專利名稱：軟骨細(xì)胞制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及軟骨細(xì)胞的制備方法，更詳細(xì)而言，涉及由軟骨膜細(xì)胞制 備軟骨細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
如果人軟骨先天缺損或者后天損傷或缺損時(shí)，通常不會(huì)再生。作為治 療人軟骨疾病的現(xiàn)有方法，有從自身的其他部位采集軟骨組織移植到缺損 部位的方法，但存在采集部位和量有限的問題。為此，考慮了采集一部分 自身的軟骨細(xì)胞，在生物體外培養(yǎng)后，返回到病患部位的方法(非專利文獻(xiàn)
1 4)，也進(jìn)行了臨床應(yīng)用(非專利文獻(xiàn)5、 6與7)。
但是，使用軟骨細(xì)胞的方法存在2個(gè)問題。即，侵襲采集 位的問題 與長期維持形態(tài)的問題。所謂第一個(gè)的侵襲采集部位的問題，是指采集用 于培養(yǎng)軟骨的軟骨時(shí)，導(dǎo)致該部位缺損、凹陷等畸形或功能障礙。所謂第 二個(gè)的長期維持形態(tài)的問題，是由培養(yǎng)的軟骨再生的組織長期未被吸收， 是否可以持續(xù)維持其形態(tài)的問題。
為了解決上述問題，考慮了另外尋求軟骨細(xì)胞的供給源。也就是說， 利用軟骨細(xì)胞以外的細(xì)胞，使其在生物體外分化為軟骨細(xì)胞，返回到生物 體內(nèi)。上述細(xì)胞中，可以舉出胚性干細(xì)胞、間葉系干細(xì)胞、來自膝關(guān)節(jié)滑 膜的細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等(專利文獻(xiàn)1 4)。確認(rèn)了上述細(xì)胞均分化為軟骨細(xì) 胞。但是，從倫理的觀點(diǎn)考慮，胚性干細(xì)胞難以進(jìn)行臨床應(yīng)用，并且難以 采集間葉系干細(xì)胞與來自膝關(guān)節(jié)滑膜的細(xì)胞，或者侵襲高、由脂肪細(xì)胞分 化為軟骨細(xì)胞還處于研究階段，間葉系干細(xì)胞有采集的侵襲或分化效率的 問題，所以均不能應(yīng)用于臨床。
目前，由生物體內(nèi)外的研究能確認(rèn)軟骨膜形成軟骨(非專利文獻(xiàn)8 10)。上述研究中，不分離軟骨膜，直接以軟骨膜塊的狀態(tài)進(jìn)行移植，還遠(yuǎn)
5遠(yuǎn)不能應(yīng)用于臨床。
非專利文獻(xiàn)l: van OschGJetal,PlastReconstr Surg 107: 433-440(2001) 非專禾U文獻(xiàn)2: Br她erg et al,The New England Journal of Medicine 331: 889-895(1994)
專利文獻(xiàn)3: Ting etal,AnnalsofPlastic Surgery 40: 413-421(1998) 非專禾ll文獻(xiàn)4: Rodriguez et al,Plastic and Reconstructive Surgery 103:
1111-1119(1999)
非專利文獻(xiàn)5: OchiMetal,JBone Joint Surg 84: 571-578(2002) 非專利文獻(xiàn)6: YanagaHetal.AesthPlastSurg28: 212-221 (2004) 非專利文獻(xiàn)7: Yanaga H et al.PIast & Reconstr Surg 117: 2019-30(2006) 非專利文獻(xiàn)8: Ove Engkvist et al.，Scand J Plast Reconst Surg.1979,13;
275-280
非專利文獻(xiàn)9: Ove Engkvist et al"Scand J Plast Reconst Surg.1979,13; 371-376
非專利文獻(xiàn)10: Duynstee et al.，Plasr and Reconst Surg.2002,110(4). 1073-1079
專利文獻(xiàn)h日本特開2005-511083號(hào)公報(bào) 專利文獻(xiàn)2:日本特開2003-51875號(hào)公報(bào) 專利文獻(xiàn)3:日本特開2005-500085號(hào)公報(bào) 專利文獻(xiàn)4:日本特開2001-103965號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供制備對(duì)采集部位侵襲少的軟骨細(xì)胞的方法。 本發(fā)明人等為了解決上述問題，開發(fā)了使用覆蓋耳廓軟骨或肋軟骨的 外側(cè)的軟骨膜的方法。本發(fā)明人等從軟骨膜分離軟骨膜細(xì)胞，使其增殖， 在生物體內(nèi)外分化成軟骨細(xì)胞，由此成功制備了作為軟骨細(xì)胞的特有基質(zhì) 的蛋白聚糖與II型膠原。
本發(fā)明的主旨如下所述。
(l)所述細(xì)胞，其是來自人軟骨膜組織的細(xì)胞，能分化為軟骨細(xì)胞。(2) 如(1)所述的細(xì)胞，其中，人軟骨膜組織包括最外層與成纖維細(xì) 胞層。
(3) 如(1)所述的細(xì)胞，其中，人軟骨膜組織包括最外層、成纖維細(xì) 胞層和最內(nèi)層。
(4) (1)所述的細(xì)胞的制備方法，該方法包括培養(yǎng)從人軟骨膜組織分 離的細(xì)胞的步驟。
(5) —種組合物，其含有(1) (3)中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞。
(6) 如(5)所述的組合物，其中，所述組合物用于下述的細(xì)胞增殖， 所述細(xì)胞來自人軟骨膜組織，能分化為軟骨細(xì)胞。
(7) 如(5)所述的組合物，其中，所述組合物用于制備人軟骨細(xì)胞。
(8) 如(5)所述的組合物，其中，所述組合物用于細(xì)胞移植。
(9) 如(8)所述的組合物，其中，細(xì)胞移植的目的在于治療先天性耳 廓畸形、治療肋軟骨缺損、治療關(guān)節(jié)軟骨損傷、治療氣管軟骨缺損、隆鼻 術(shù)、頦成形術(shù)、面部的小凹陷成形術(shù)、面部左右不對(duì)稱的矯正術(shù)、眼瞼周 圍的矯正術(shù)或面部的美容整形術(shù)中的任一種。
(10) 如(5) (9)中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述組合物還含有 (l)所述的細(xì)胞所產(chǎn)生的基質(zhì)。
(11) 如(5) ~ (10)中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述組合物還含 有支架。
(12) 軟骨細(xì)胞的制備方法，其中，包括使(l)所述的細(xì)胞分化為軟骨細(xì) 胞的步驟。
(13) 如(12)所述的方法，其中，通過離心管培養(yǎng)(l)所述的細(xì)胞來形 成細(xì)胞塊。
(14) 如(12)所述的方法，其中，利用平板培養(yǎng)將(l)所述的細(xì)胞重迭。
(15) 如(12) (14)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在含有血清的培養(yǎng) 基中使(l)所述的細(xì)胞增殖和/或分化。
(16) 如(15)所述的方法，其中，血清為牛血清。
(17) 如(15)所述的方法，其中，血清為自身血清。
(18) 如(12) (17)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在含有DEME/F12、血清、抗生素以及抗真菌劑的培養(yǎng)基中使(l)所述的細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞。
(19) 如(18)所述的方法，其中，培養(yǎng)基還含有地塞米松和/或L-抗壞 血酸。
