一株蒙氏腸球菌及其在低溫青貯中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，涉及一株蒙氏腸球菌及其在低溫青貯中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 青貯是在乳酸菌的厭氧發(fā)酵作用下將碳水化合物轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸，從而使pH降低 達(dá)到長期貯存的目的。乳酸菌和溫度是青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)好壞的決定性因素。
[0003] 燕麥?zhǔn)歉吆貐^(qū)冬春飼補(bǔ)的主要飼料作物，由于高寒地區(qū)溫度低海拔高，不利于 乳酸菌的生長，很難發(fā)酵出品質(zhì)優(yōu)良并可以長期貯存的飼料。
[0004] 因此，篩選出耐高低溫、耐鹽、耐酸堿的抗逆性較強(qiáng)的菌株，并將其作為發(fā)酵劑添 加到低溫青貯燕麥飼料中，將會對高寒地區(qū)的青貯飼料制作有著巨大的應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個目的是提供一株蒙氏腸球菌。
[0006] 本發(fā)明所提供的蒙氏腸球菌具體為蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii) QH1-255,該菌株已于2015年4月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（簡稱CCTCC，地 址為：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學(xué)校內(nèi)武漢大學(xué)保藏中心），其保藏編號為 CCTCC NO :M 2015253。
[0007] 所述蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii)QHl_255從中國青海省尖扎縣野生小麥 上分離得到，該菌株單菌落形狀為圓形，革蘭氏染色陰性，不產(chǎn)過氧化氫，不能利用葡萄糖 發(fā)酵產(chǎn)氣，為同型發(fā)酵菌株。在50°C、6. 5% NaCl和pH值3到4的條件下生長微弱，其余測 定條件均生長良好，具有較好的耐高低溫，耐堿以及耐鹽的生長能力。其16S rDNA序列如 序列表中序列1所示。
[0008] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種菌劑。
[0009] 本發(fā)明所提供的菌劑的活性成分為所述蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii) QH1-255CCTCC NO :M 2015253。
[0010] 所述菌劑除了包含作為活性成的所述蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii) QH1-255CCTCC N0:M 2015253外，還可包含輔料，如MRS固體培養(yǎng)基（溶劑為水，溶質(zhì)及其 濃度如下：蛋白胨l〇g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖20g/L，三水合乙酸鈉5g/L，吐 溫801g/L，磷酸氫二鉀2g/L，檸檬酸銨2g/L，硫酸鎂2g/L，硫酸錳0. 25g/L，瓊脂17g/L)。 [0011] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種青貯飼料添加劑。
[0012] 本發(fā)明所提供的青IC飼料添加劑的活性成分為所述蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii)QH1-255CCTCC NO ：M 2015253〇
[0013] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種青貯飼料。
[0014] 本發(fā)明所提供的青貯飼料中含有所述青貯飼料添加劑。
[0015]所述蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii)QHl_255CCTCC NO :M 2015253或所述菌 劑在如下任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0016] (al)抑制細(xì)菌；
[0017] (a2)制備細(xì)菌抑制劑；
[0018] (a3)制備所述青IC飼料添加劑；
[0019] (a4)制備所述青IC飼料。
[0020] 所述（al)的應(yīng)用為非疾病診斷治療性應(yīng)用。
[0021] 在所述（al)和所述（a2)中，所述細(xì)菌具體可為藤黃微球菌和/或沙門氏菌。
[0022] 其中，所述蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii)QHl-255CCTCC NO :M 2015253 或 所述菌劑對所述細(xì)菌的抑制具體體現(xiàn)為30°C條件下的抑制。
[0023] 所述青貯飼料添加劑在制備所述青貯飼料中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0024] 本發(fā)明的第五個目的是提供一種制備所述青貯飼料的方法。
[0025] 本發(fā)明所提供的制備所述青貯飼料的方法，具體可包括：將青貯原料與所述蒙氏 腸球菌（Enterococcus mundtii)QHl_255CCTCC NO :M 2015253混合，進(jìn)行固體厭氧發(fā)酵，收 集所有發(fā)酵產(chǎn)物，得到所述青貯飼料；
