用，使膠質細胞和腦(脊)膜纖維細胞聚集成團及膠質痕痕的特征性標記物出現(xiàn)(Kimura-KurodaJj Teng X，Komuta Y，Yosh1ka N，Sango K, Kawamura K，Raisman Gj Kawano H.An in vitromodel of the inhibit1n of axon growth in the les1n scar formed after centralnervous system injury.Mol Cell Neurosc1.2010 ；43:177-87.);當然這種方法是借助生物活性分子的直接作用而引發(fā)的結果，但在中樞神經系統(tǒng)損傷時，引發(fā)的膠質疤痕形成過程中，生物活性分子水平變化不是先發(fā)因素，而是繼發(fā)的結果，隨后再誘發(fā)膠質疤痕的形成；所以此方法還不能完全再現(xiàn)膠質疤痕形成的整個過程。
[0006]從上述已出現(xiàn)的體外膠質疤痕實驗模型中，可以看出還存在著諸多不足，目前尚無構建成功一種理想的體外膠質疤痕形成模型。作為一個理想的體外膠質疤痕形成模型，首先要能較好的模擬體內膠質疤痕形成的整個過程，有相應種類的細胞參與，并出現(xiàn)相應的膠質疤痕形態(tài)結構及相關細胞生物學與分子生物學的變化；能方便利用此實驗模型，進行神經元生長抑制作用、或其它相關深入試驗的探索；模型制備簡單，膠質疤痕形成過程觀察方便，制備的模型成本合理、材料來源容易等特點。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的在于構建一種體外膠質疤痕形成模型及其構建方法，本發(fā)明的另一目的在于提供該模型在膠質疤痕形成的機制研宄及相關治療藥物篩選中的應用。
[0008]為達到本發(fā)明的目的，克服現(xiàn)有技術的缺陷，本發(fā)明所要解決的技術問題主要有:1.選擇合適種類的細胞，以及細胞之間合適的配比；2.體外培養(yǎng)環(huán)境(體外膠質疤痕形成模型構建基質、載體)；3.培養(yǎng)過程中添加何種細胞因子；4.如何通過適當?shù)臋C械劃痕來形成細胞創(chuàng)傷等。
[0009]為構建一個理想的體外膠質疤痕形成模型，本發(fā)明的主要技術方案如下:
[0010]首先體外利用腦(脊)膜纖維細胞與星形膠質細胞聯(lián)合培養(yǎng)，并在1:1、1:2、2:1、3:4等比例中篩選到最合適的配比(3:4)，這樣的細胞組合優(yōu)點在于形成的膠質疤痕組織更接近體內的實際狀況。
[0011]其次利用腔室載玻片來作為體外培養(yǎng)環(huán)境，可以為隨后的形態(tài)學技術處理及顯微鏡觀察提供方便。
[0012]在培養(yǎng)過程中，不添加轉化生長因子等細胞因子，主要考慮到中樞神經系統(tǒng)受損的主要誘因往往是撞擊等機械性的損傷，隨后才引起β -轉化生長因子的水平升高，所以轉化生長因子并不是膠質疤痕形成的起始因素；但使用了一般細胞在貼壁培養(yǎng)時添加的介質:L-多聚賴氨酸，并對其濃度的效果進行了選擇性比較，表明在10、25、50、75 μ g/ml等濃度范圍內，50 μ g/ml和75 μ g/ml兩種濃度效果均可，從節(jié)約成本的角度出發(fā)，后續(xù)實驗均選用50 μ g/ml的L-多聚賴氨酸。
[0013]最后通過特定的機械劃痕使細胞損傷，從而引起兩種細胞組成細胞團并分泌相應細胞外基質，形成膠質疤痕，達到體外模擬膠質疤痕的細胞水平實驗模型目的。
[0014]本發(fā)明提供了一種體外膠質疤痕形成模型的構建方法，所述的體外膠質疤痕形成模型也稱為類膠質疤痕模型、或體外模擬中樞神經系統(tǒng)損傷后膠質疤痕形成的實驗模型，所述的構建方法包括以下步驟:
[0015]A.將純化后的腦(脊)膜纖維細胞和星形膠質細胞以數(shù)量比為3:4的比例分別種植于腔室載玻片上相鄰的小室內，小室底部的載玻片已預先用50-75 μ g/ml的L-多聚賴氨酸包被，每個小室內為100 μ I?300 μ I (優(yōu)選為200 μ I)的細胞懸液，腦(脊)膜纖維細胞和星形膠質細胞細胞密度為IX1Vml?8X105/ml (優(yōu)選為腦(脊)膜纖維細胞和星形膠質細胞細胞密度分別為6X104/ml和8X104/ml ;或腦(脊)膜纖維細胞和星形膠質細胞細胞密度分別為3 X 105/ml和4XlOVml)；
[0016]B.0.5小時后將小室之間的隔板移除，總量添加5ml含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天以上；
[0017]C.當觀察到腦(脊)膜纖維細胞和星形膠質細胞這兩種細胞相互靠攏時，顯微鏡下用銳器在兩種細胞交界處作機械劃痕，所述的機械劃痕類似“豐”字，換含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)6天以上形成類膠質疤痕的結構。