(20) 如(18)或(19)所述的方法，其中，培養(yǎng)基還含有胰島素樣生 長因子和/或堿性成纖維細(xì)胞生長因子。
(21) —種軟骨細(xì)胞，其是由(12) (20)中任一項(xiàng)所述的方法制備而成的。
(22) —種組合物，其含有(21)所述的軟骨細(xì)胞和/或該細(xì)胞所形成的軟 骨組織。
(23) 如(22)所述的組合物，其用于移植治療。
(24) 如(23)所述的組合物，其中，移植治療的目的在于治療先天性 耳廓畸形、治療肋軟骨缺損、治療關(guān)節(jié)軟骨損傷、治療氣管軟骨缺損、隆 鼻術(shù)、頦成形術(shù)、面部的小凹陷成形術(shù)、面部左右不對(duì)稱的矯正術(shù)、眼瞼 周圍的矯正術(shù)或面部的美容整形術(shù)中的任一種。
(25) 如(22) ~ (24)中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述組合物還含 有(21)所述的軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的基質(zhì)。
(26) 如(22) ~ (25)中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述組合物還含 有支架。
(27) —種方法，其將(1) (3)中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞移植到生物體內(nèi)。
(28) —種方法，其將(21)所述的軟骨細(xì)胞和/或該細(xì)胞所形成的軟骨組 織移植到生物體內(nèi)。
(29) (1) (3)中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞在細(xì)胞移植中的應(yīng)用。
(30) (21)所述的軟骨細(xì)胞和/或該細(xì)胞所形成的軟骨組織在移植治療中 的應(yīng)用。
(31) 軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的基質(zhì)的制備方法，其包括使(l)所述的細(xì)胞分化為 軟骨細(xì)胞的步驟和使該軟骨細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)的步驟。
(32) 如(31)所述的方法，其中，所述基質(zhì)為n型膠原和/或蛋白聚糖。
本發(fā)明的軟骨細(xì)胞制備方法由于無需采集軟骨組織，所以可以將對(duì)采 集部位的侵襲抑制到最小限。另外，通過使用含有軟骨的干，前體細(xì)胞的軟骨膜細(xì)胞，能長期維持 再生的組織的形態(tài)。
本說明書包含作為本申請(qǐng)優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本國專利申請(qǐng)、特愿
2007-012160的說明書禾口/或附圖所記載的內(nèi)容。


采集人軟骨膜時(shí)的組織學(xué)研究。 軟骨組織被阿辛蘭染為藍(lán)色，但軟骨膜未被染色。軟骨膜可以僅采集 最外層和成纖維細(xì)胞層，也可以采集最外層、成纖維細(xì)胞層及最內(nèi)層(與軟
骨基質(zhì)的過渡部)。a:采集前箭頭軟骨膜b:僅剝離軟骨膜的過程中 C:剝離軟骨膜后 d:也能進(jìn)一步采集軟骨膜最內(nèi)層(與軟骨基質(zhì)的過渡 部)。e:僅由最外層與成纖維細(xì)胞層采集的軟骨膜組織阿辛蘭染色倍
率200倍軟骨膜細(xì)胞的離心管培養(yǎng)。
軟骨膜細(xì)胞塊與軟骨細(xì)胞塊相同地通過離心管形成軟骨組織。a:由
軟骨膜細(xì)胞再生的軟骨組織b:由軟骨細(xì)胞再生的軟骨組織阿辛蘭染色
Bar: 200,在體外，將軟骨膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞同樣地重迭，由此提高基質(zhì) (蛋白聚糖)產(chǎn)生能力。
a:明視野b:阿辛蘭染色在體外，將軟骨膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞同樣地重迭，由此提高基質(zhì)(蛋
白聚糖)產(chǎn)生能力，其產(chǎn)生能力與軟骨細(xì)胞同等。
a:單層化培養(yǎng)的軟骨膜細(xì)胞b:重迭化(3層化)的軟骨膜細(xì)胞C:單 層化的軟骨細(xì)胞d:重迭化(3層化)的軟骨膜細(xì)胞阿辛蘭染色軟骨膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞的重迭培養(yǎng)中的RT-PCR。
軟骨膜細(xì)胞通過重迭，I型膠原減少，II型膠原增加。軟骨膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞的重迭化培養(yǎng)中用即時(shí)PCR進(jìn)行定量化。 軟骨膜細(xì)胞通過重迭，有I型膠原減少、II型膠原增加的傾向。 [圖7]在體外，通過重迭在上清中產(chǎn)生蛋白聚糖。軟骨膜細(xì)胞的蛋白聚糖產(chǎn)生能力與軟骨細(xì)胞基本同等。 [圖8]在體內(nèi)，培養(yǎng)人軟骨膜細(xì)胞形成軟骨組織。
移植于NOD/SCID小鼠背部皮下的培養(yǎng)軟骨膜細(xì)胞移植后2個(gè)月的狀 態(tài)。阿辛蘭染色a:倍率200倍b:倍率400倍在體內(nèi)，培養(yǎng)人軟骨膜細(xì)胞產(chǎn)生I型膠原與II型膠原，形成軟骨組織。
移植于NOD/SCID小鼠背部皮下的培養(yǎng)軟骨膜細(xì)胞移植后2個(gè)月的狀 態(tài)。I型膠原(紅)與II型膠原染色(綠)a倍率IOO倍b倍率400倍 [圖10]表示彈性軟骨或玻璃軟骨等軟骨膜與軟骨的層構(gòu)成。 [圖ll]補(bǔ)充圖l。
人軟骨膜組織分為最外層以及成纖維細(xì)胞層與最內(nèi)層這2層進(jìn)行采集。
其它為軟骨組織。a:最外層與成纖維細(xì)胞層b:最內(nèi)層C:軟骨組
織阿辛蘭染色倍率200倍人軟骨膜細(xì)胞的增殖能力。在顯微鏡下比較軟骨膜細(xì)胞與軟骨 細(xì)胞的菌落形成能力。
與人軟骨細(xì)胞相比，人軟骨膜細(xì)胞在培養(yǎng)l個(gè)月后形成較大的菌落。
人軟骨細(xì)胞(虛線箭頭)人軟骨膜細(xì)胞(實(shí)線箭頭)比例尺500|im人軟骨膜細(xì)胞的增殖能力。人軟骨膜細(xì)胞、軟骨膜-軟骨過渡部 細(xì)胞、軟骨細(xì)胞的菌落形成能力比較。
使用軟骨膜、軟骨膜-軟骨過渡部、軟骨細(xì)胞培養(yǎng)14天，比較由50個(gè)細(xì) 胞以上的菌落形成的菌落數(shù)時(shí)，可知軟骨膜細(xì)胞具有高菌落形成能力。因 此，可知軟骨膜細(xì)胞具有有限的高增殖能力。
(在直徑為3.5cm的細(xì)胞皿中分別接種500個(gè)細(xì)胞，2周后，數(shù)出形成的 菌落。l個(gè)菌落為50個(gè)以上。)
* : P < 0.001(Mann Whitney U-Test with Bonferroni correction) n=27(patientNo.=3)。人軟骨膜細(xì)胞的增殖能力。比較人軟骨膜、軟骨-軟骨膜過渡部、 軟骨細(xì)胞的長期增殖能力。使用人軟骨膜、軟骨-軟骨膜過渡部、軟骨細(xì)胞，比較長期培養(yǎng)中的增 殖能力時(shí)，可知軟骨膜細(xì)胞具有高增殖能力。
*: P< 0.001 (Mann Whitney U-Test with Bonferroni correction) n=5 (patient No.=5)在體外分化誘導(dǎo)為脂肪和骨。
研究在體外的多分化能力時(shí)，A:脂肪分化誘導(dǎo)軟骨膜細(xì)胞形成脂
肪滴，被作為脂肪染色的Oil red 0染色，但軟骨細(xì)胞不形成脂肪滴，未被 染色。B:骨分化誘導(dǎo)軟骨膜細(xì)胞確認(rèn)大量Ca沉積，被茜素紅染色，但 軟骨細(xì)胞未見Ca沉積，未被茜素紅染色。因此，確認(rèn)軟骨膜細(xì)胞有分化為 脂肪或骨的多分化能力。在體外分化為軟骨的分化誘導(dǎo)。