[0026] 在本發(fā)明中，所述青貯原料為燕麥全株；具體為乳熟期的燕麥全株，水分含量 82. 97%，切割成l-2cm小段。
[0027] 在所述方法中，所述燕麥全株和所述蒙氏腸球菌（^Enterococcus mundtii) QH1-255CCTCC NO :M 2015253的配比可為100g :105cfu ;所述發(fā)酵為低溫發(fā)酵；所述低溫可 為5°C ;所述發(fā)酵的時間可為30天。
[0028] 本發(fā)明所提供的蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii) QH1-255CCTCC NO : M2015253具有耐高低溫、耐鹽、耐酸堿等抗逆性，并在低溫青貯（5°C)過程中迅速繁殖并產(chǎn) 酸降PH，有效的抑制有害雜菌的生長或產(chǎn)生，粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗纖維等營養(yǎng)成分有效保 留，非營養(yǎng)物質(zhì)如粗灰分成分降低，達(dá)到長期保存青貯飼料的效果。
[0029] 保藏說明
[0030] 菌種名稱：蒙氏腸球菌
[0031] 拉丁名：（Enterococcus mundtii)
[0032] 菌株編號：QH1-255
[0033] 保藏機(jī)構(gòu)：中國典型培養(yǎng)物保藏中心
[0034] 保藏機(jī)構(gòu)簡稱：CCTCC
[0035] 地址：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學(xué)校內(nèi)武漢大學(xué)保藏中心
[0036] 保藏日期：2015年4月28日
[0037] 保藏中心登記入冊編號：CCTCC NO :M 2015253
【具體實(shí)施方式】
[0038] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0039] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0040] 實(shí)施例1、蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii)QH1-255的分離與鑒定
[0041] -、菌株QH1-255的分尚與篩選
[0042] 取中國青海省尖扎縣野生小麥10g，放入90mL無菌水，震蕩10秒，吸取ImL液體放 于I. 5mL離心管，依次稀釋101，103, IO5倍，取稀釋液體20 μ L分別涂布到MRS固體培養(yǎng)基 上，30°C厭氧培養(yǎng)48小時，取單菌落MRS固體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，將獲得的其中一株菌編號為 QH1-255。
[0043] 其中，所述MRS固體培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下：蛋白胨10g/L，牛肉膏 10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖20g/L，三水合乙酸鈉5g/L，吐溫801g/L，磷酸氫二鉀2g/L，檸檬 酸銨2g/L，硫酸鎂2g/L，硫酸錳0. 25g/L，瓊脂17g/L。
[0044] 二、菌株QH1-255的鑒定
[0045] 從以下幾個方面對步驟一分離并篩選得到的菌株QH1-255進(jìn)行鑒定。
[0046] 1、形態(tài)學(xué)鑒定
[0047] 步驟一分離并篩選得到的菌株QH1-255單菌落，革蘭氏染色后，顯微鏡下觀察單 菌落形狀呈圓形。
[0048] 2、生理生化特征鑒定
[0049] 步驟一分離并篩選得到的菌株QH1-255革蘭氏染色陰性，不產(chǎn)過氧化氫，不能利 用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)氣，為同型發(fā)酵菌株。
[0050] 利用API 50CH檢測菌株QH1-255對不同碳源的發(fā)酵利用情況。結(jié)果如表1所示。 可見，菌株QH1-255可以利用核糖，木糖，甘露糖，苦杏仁苷，熊果苷，七葉靈，水楊苷，纖維 二糖，乳糖，蔗糖，N-甲基-葡萄糖胺，果糖，葡萄糖，麥芽糖，L-阿拉伯糖，海藻糖作為碳源 進(jìn)行發(fā)酵；不可以利用甘油，L-海藻糖，α -甲基-D-葡萄糖苷，D-松二糖，D-阿拉伯醇，松 三糖，棉子糖，糖原，2-酮基-葡糖酸鹽，D-來蘇糖，鼠李糖，D-阿拉伯糖，L-木糖，β-甲 基-木糖苷，菊粉，山梨糖，半乳糖醇，纖維醇，淀粉，D-海藻糖，木糖醇，赤蘚糖醇，葡糖酸 鹽，L-阿拉伯醇，核糖醇，5-酮基-葡糖酸鹽作為發(fā)酵碳源；可以微弱利用半乳糖、甘露醇、 山梨醇、蜜二糖、α -甲基-D-甘露糖苷、龍膽二糖、D-塔格糖作為碳源進(jìn)行發(fā)酵。
[0051] 表1菌株QH1-255對不同碳源的發(fā)酵利用情況
[0052]
[0053] 注：" + "表示陽性，即能利用；表示陰性，即不能利用；"w"表示弱陽性，即微弱 利用。
[0054] 3、16S rDNA序列同源性分析
[0055] 提取步驟一所得的菌株QH1-255的基因組DNA，以其為模板，采用細(xì)菌通用引物進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，獲得菌株QH1-255的16S rDNA片段，并進(jìn)行序列測定，其序列為序列表中序 列 1。將序列 1 在 GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行 BLAST(htt