕兩種，前者為主，后者為輔；其中，膠質(zhì)疤痕中含有硫酸軟骨素蛋白聚糖、結(jié)合腕蛋白等具有抑制軸突再生的物質(zhì)(Sandvig A, BerryM，Barrett LBj Butt A,Logan A.Myelin-, reactive glia-, and scar-derived CNS axongrowth inhibitors:Express1n, receptor signaling, and correlat1n with axonregenerat1n.Glia.2004 ;46:225-251.);纖維痕痕中致密的IV型膠原，及纖維結(jié)合蛋白和層粘連蛋白等結(jié)構(gòu)可以成為軸突再生的陷講(Klapka N, Muller HW.Collagen matrixin spinal cord injury.J Neurotrauma2006 ；23:422-435.Kawano Hj Kimura-KurodaJ，Komuta Y，Yosh1ka N，Li HP, Kawamura K，Li Y，Raisman G.Role of the les1n scarin the response to damage and repair of the central nervous system.Cell TissueRes.2012;349:169-180.)。
[0004]膠質(zhì)疤痕雖然能對因損傷而導致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)開放性創(chuàng)面及時封閉，但同時也因此界面的出現(xiàn)而關(guān)閉了軸突生長的通道，起到阻礙軸突再生的負面效果(Li Y，LiD，Ibrahim A，Raisman G.Repair involves all three surfaces of the glial cell.Prog Brain Res.2012 ;201:199-218.)。正是這些不利因素協(xié)同作用致使損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)難以組織修復和功能重建，造成患者終生殘疾，給個人、家庭及整個社會帶來沉重的經(jīng)濟和精神負擔。當然，治療中過度抑制膠質(zhì)疤痕的形成，也會對炎癥的限制和神經(jīng)元的生存，造成不利影響(Okada S，Nakamura Mj Katoh H, Miyao Tj Shimazaki Tj Ishii K，YamaneJjYoshimura A, Iwamoto Y，Toyama Y，Okano H.Condit1nal ablat1n of Stat3orSocs3discloses a dual role for reactive astrocytes after spinal cord injury.Nat Med.2006 ； 12:829-834.Herrmann JEj Imura T，Song B，Qi J，Ao Yj Nguyen TKj KorsakRA,Takeda K，Akira Sj Sofroniew MV.STAT3is a critical regulator of astrogl1sisand scar format1n after spinal cord injury.J Neurosc1.2008 ;28:7231-7243.) 0 以上這些研究結(jié)果，僅是人們對膠質(zhì)疤痕作用的膚淺認識，從中可看出膠質(zhì)疤痕并不能簡單的進行好、壞分類，還需要對此進行更深入的探究(Sofroniew MV.Molecular dissect1nof reactive astrogl1sis and glial scar format1n.Trends Neurosc1.2009 ；32:638-647.)。
[0005]研究膠質(zhì)疤痕形成的機制、或?qū)ふ抑委熌z質(zhì)疤痕過度增生的靶點，除了在動物體內(nèi)進行直接研究(存在影響因素多且復雜、費用大、動物倫理等問題)外，更簡潔的方式是采取體外研究來模擬膠質(zhì)疤痕形成的過程，了解相關(guān)細胞的細胞生物學變化。到目前為止有如下幾種膠質(zhì)疤痕的培養(yǎng)模型:(一)利用硝酸纖維素片插入皮層，然后將其移出，沾粘于表面的組織進行培養(yǎng)(Rudge JSj Silver J.1nhibit1n of neurite outgrowth onastroglial scars in vitr0.J Neurosc1.1990 ；10:3594-3603.);此方法雖能體外獲得膠質(zhì)疤痕的相應組分，但它并不是通過體外細胞培養(yǎng)形成的結(jié)構(gòu)，所以整個膠質(zhì)疤痕形成的過程無法觀察到。(二)用星形膠質(zhì)細胞與腦(脊)膜纖維細胞直接共同培養(yǎng)，產(chǎn)生類似膠質(zhì)界膜(glial-limiting membrane)的物質(zhì)及相關(guān)效應(Ness Rj David S.Leptomeningealcells modulate the neurite growth promoting properties of astrocytes invitr0.Glia.1997 ； 19:47-57.Struckhoff G.Cocultures of meningeal and astrocyticcells - a model for the format1n of the glial-limiting membrane.1nt J DevNeurosc1.1995 ； 13:595-606.);此方法可以觀察到星形膠質(zhì)細胞的活化過程，但在模擬膠質(zhì)界膜形成過程中，可能更接近神經(jīng)組織正常發(fā)育的過程，并沒有中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損時的相關(guān)因素介入。(三)用3D膠固化膠質(zhì)疤痕的抑制蛋白聚糖等物質(zhì)，觀察對神經(jīng)元等細胞生長的作用(Gilbert RJj McKeon RJj Darr A, Calabro A，Hascall VC，BellamkondaRV.CS-4, 6is differentially upregulated in glial scar and is a potent inhibitorof neurite extens1n.Mol Cell Neurosc1.2005 ；29 (4): 545-58.);但此法并無形成膠質(zhì)疤痕的細胞參與，所以僅是對某種抑制物質(zhì)的作用進行研究。(四)將星形膠質(zhì)細胞和腦(脊)膜纖維細胞在硅橡膠培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，然后通過適當?shù)臋C械拉伸形成細胞創(chuàng)傷，能使星形膠質(zhì)細胞出現(xiàn)星狀和聚集成團，并且膠質(zhì)疤痕的標記物表達明顯增強(Wanner IB, DeikA，Torres M，Rosendahl A,Neary JTj Lemmon VPj Bixby JL.A new in vitro model of theglial scar inhibits axon growth.Glia.2008 ；56:1691-709.);此方法由于要專用的娃橡膠細胞培養(yǎng)皿，其貨源及價格不盡如人意。(五)利用轉(zhuǎn)化生長因子的作