A人軟骨膜細(xì)胞的軟骨分化誘導(dǎo)。
使用分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，使人軟骨細(xì)胞重迭為(A)1層、(B)2層、(C)3層 進(jìn)行培養(yǎng)，由此細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生能力提高。用I型膠原(紅)、II型膠原(綠)、 DAPI(藍(lán))進(jìn)行染色時(shí)，也使其重迭為(D)1層、(E)2層、(F)3層進(jìn)行培養(yǎng)， 由此可以確認(rèn)細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生能力升高。不使用分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng) 時(shí)，使細(xì)胞重迭為(G)l層、(H)2層、(1)3層進(jìn)行培養(yǎng)，未產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)。
A-C,G-I:阿辛蘭染色D-F: I型膠原染色(紅)、II型膠原染色(綠)、DAP 染色I(xiàn)(藍(lán))比例尺200拜
B人軟骨細(xì)胞的軟骨分化誘導(dǎo)。
使用分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，使人軟骨細(xì)胞重迭為(A)1層、(B)2層、(C)3層 進(jìn)行培養(yǎng)，由此細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生能力提高。用I型膠原(紅)、II型膠原(綠)、 DAPI(藍(lán))進(jìn)行染色時(shí)，也使其重迭為(D)l層、(E)2層、(F)3層進(jìn)行培養(yǎng)， 由此可以確認(rèn)細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生能力上升。
不適用分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，使人軟骨細(xì)胞重迭為(G)1層、(H)2 層、①3層進(jìn)行培養(yǎng)，也未產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)。比例尺200pm
因此，在體外，軟骨膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞大致相同地分化為軟骨。
A-C,G-I:阿辛蘭染色D-F: I型膠原染色(紅)、II型膠原染色(綠)、DAP 染色I(xiàn)(藍(lán))比例尺200pm軟骨細(xì)胞再生的軟骨組織的組織學(xué)研究。
A:移植l個(gè)月后的人軟骨膜、來自軟骨細(xì)胞的再生軟骨(A-D:來自 軟骨膜細(xì)胞的軟骨組織、E-H:來自軟骨細(xì)胞的軟骨組織)
來自人軟骨膜細(xì)胞的再生軟骨被I型膠原覆蓋，但來自軟骨細(xì)胞的再生 軟骨未被I型膠原覆蓋。
B:移植3個(gè)月后的人軟骨膜、來自軟骨細(xì)胞的再生軟骨(A-D:來自 軟骨膜細(xì)胞的軟骨組織、E-H:來自軟骨細(xì)胞的軟骨組織)
來自人軟骨膜細(xì)胞的組織在移植后1個(gè)月同樣被I型膠原覆蓋，但來自 軟骨細(xì)胞的再生軟骨未被I型膠原覆蓋。
A,E: HE染色B，F(xiàn):阿辛蘭染色C，G: ElasticavanGieson染色D,H:
I型膠原染色(紅)、II型膠原染色(綠)、DAP染色I(xiàn)(藍(lán))比例尺200pm
顯示軟骨膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞相同地再生軟骨。來自軟骨膜細(xì)胞的再生
軟骨與來自軟骨細(xì)胞的再生軟骨不同，被軟骨膜覆蓋。這提示來自軟骨膜
細(xì)胞的再生軟骨長期形態(tài)維持能力優(yōu)異。在體內(nèi)再構(gòu)成的軟骨的每lmr^的細(xì)胞數(shù)。 移植后第l個(gè)月與第3個(gè)月摘出的組織軟骨部的每lmi^的細(xì)胞數(shù)。 來自軟骨膜細(xì)胞的組織在移植后第l個(gè)月、第3個(gè)月也未見細(xì)胞數(shù)變
化，而來自軟骨細(xì)胞的組織在移植后第3個(gè)月可見細(xì)胞數(shù)減少。 *: p < 0.05、 **: p < O.Ol(Mann Whitney U-Test)
顯示軟骨膜細(xì)胞的長期形態(tài)維持能力比軟骨細(xì)胞優(yōu)異。 [圖19]比較用10%人自身血清培養(yǎng)基得到的人軟骨膜細(xì)胞、軟骨膜-軟
骨過渡部細(xì)胞、軟骨細(xì)胞的菌落形成能力。
人軟骨膜細(xì)胞與人軟骨細(xì)胞相比，在培養(yǎng)第9天形成較大的菌落。倍
率為40倍在顯微鏡下比較用10%人自身血清培養(yǎng)基得到的人軟骨膜細(xì)
胞、軟骨膜-軟骨過渡部細(xì)胞、軟骨細(xì)胞。
與10%牛血清培養(yǎng)基相比，10%人自身血清培養(yǎng)基中的各細(xì)胞更快形 成匯合。倍率為40倍
具體實(shí)施例方式
以下，詳細(xì)說明本發(fā)明。
目前，為了再生人軟骨，以塊的形式采集軟骨組織，將其用膠原酶等 酶處理，從基質(zhì)成分中分離軟骨細(xì)胞，培養(yǎng)該分離的軟骨細(xì)胞，用于移植 治療、特別是自身移植。
但是，本發(fā)明中，可以不采集存在于基質(zhì)中的軟骨細(xì)胞，而采集包圍 該軟骨細(xì)胞的非常薄的軟骨膜。
例如，彈性軟骨或玻璃軟骨等軟骨膜與軟骨由4層形成(圖10)。即，1) 最外層(包括毛細(xì)血管)、2)成纖維細(xì)胞層(主要為軟骨膜細(xì)胞)(圖10中記為 "軟骨膜細(xì)胞層")、3)最內(nèi)層(與軟骨基質(zhì)的過渡部)、4)成熟軟骨層(被軟骨 基質(zhì)包圍)這4層(例如，參見Bairati A,Comazzi M,Gioria M.et al.,Tissue Cell 28: 455-68.(1996),Tonna Labor, et al"Invest 31: 609-632(1974),Ellender et al.，J.Anatl58: 173-187(1988))。"最外層"包括作為表達(dá)I型膠原、且不表達(dá) II型膠原的層的最上層的毛細(xì)血管。"成纖維細(xì)胞層"是表達(dá)I型膠原、且不
表達(dá)n型膠原的層，由不含最外層的所有軟骨膜細(xì)胞構(gòu)成。"最內(nèi)層"包括 "成纖維細(xì)胞層"和表達(dá)n型膠原與蛋白聚糖的軟骨基質(zhì)。"成熟軟骨層"是 表達(dá)ii型膠原與蛋白聚糖、并且不表達(dá)i型膠原的層。
至今為止的軟骨采集方法是采集1) 4)全部，或3)和4)，或僅采集4)
的方法。用該現(xiàn)有方法進(jìn)行采集時(shí)，采集部位的軟骨組織缺損或不恢復(fù)， 在表觀上有時(shí)確認(rèn)凹陷或變形等畸形。