[0018]本發(fā)明中，細胞懸液，是用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液來稀釋細胞的。
[0019]本發(fā)明中，腔室載玻片，選用是4孔規(guī)格。
[0020]本發(fā)明中，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3?5d左右，可觀察到腦(脊)膜纖維細胞和星形膠質細胞這兩種細胞相互靠攏時，相互靠攏是兩種細胞相互靠近并接觸。
[0021]本發(fā)明中，銳器，較優(yōu)的選用一次性Iml注射器針尖。
[0022]本發(fā)明中，所述的機械劃痕類似“豐”字，即十六橫一豎且一豎貫通十六橫，其中縱向劃痕(一豎)為16次，橫向劃痕各為I次。
[0023]本發(fā)明中，步驟C換液后繼續(xù)培養(yǎng)7?8d形成類膠質疤痕的結構。
[0024]本發(fā)明所述的腦(脊)膜纖維細胞(Meningeal Fibroblast)，可用文獻方法獲得(Kimura-Kuroda J, Teng X, Komuta Y, Yosh1ka N, Sango K, Kawamura K, Raisman G, KawanoH.An in vitro model of the inhibit1n of axon growth in the les1n scar formedafter central nervous system injury.Mol Cell Neurosc1.2010 ；43 (2): 177-87.);或從中科院細胞所獲得。
[0025]本發(fā)明所述的星形膠質細胞，可用文獻方法獲得(Kimura-Kuroda J, TengX, Komuta Y, Yosh1ka N, Sango K, Kawamura K, Raisman G, Kawano H.An in vitro modelof the inhibit1n of axon growth in the les1n scar formed after central nervoussystem injury.Mol Cell Neurosc1.2010 ；43 (2): 177-87.);或從北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研宄院獲得(資源編號:3111C0002000000080)。
[0026]本發(fā)明中，步驟A腦(脊)膜纖維細胞和星形膠質細胞的純化后，為本領域的常規(guī)技術手段。
[0027]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，提供了步驟A中腦(脊)膜纖維細胞的培養(yǎng)、純化及鑒定，具體步驟如下:
[0028]1.1分離大腦
[0029]出生后24h的SD大鼠，75 %酒精浸泡消毒；斷頭并用眼科彎剪剪開頭顱皮膚，暴露“人”字縫；用眼科直剪沿“人”字縫將顱骨剪開并翻向兩側，暴露兩側大腦半球，用顯微彎鑷取出完整大腦，置于預冷的HBSS緩沖液。
[0030]1.2分離大腦腦膜及細胞培養(yǎng)純化
[0031]體視顯微鏡下，用顯微鑷夾住腦膜邊緣沿大腦皮層表面緩慢地剝離，得到完整的腦膜置于另一預冷的HBSS緩沖液；
[0032]顯微剪剪碎腦膜后，加0.125% Trypsin-EDTA于37°C下消化18min，加含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，終止消化并離心收集沉淀，DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌2遍后，加適量含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基種植于細胞培養(yǎng)板中，于37°C、5% 0)2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h后吸棄含有懸浮細胞的培養(yǎng)基并換液，此后隔天換液。
[0033]1.3腦(脊)膜纖維細胞的鑒定
[0034]腦(脊)膜纖維細胞經傳代后以I X 105/ml的密度接種于預先用50 μ g/ml L-多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，通過層粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)免疫熒光細胞化學染色鑒定。
[0035]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，提供了步驟A中星形膠質細胞的培養(yǎng)、純化及鑒定，具體步驟如下:
[0036]2.1分離大腦
[0037]同上 1.1
[0038]2.2分離大腦皮層及細胞培養(yǎng)純化
[0039]剝離腦膜后的大腦皮層，預冷HBSS液沖洗3遍后，剪碎大腦皮層，加0.1