本發(fā)明中，可以使用鑷子或剪刀等鋒利的器具采集含有1)和2)，或1) 3)的組織。另外，也可以使用剝離器等鈍器。還可以采集存在占有大部分 軟骨組織的軟骨細(xì)胞的4)層。因此，能以最小限的侵襲進(jìn)行采集，沒有軟 骨組織的缺損，不產(chǎn)生畸形，這是較大的優(yōu)點(diǎn)。在一定條件下利用膠原酶 等分離由上述方式得到的組織(例如，0.1-0.3%膠原酶、37°C、 l-3小時(shí))。 這是軟骨膜細(xì)胞特有的分離方法?；蛘?，采集所有的l) 4)，利用膠原 酶等分離所得的組織時(shí)，也可以分離軟骨膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞。例如，使膠 原酶作用時(shí)，軟骨膜細(xì)胞在3小時(shí)以內(nèi)分離，但分離軟骨細(xì)胞時(shí)花費(fèi)10-16 小時(shí)左右，所以利用該時(shí)間差，可以分離軟骨膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞。將分離得到的細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，用增殖用培養(yǎng)基培養(yǎng)l小時(shí)左右。 然后，用分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行離心管培養(yǎng)、單層化培養(yǎng)或重迭培養(yǎng)，由此 軟骨膜細(xì)胞可以分化為軟骨細(xì)胞。
本發(fā)明中，通過培養(yǎng)由不包括人軟骨的人軟骨膜得到的人軟骨膜細(xì) 胞，可以將軟骨膜細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞。
本發(fā)明能提供來自軟骨膜組織，并能分化為軟骨細(xì)胞的細(xì)胞。認(rèn)為本 發(fā)明的來自軟骨膜組織的細(xì)胞是軟骨干和/或前體細(xì)胞。軟骨膜組織是構(gòu)成 耳廓或肋軟骨等軟骨組織的組織的一部分，其是含有軟骨膜的部分。具體 而言，是含有最外層及成纖維細(xì)胞層(軟骨膜細(xì)胞層)的組織，含有最外層、 成纖維細(xì)胞層(軟骨膜細(xì)胞層)及最內(nèi)層的組織。來自本發(fā)明細(xì)胞的人軟骨 膜組織可以包括最外層及成纖維細(xì)胞層，也可以包括最外層、成纖維細(xì)胞 層及最內(nèi)層。軟骨膜組織可以從人、特別是需要軟骨移植的患者采集。
來自軟骨膜組織的細(xì)胞可以為從軟骨膜組織中分離的細(xì)胞，也可以為 將該細(xì)胞進(jìn)行繼代培養(yǎng)得到的細(xì)胞。
為了得到本發(fā)明的細(xì)胞，可以采集軟骨膜組織，從采集的組織中分離 細(xì)胞。軟骨膜組織的采集可以使用鑷子與剪刀等鋒利的器具，也可以使用 剝離器等鈍器。從軟骨膜組織中分離細(xì)胞時(shí)，可以在一定條件下將軟骨膜
組織進(jìn)行膠原酶處理(例如0.1 0.3%膠原酶、37°C、 1 3小時(shí))，然后進(jìn)行 離心分離(例如1500rpm/5min 2次)。上述處理?xiàng)l件可以適當(dāng)變更，該變更 后的方案也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。通過培養(yǎng)從軟骨膜組織分離的細(xì)胞，可以 使細(xì)胞增殖，進(jìn)而分化為軟骨細(xì)胞。
將從軟骨膜組織中分離的細(xì)胞進(jìn)行初代培養(yǎng)與繼代培養(yǎng)時(shí)，可以在添 加有血清(例如10。/。的胎牛血清(FBS)、來自移植對(duì)象患者的血清)的 Dulbecco，s Modified Eagles，s Medium/Nutrient Mixture F12 (DMEM/F12)或 Nutrient Mixture F-l2 Ham(F-12 Ham)中，于約37。C下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基可 以每隔2-4天進(jìn)行更換。
為了使其增殖，軟骨細(xì)胞難以長期培養(yǎng)，與軟骨細(xì)胞相比，軟骨膜細(xì) 胞能進(jìn)行長期的增殖培養(yǎng)。
使從軟骨膜組織中分離的細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞時(shí)，可以在含有血清的培養(yǎng)基例如DEME/F12、血清(例如10。/。的FBS、來自成為移植對(duì)象的患者 的血清)，含有抗生素與抗真菌劑的培養(yǎng)基中，于約37C下進(jìn)行培養(yǎng)。作為 含有抗生素與抗真菌劑這兩者的藥劑，可以使用抗生素-抗真菌溶液 (antibiotic antimycotic solution) SIGMA A5955等?？梢栽谂囵B(yǎng)基中進(jìn)一 步添加40 60jig/ml的地塞米松(Dexamethasone)和/或3 0 60嗎/ml的L-抗 壞血酸(L-ascorbicacid)。另外，也可以進(jìn)一步添加胰島素樣生長因子(例如 5 10ng/ml的胰島素樣生長因子-l (Insulinlike growth factor-1)(IGF-1)、 5 10ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic Fibroblast growth factor(bFGF))等。 此外，也可以添力P5 10ng/ml的胰島素(Insulin)等。可以每隔2-3天進(jìn)行培 養(yǎng)基交換。
通過將來自軟骨膜組織的細(xì)胞進(jìn)行離心管培養(yǎng)，由此可以形成細(xì)胞 塊。例如，在含有5ng/ml的胰島素樣生長因子-l(IGF-l)、 5ng/ml的堿性成 纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、 40ng/ml的地塞米松、L-抗壞血酸、1%的抗生 素-抗真菌溶液、Insulin■ Transferrin' Serine(ITS)的DMEM/F12的無血清培 養(yǎng)基中，在約37"C下用離心管培養(yǎng)培養(yǎng)2-4周時(shí)，形成細(xì)胞塊。
另外，可以將來自軟骨膜組織的細(xì)胞用平板培養(yǎng)進(jìn)行單層化或重迭。 例如，使用DMEM/F12中含有10n/。FBS與P/?？股?抗真菌溶液的培養(yǎng)基或 DMEM/F12中含有10%FB S 、 1 %抗生素-抗真菌溶液、5 ng/ml的IGF-1 、 5ng/ml 的bFGF、 40ng/ml的地塞米松的培養(yǎng)基，進(jìn)行平板培養(yǎng)，每隔l周進(jìn)行重迭 時(shí)，基質(zhì)(例如蛋白聚糖)產(chǎn)生能力提高。重迭的次數(shù)因用途或所需組織的 大小等而不同，但理想為3 5次。
上述培養(yǎng)基的組成與成分含量可以適當(dāng)變更，其變更后的方案也包括 在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
因此，本發(fā)明提供能分化為軟骨細(xì)胞的細(xì)胞的制備方法，其包括將從 軟骨膜組織中分離細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的步驟。
另外，本發(fā)明提供軟骨細(xì)胞的制備方法，其包括使來自軟骨膜組織的 細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的步驟。通常，軟骨膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的物質(zhì)不
同。已知軟骨膜細(xì)胞存在于i型膠原中，而軟骨細(xì)胞存在于n型膠原與蛋白
聚糖中，來產(chǎn)生上述物質(zhì)。軟骨膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞可以根據(jù)上述產(chǎn)生物質(zhì)的不同來區(qū)分。
進(jìn)而，本發(fā)明也提供軟骨細(xì)胞，其是通過將來自軟骨膜組織的細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞而制備的。
通過將來自軟骨膜組織的、能分化為軟骨細(xì)胞的所述細(xì)胞移植到生物體內(nèi)，由此可以進(jìn)行治療先天性耳廓畸形、治療肋軟骨缺損、治療關(guān)節(jié)軟骨損傷(例如變形性膝關(guān)節(jié)癥)、治療氣管軟骨缺損、隆鼻術(shù)、頦成形術(shù)、面部的小凹陷成形術(shù)、面部左右不對(duì)稱的矯正術(shù)、眼瞼周圍的矯正術(shù)、面部的美容整形術(shù)等。移植細(xì)胞時(shí)，進(jìn)一步可以添加上述細(xì)胞產(chǎn)生的基質(zhì)(例如I、 II型膠原、軟骨可聚蛋白多糖等蛋白聚糖)等。另外，也可以添加來自軟骨組織的軟骨細(xì)胞。軟骨組織可以從人、特別是需要軟骨移植的患者采集。為了得到軟骨細(xì)胞，可以采集軟骨組織，由采集的組織分離細(xì)胞。由軟骨組織分離細(xì)胞時(shí)，可以將軟骨組織在一定條件下進(jìn)行膠原酶處理(例如
0.1-0.2%膠原酶、37°C、 10-16小時(shí))。為了增加初代培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)，將軟骨
細(xì)胞添加于其他培養(yǎng)體系或軟骨細(xì)胞時(shí)，由于原本初代培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)多，所以可以以較短時(shí)間的培養(yǎng)準(zhǔn)備移植所需的細(xì)胞數(shù)。移植時(shí)可以不添加任
意物質(zhì)進(jìn)行移植，或者也可以添加i、 n型膠原或蛋白聚糖等。
用注射器將來自軟骨膜組織的、能分化軟骨細(xì)胞的所述細(xì)胞注入患部，由此來進(jìn)行細(xì)胞移植。
通過將來自軟骨膜組織的、能分化為軟骨細(xì)胞的所述細(xì)胞與支架
(scaffold)(軟骨治療材料)一起培養(yǎng)，由此可以形成具有三維結(jié)構(gòu)的軟骨組織。作為支架材料，可以舉出膠原、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸與聚乙醇酸的共聚物以及聚乙烯等非吸收性材料等。
另外，使用通過使來自軟骨膜組織的細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞而制得的軟骨細(xì)胞和/或該軟骨細(xì)胞所形成的軟骨組織，可以進(jìn)行目的在于治療先天性耳廓畸形、治療肋軟骨缺損、治療關(guān)節(jié)軟骨損傷(例如變形性膝關(guān)節(jié)癥)、治療氣管軟骨缺損、隆鼻術(shù)、頦成形術(shù)、面部的小凹陷成形術(shù)、面部左右不對(duì)稱的矯正術(shù)、眼瞼周圍的矯正術(shù)、面部的美容整形術(shù)等的移植治療。移植治療時(shí)，還可以添加上述軟骨細(xì)胞所產(chǎn)生的基質(zhì)(例如I、 II型膠原、蛋白聚糖、軟骨可聚蛋白多糖)。另外，也可以添加來自軟骨組織的軟骨細(xì)胞。得到軟骨細(xì)胞的方法與添加軟骨細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)如上所述。進(jìn)而，在細(xì)胞培養(yǎng)
中，將吸收性或非吸收性材料放置在培養(yǎng)器的底部，由此可以將軟骨膜細(xì)
胞放入材料中?？梢灾苯右浦驳交疾俊?br> 移植軟骨細(xì)胞可以通過用注射器將細(xì)胞注入患部來進(jìn)行。使用材料等支架的軟骨組織的移植可以通過外科移植手術(shù)來進(jìn)行。例
如，可以使用隆鼻術(shù)、耳廓成形術(shù)的手術(shù)等外科方法。
進(jìn)而，本發(fā)明提供軟骨細(xì)胞所產(chǎn)生的基質(zhì)的制備方法，其中，該方法
包括使軟骨膜細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的步驟以及使該軟骨細(xì)胞所產(chǎn)生基質(zhì)
的步驟。作為軟骨細(xì)胞所產(chǎn)生的基質(zhì)，可以舉出n型膠原、蛋白聚糖。上
述基質(zhì)可以用于化粧品、食品、健康食品、醫(yī)藥品等。
以下，通過實(shí)施例具體說明本發(fā)明。本發(fā)明的范圍不限定于下述實(shí)施例。
下，所謂采集時(shí)的軟骨膜組織，是指組織學(xué)上的最外層與成纖維細(xì)胞層，軟骨膜-軟骨過渡部組織是指最內(nèi)層。軟骨膜細(xì)胞的采集
為了從耳廓或肋軟骨等軟骨組織(使用獲得本人或父母同意，由手術(shù)時(shí)所剩余的人耳廓軟骨得到的軟骨膜。獲得神奈川縣立兒童醫(yī)療中心與橫浜市立大學(xué)醫(yī)學(xué)部附屬醫(yī)院的倫理委員會(huì)的同意)采集軟骨膜組織，使用鑷子與剪刀等鋒利的器具。另外，可以使用剝離器等鈍器。使用鋒利的器具時(shí)，為了確認(rèn)是否僅采集軟骨膜，用組織切片對(duì)每個(gè)個(gè)體進(jìn)行確認(rèn)(圖l)。
從所得的組織中除去位于脂肪組織等軟骨膜上的所有組織。然后，使用剪刀等鋒利的器具，用手采集軟骨膜。
用作為軟骨基質(zhì)特有染色的阿辛蘭染色對(duì)各個(gè)個(gè)體確認(rèn)采集的軟骨膜組織。采集的軟骨膜組織完全沒有被阿辛蘭染色所染色，軟骨膜-軟骨過渡部組織的一部分與軟骨組織全部被染色(圖IO 。
軟骨膜細(xì)胞的分離
使用剪刀、手術(shù)刀等剪斷所得的軟骨膜，在0.1-0.3。/。膠原酶中于37。C
下振蕩l-3小時(shí)。然后，進(jìn)行離心(在1500rpm/5min下2次)，回收沉淀物。由此可以分離軟骨膜細(xì)胞。軟骨膜細(xì)胞的初代培養(yǎng)
將由上述得到的軟骨膜細(xì)胞在Dulbecco， Modified Eagls，sMedium/Nutrient Mixture Rl2 (DMEM/F12)與10%胎牛血清(FBS)中于37tTF進(jìn)行平板培養(yǎng)，培養(yǎng)基每周換2次。2周以內(nèi)細(xì)胞增殖并密集，將其用于繼代培養(yǎng)。7-10天細(xì)胞增殖并密集。繼代培養(yǎng)至少可以持續(xù)6個(gè)月。
軟骨膜細(xì)胞向軟骨的分化
a) 將軟骨膜細(xì)胞進(jìn)行離心(在1500rpm/5min下2次)，使其沉淀，形成細(xì)胞塊，將該細(xì)胞塊在含有5ng/ml的胰島素樣生長因子-r (IGF-1)、5ng/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、 40ng/ml的地塞米松、30 60jig/ml的L-抗壞血酸、1%抗生素-抗真菌溶液(Antibiotic antimicoticsolution) 、 1% Insulin- Transferrin- Serine (ITS)的DMEM/F12的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-4周。將所得到的白色用阿辛蘭染色，此時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)染成藍(lán)色，提示存在作為軟骨標(biāo)記的軟骨可聚蛋白多糖。與用相同的方法得到的軟骨細(xì)胞形成的細(xì)胞塊相比，基本相同(圖2)。
軟骨細(xì)胞使用剝離器等鈍器釆集。然后，通過離心(在1500rpm/5min下2次)使其沉淀，形成細(xì)胞塊。將細(xì)胞塊在含有5ng/ml的胰島素樣生長因子-l(IGF-l)、 5ng/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、 40ng/ml的地塞米松、30 60ing/ml的L-抗壞血酸、1%抗生素-抗真菌溶液、1% Insulin-Transferrin' Serine(ITS)的DMEM/F12的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-4周。
b) 在平板培養(yǎng)的密集狀態(tài)的軟骨膜細(xì)胞上進(jìn)一步接種軟骨膜細(xì)胞。培養(yǎng)基使用在DMEM/F12中含有10。/。FBS與l。/?？股?抗真菌溶液的培養(yǎng)基，或在DMEM/F12中含有10。/。FBS、 1%抗生素-抗真菌溶液、5ng/ml的IGF-l、5ng/ml的bFGF、 40ng/ml的地塞米松的培養(yǎng)基。
使用后者的培養(yǎng)基，將培養(yǎng)第1周的細(xì)胞和培養(yǎng)第3周的軟骨膜細(xì)胞及軟骨細(xì)胞進(jìn)行阿辛蘭染色(圖3,4)、逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(Reversetranscription-Polymerase chain Reaction) (RT-PCR)(圖5)以及定量PCR(圖6)，進(jìn)行比較。在福爾馬林固定后基于組織切片進(jìn)行阿辛蘭染色。結(jié)果，在阿辛蘭染色中，細(xì)胞皿上被染色為藍(lán)色。用于RT-PCR與定量PCR時(shí)，
18由軟骨膜細(xì)胞與散骨細(xì)胞提取RNA。 RNA的提取使用RAeasy(QIAGEN公司)，根據(jù)其操作規(guī)程進(jìn)行。由所得的RNA，使用腦APCRkit(Takara公司)得至IJcDNA。 RT-PCR的引物為I型膠原F: atgctcagctttgtggatacgcgg(序列號(hào)l)、R: aggaaagccacgagcaccctgtgg(序歹U號(hào)2)、II型月交原F: catcattgacattgcacccatg(序列號(hào)3)、 R: ttagtttcctgtctctgccttg (序列號(hào)4)、軟骨可聚蛋白多糖F:caggtgaagactttgtggacatcc(序列號(hào)5) 、 R: cctcctcaaaggtcagcgagtagc(序歹!j號(hào)6)。另外，定量PCR的引物使用Taqman Gene Expression Assays(由生物系統(tǒng)公司提供(Applied Biosystems))的I型膠原Hs00266273一ml， II型膠原:HsOO 164099—ml，軟骨可聚蛋白多糖Hs00202971—ml。
結(jié)果提示，作為軟骨膜標(biāo)記的i型膠原減少，作為軟骨標(biāo)記的n型膠原
增加，軟骨膜細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞。另外，采集細(xì)胞皿的上清，使用Blyscan(Biocolor公司)，用酶免疫領(lǐng)!j定法(ELISA: Enzyme Linked Immuno sorbent
Assay)定量測定軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白聚糖，結(jié)果顯示軟骨膜細(xì)胞具有與軟骨細(xì)胞同等的蛋白聚糖產(chǎn)生能力(圖7)。
由以上內(nèi)容提示，軟骨膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化未出現(xiàn)較大差異，軟骨膜細(xì)胞具有與軟骨細(xì)胞基本同等的軟骨分化能力。
軟骨膜細(xì)胞的移植
通過細(xì)胞鏟(Cell lifter)回收由上述培養(yǎng)b得到的細(xì)胞，移植于重癥免疫功能不全小鼠(三協(xié)、日本)的背部皮下。2個(gè)月后采集，進(jìn)行組織學(xué)研究。為了將采集的組織進(jìn)行組織學(xué)研究，薄切，制作組織標(biāo)本。相對(duì)于此，為了將作為軟骨組織特有的基質(zhì)的蛋白聚糖染色而進(jìn)行阿辛蘭染色。另
外，對(duì)覆蓋作為軟骨組織的基質(zhì)的n型膠原與軟骨周圍的i型膠原進(jìn)行免疫
染色。結(jié)果，軟骨組織的細(xì)胞外基質(zhì)經(jīng)阿辛蘭染色染成藍(lán)色，提示存在作為軟骨標(biāo)記的蛋白聚糖(圖8)。另外，軟骨組織的細(xì)胞外基質(zhì)被II型膠原染色，軟骨周圍組織被I型膠原染色(圖9)。因此，確認(rèn)移植培養(yǎng)得到的軟骨膜細(xì)胞，形成軟骨組織。
比較體外的軟骨膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞的菌落
對(duì)所得的軟骨膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞進(jìn)行菌落分析。將各細(xì)胞在35mm邊緣設(shè)計(jì)型(EASY GRIP)細(xì)胞培養(yǎng)皿中調(diào)整成l cells/cn^進(jìn)行接種。使用含有10%胎牛血清(fetal bovine serum) 、 1%抗生素-抗真菌溶液的 Dulbecco，s modified Eagle medium and Ham's F-12 medium, 在氣相條件設(shè) 定為37X:、 002濃度為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞。從接種24小時(shí)后每3天進(jìn) 行l(wèi)次培養(yǎng)基更換。培養(yǎng)1個(gè)月后，在顯微鏡下確認(rèn)形成的菌落，拍攝照片。 結(jié)果，軟骨膜細(xì)胞的菌落比軟骨細(xì)胞的菌落大(圖12)。
比較人軟骨膜細(xì)胞、軟骨膜-軟骨過渡部細(xì)胞、軟骨細(xì)胞的菌落形成能
力
對(duì)所得的軟骨膜細(xì)胞、軟骨膜-軟骨過渡部細(xì)胞、軟骨細(xì)胞進(jìn)行菌落分 析。將各細(xì)胞在35mm邊緣設(shè)計(jì)型細(xì)胞培養(yǎng)皿中調(diào)整成52cells/cm2，進(jìn)行接 種。使用含有10%胎牛血清、1%抗生素-抗真菌溶液的Dulbecco's modified Eagle medium and Ham's F-12 medium,在氣相條件設(shè)定為37。C 、 (302濃度 為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞。在接種24小時(shí)后每3天進(jìn)行1次培養(yǎng)基交換。培 養(yǎng)14天后，計(jì)數(shù)菌落數(shù)。以50個(gè)以上的細(xì)胞基團(tuán)作為1個(gè)菌落。比較菌落 數(shù)的結(jié)果表明，按照軟骨膜細(xì)胞、軟骨膜-軟骨過渡部細(xì)胞、軟骨細(xì)胞的順 序，具有高菌落形成能力(圖13)。
*: p < 0.001 (Mann Whitney U-test with Bonferroni correction) n=27 (patient No尸3)。 比較人軟膜、軟骨-軟骨膜過渡部、軟骨細(xì)胞的長期增殖能力
對(duì)所得的軟骨膜細(xì)胞、軟骨膜-軟骨過渡部細(xì)胞、軟骨細(xì)胞研究長期的 增殖能力。將各細(xì)胞在35mm邊緣設(shè)計(jì)型細(xì)胞培養(yǎng)皿中以120 cells/cn^進(jìn) 行接種。使用含有10%胎牛血清、1%抗生素-抗真菌溶液的Dulbecco，s modified Eagle medium and Ham's F-12 medium, 在氣相條件設(shè)定為37。C 、 。02濃度為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞。在接種24小時(shí)后每3天進(jìn)行1次培養(yǎng)基 交換。培養(yǎng)約14天后，細(xì)胞形成匯合，使用含有0.2。/。膠原酶型II的Hank's 平衡鹽溶液剝離細(xì)胞，使用血細(xì)胞計(jì)算板，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)后，在35mm邊緣 設(shè)計(jì)型細(xì)胞培養(yǎng)皿中以1200 cells/cn^接種。反復(fù)進(jìn)行該操作。經(jīng)182天進(jìn) 行14繼代，結(jié)果確認(rèn)軟骨膜細(xì)胞比軟骨膜-軟骨過渡部細(xì)胞或軟骨細(xì)胞具有 明顯更高的增殖能力(圖14)。另外，確認(rèn)軟骨膜-軟骨過渡部細(xì)胞具有比軟 骨細(xì)胞高的增殖能力(圖14)。*: P< 0.001 (Mann Whitney U-Test with Bonferroni correction) n=5(patient No,=5)
在體外向脂肪與骨的分化誘導(dǎo)
將軟骨膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞分化為骨與脂肪的分化誘導(dǎo)進(jìn)行3周。骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基使用hMSC Osteogenic SingleQuots(注冊(cè)商標(biāo))。脂肪分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基使用hMSC Adipogenic induction SingleQuots(注冊(cè)商標(biāo))。結(jié)果，軟骨膜細(xì)胞形成脂肪滴，被OilredO染色，軟骨細(xì)胞未形成脂肪滴(圖15A)。進(jìn)而，軟骨膜細(xì)胞可見大量Ca沉積，被茜素紅染色，而軟骨細(xì)胞未見Ca沉積，未被茜素紅染色(圖15B)。
在體外向軟骨分化誘導(dǎo)
利用重迭培養(yǎng)將導(dǎo)軟骨膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)為軟骨細(xì)胞。將各細(xì)胞調(diào)整為2.5xl0、dls/cm2，進(jìn)行接種。培養(yǎng)7天后，使用含有0.2%膠原酶型II的Hank's平衡鹽溶液，剝離細(xì)胞。然后，將細(xì)胞調(diào)節(jié)為2.5xl0Vells/cm2，在培養(yǎng)7天后的細(xì)胞上重迭，進(jìn)行接種。使用含有10%胎牛血清、1%抗生素-抗真菌溶液的Dulbecco's modified Eagle medium andHam's F-12 medium培養(yǎng)直至接種后48小時(shí)，48小時(shí)后使用含有10%胎牛血清、1%抗生素-抗真菌溶液、L-抗壞血酸2-磷酸酯、地塞米松、胰島素樣生長因子-1、堿性成纖維細(xì)胞生長因子的Dulbecco's modified Eaglemedium and Ham's F-12 medium進(jìn)行培養(yǎng)。使用該培養(yǎng)基培養(yǎng)4天后，進(jìn)一步在培養(yǎng)基上接種2.5xl0、dls/cr^的細(xì)胞，同樣進(jìn)行培養(yǎng)。每周進(jìn)行該操作計(jì)2次。在氣相條件設(shè)定為37"C、 (302濃度為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每3天進(jìn)行1次培養(yǎng)基更換。在該操作中每1周進(jìn)行組織學(xué)研究至3周。結(jié)果，在細(xì)胞皿上軟骨膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞同樣地被阿辛蘭染色，被II型膠原染色(圖16A,B)。
在體內(nèi)由人軟骨膜、軟骨細(xì)胞再生的軟骨組織的組織學(xué)研究用Cdl lifter剝離使用分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基分化誘導(dǎo)為軟骨的來自軟骨膜細(xì)胞與來自軟骨細(xì)胞的軟骨細(xì)胞。剝離的細(xì)胞回收于安裝有23G注射針(泰爾茂、都市名Japan)的2.5ml注射器(泰爾茂、Japan)。在進(jìn)行了背部除毛的重癥免疫功能不全小鼠(三協(xié)、日本)的背部皮下注入平均lml注射器內(nèi)的細(xì)胞，進(jìn)行移植。移植后，在第1個(gè)月與第3個(gè)月進(jìn)行摘出，進(jìn)行組織學(xué)研究。
分別進(jìn)行蘇木素-伊紅、阿辛蘭、ElasticavanGieson、 I型、II型膠原的染色。 結(jié)果，來自軟骨膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞的組織均被阿辛蘭、ElasticavanGieson 染色(圖17A,B均為B，C,F,G)。并且，來自軟骨膜細(xì)胞的組織被I型膠原、II 型膠原染色(圖17A，B均為D)。另一方面，來自軟骨細(xì)胞的組織被II型膠原 染色，但未被I型膠原染色(圖17A,B均為H)。 在體內(nèi)再構(gòu)成的軟骨的每lmi^的細(xì)胞數(shù)
計(jì)測上述在體內(nèi)由人軟骨膜、軟骨細(xì)胞再生的軟骨組織的組織學(xué)研究 得到的移植后第l個(gè)月與第3個(gè)月摘出的組織軟骨部中每lmn^的細(xì)胞數(shù)。 來自軟骨膜細(xì)胞的組織在移植后第l個(gè)月、第3個(gè)月均未見細(xì)胞數(shù)變化，相 對(duì)于此，來自軟骨細(xì)胞的組織在移植后第3個(gè)月可見細(xì)胞數(shù)減少(圖18)。
*: p<0.05、 **: p < O.Ol(Mann Whitney U-Test)
人自身血清的制作方法
使用人自身血清，其如下得到將由采集了軟骨的同一患者得到的人
自身血液在室溫下靜置20分鐘后，以3000轉(zhuǎn)離心分離I0分鐘，將上清部分 作為人自身血清回收。培養(yǎng)中在37'C下固定30分鐘，用0.45pm的過濾器過 濾滅菌，使用人自身血清。
比較10%人自身血清培養(yǎng)基得到的人軟骨膜細(xì)胞、軟骨膜-軟骨過渡部 細(xì)胞、軟骨細(xì)胞的菌落形成能力
對(duì)于所得的軟骨膜細(xì)胞、軟骨膜-軟骨過渡部細(xì)胞、軟骨細(xì)胞，進(jìn)行菌 落分析。將各細(xì)胞調(diào)整成每個(gè)35mm邊緣設(shè)計(jì)型細(xì)胞培養(yǎng)皿為500cells進(jìn) 行接種。使用含有10%人自身血清、1%抗生素-抗真菌溶液的Dulbecco，s modified Eagle medium and Ham's F-12 medium, 在氣相條件設(shè)定為37。C 、 (302濃度為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞。從接種24小時(shí)后每7天進(jìn)行1次培養(yǎng)基 交換。培養(yǎng)9天后，拍攝菌落的照片(圖19)。與人軟骨細(xì)胞比較，人軟骨膜 細(xì)胞在培養(yǎng)第9天形成較大的菌落。
在顯微鏡下比較用10%人自身血清得到的人軟骨膜細(xì)胞、軟骨膜-軟骨 過渡部細(xì)胞、軟骨細(xì)胞
對(duì)于所得的軟骨膜細(xì)胞、軟骨膜'軟骨過渡部細(xì)胞、軟骨細(xì)胞，將各細(xì)胞調(diào)整成24孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔為5000cells進(jìn)行接種。使用含有10%人自 身血清、1%抗生素-抗真菌溶液的Dulbecco，s modified Eagle medium and Ham's F-12 medium,在氣相條件設(shè)定為37。C、 <:02濃度為5%的培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)細(xì)胞。在接種24小時(shí)后每3天進(jìn)行1次培養(yǎng)基交換。培養(yǎng)10天后，拍攝 照片(圖20)。與10%牛血清培養(yǎng)基比較，在10%人自身血清培養(yǎng)基中的各細(xì) 胞更快地形成匯合。
本說明書中所引用的所有出版物、專利與專利申請(qǐng)直接作為參考引用 入本說明書中。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性
通過本發(fā)明，使人軟骨膜細(xì)胞增殖'分化，能培養(yǎng)人軟骨細(xì)胞。進(jìn)而， 通過離心管培養(yǎng)、將人軟骨膜細(xì)胞用膠原凝膠等進(jìn)行的三維培養(yǎng)或重迭培 養(yǎng)，可以得到人軟骨細(xì)胞塊。另外，將所得的人軟骨細(xì)胞塊直接或包埋在 膠原凝膠等軟骨治療材料中，進(jìn)行移植，由此可以用于與軟骨相關(guān)的疾病 (例如先天性耳廓奇形、肋軟骨缺損、變形性膝關(guān)節(jié)癥等關(guān)節(jié)軟骨損傷(例 如變形性膝關(guān)節(jié)癥)、氣管軟骨缺損等)。另外，在用于改善在美容整形領(lǐng) 域中的審美的治療、例如隆鼻術(shù)、頦成形術(shù)、面部的小凹陷成形術(shù)、面部 左右不對(duì)稱的矯正術(shù)、眼瞼周圍的矯正術(shù)或面部的美容整形術(shù)的軟骨移植 的治療中也有用。
配列表free text 〈序列號(hào)1〉
序列號(hào)1表示I型膠原的RT-PCR正向引物的堿基序列。 〈序列號(hào)2〉
序列號(hào)2表示I型膠原的RT-PCR反向引物的堿基序列。 〈序列號(hào)3〉
序列號(hào)3表示II型膠原的RT-PCR正向引物的堿基序列。 〈序列號(hào)4〉
序列號(hào)4表示II型膠原的RT-PCR反向引物的堿基序列?！葱蛄刑?hào)5〉
序列號(hào)5表示軟骨可聚蛋白多糖的RT-PCR正向引物的堿基序列。 〈序列號(hào)6〉
序列號(hào)6表示軟骨可聚蛋白多糖的RT-PCR反向引物的堿基序列。
權(quán)利要求
1、一種細(xì)胞，其是來自人軟骨膜組織的細(xì)胞，能分化為軟骨細(xì)胞。
2、 如權(quán)利要求l所述的細(xì)胞，其中，人軟骨膜組織包括最外層與成纖維細(xì)胞層。
3、 如權(quán)利要求l所述的細(xì)胞，其中，人軟骨膜組織包括最外層、成纖維細(xì)胞層和最內(nèi)層。
4、 權(quán)利要求l所述的細(xì)胞的制備方法，包括培養(yǎng)從人軟骨膜組織分離的細(xì)胞的步驟。
5、 一種組合物，其含有權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞。
6、 如權(quán)利要求5所述的組合物，其中，所述組合物用于使下述的細(xì)胞增殖，所述細(xì)胞來自人軟骨膜組織，并能分化為軟骨細(xì)胞。
7、 如權(quán)利要求5所述的組合物，其中，所述組合物用于制備人軟骨細(xì)胞。
8、 如權(quán)利要求5所述的組合物，其中，所述組合物用于細(xì)胞移植。
9、 如權(quán)利要求8所述的組合物，其中，細(xì)胞移植的目的在于治療先天性耳廓畸形、治療肋軟骨缺損、治療關(guān)節(jié)軟骨損傷、治療氣管軟骨缺損、隆鼻術(shù)、頦成形術(shù)、面部的小凹陷成形術(shù)、面部左右不對(duì)稱的矯正術(shù)、眼瞼周圍的矯正術(shù)或面部的美容整形術(shù)中的任一種。
10、 如權(quán)利要求5 9中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述組合物還含有權(quán)利要求l所述的細(xì)胞所產(chǎn)生的基質(zhì)。
11、 如權(quán)利要求5 10中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述組合物還含有支架。
12、 一種軟骨細(xì)胞的制備方法，其中，包括使權(quán)利要求l所述的細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的步驟。
13、 如權(quán)利要求12所述的方法，其中，通過離心管培養(yǎng)權(quán)利要求l所述的細(xì)胞來形成細(xì)胞塊。
14、 如權(quán)利要求12所述的方法，其中，利用平板培養(yǎng)將權(quán)利要求l所述的細(xì)胞重迭。
15、 如權(quán)利要求12 14中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在含有血清的培養(yǎng)基中使權(quán)利要求l所述的細(xì)胞增殖和/或分化。
16、 如權(quán)利要求15所述的方法，其中，血清為牛血清。
17、 如權(quán)利要求15所述的方法，其中，血清為自身血清。
18、 如權(quán)利要求12 17中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在含有DEME/F12、血清、抗生素以及抗真菌劑的培養(yǎng)基中使權(quán)利要求l所述的細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞。
19、 如權(quán)利要求18所述的方法，其中，培養(yǎng)基還含有地塞米松和/或L-抗壞血酸。
20、 如權(quán)利要求18或19所述的方法，其中，培養(yǎng)基還含有胰島素樣生長因子和/或堿性成纖維細(xì)胞生長因子。
21、 一種軟骨細(xì)胞，其是由權(quán)利要求12 20中任一項(xiàng)所述的方法制備而成的。
22、 一種組合物，其含有權(quán)利要求21所述的軟骨細(xì)胞和/或該細(xì)胞所形成的軟骨組織。
23、 如權(quán)利要求22所述的組合物，其用于移植治療。
24、 如權(quán)利要求23所述的組合物，其中，移植治療的目的在于治療先天性耳廓畸形、治療肋軟骨缺損、治療關(guān)節(jié)軟骨損傷、治療氣管軟骨缺損、隆鼻術(shù)、頦成形術(shù)、面部的小凹陷成形術(shù)、面部左右不對(duì)稱的矯正術(shù)、眼瞼周圍的矯正術(shù)或面部的美容整形術(shù)中的任一種。
25、 如權(quán)利要求22 24中任一項(xiàng)所述的組合物，其中， 所述組合物還含有權(quán)利要求21所述的軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的基質(zhì)。
26、 如權(quán)利要求22 25中任一項(xiàng)所述的組合物，其中， 所述組合物還含有支架。
27、 一種方法，其將權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞移植到生物體內(nèi)。
28、 一種方法，其將權(quán)利要求21所述的軟骨細(xì)胞和/或該細(xì)胞所形成的 軟骨組織移植到生物體內(nèi)。
29、 權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞在細(xì)胞移植中的應(yīng)用。
30、 權(quán)利要求21所述的軟骨細(xì)胞和/或該細(xì)胞所形成的軟骨組織在移植 治療中的應(yīng)用。
31、 軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的基質(zhì)的制備方法，其包括使權(quán)利要求l所述的細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的步驟以及使該軟骨 細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)的步驟。
32、 如權(quán)利要求31所述的方法，其中， 所述基質(zhì)為II型膠原和/或蛋白聚糖。
全文摘要
本發(fā)明由軟骨膜細(xì)胞制備軟骨細(xì)胞。一種細(xì)胞，其是來自于軟骨膜組織的細(xì)胞，能分化為軟骨細(xì)胞。本發(fā)明提供所述細(xì)胞的制備方法與組合物。另外，本發(fā)明還提供軟骨細(xì)胞的制備方法和用于該方法的培養(yǎng)基。
文檔編號(hào)C12N5/00GK101657536SQ20088000277
公開日2010年2月24日 申請(qǐng)日期2008年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月23日
發(fā)明者小林真司, 谷口英樹 申請(qǐng)人:公立大學(xué)法人橫浜市立大學(xué)