專利名稱：診斷、治療和預(yù)防前列腺疾病的組合物和方法
診斷、治療和預(yù)防前列腺疾病的組合物和方法引用的相關(guān)申請本申請要求2007年1月16日提交的美國臨時申請第60/885，142號的權(quán)益，特此 通過引用將其整體并入本文。
背景技術(shù)：
目前基于烷化劑、抗代謝物以及天然產(chǎn)物的抗癌化學(xué)療法在作用機(jī)制上是異質(zhì) 的。因此，大多數(shù)抗癌化學(xué)療法也對抗正常細(xì)胞，因而對患者產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用和毒性。突變的聚積以及細(xì)胞調(diào)控機(jī)能的喪失導(dǎo)致正常組織向早期癌前期(early pre-cancer)的漸進(jìn)性表型轉(zhuǎn)變，如上皮內(nèi)瘤變(intra印ithelialneoplasia，IEN)轉(zhuǎn)變?yōu)?日益嚴(yán)重的IEN、淺表性腫瘤(superficial cancer)并最終轉(zhuǎn)變?yōu)榍秩胄约膊　１M管在某 些情況下這種過程可以是相對迅速的，但通常它在數(shù)年內(nèi)甚至數(shù)十年內(nèi)相對緩慢地發(fā)生。 致癌基因依賴(oncogene addiction)是癌細(xì)胞為了維持惡性表型對單個致癌基因持續(xù)活 化或過度表達(dá)的生理依賴。這種依賴發(fā)生于標(biāo)志瘤變進(jìn)展的其他變化的環(huán)境中。癌癥化學(xué)預(yù)防定義為在癌前期狀態(tài)甚至更早對癌癥的預(yù)防或治療。向侵入性癌發(fā) 展的長時程對科學(xué)而言是主要機(jī)會，但從經(jīng)濟(jì)角度而言，也是顯示候選化學(xué)預(yù)防藥物臨床 效果的障礙。因此，近年來化學(xué)預(yù)防劑研發(fā)的重要部分已是鑒定可準(zhǔn)確地預(yù)測藥劑的臨床 效果或降低癌癥發(fā)生率作用的較早(癌前)終點(diǎn)(end point)或生物標(biāo)記。在許多癌癥中， IEN是早期終點(diǎn)，如在前列腺中。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的目的，如本文所具體表達(dá)和廣泛敘述的，本發(fā)明涉及診斷、預(yù)防和治 療前列腺癌和前列腺上皮內(nèi)瘤變(prostateintra印ithelial neoplasia,PIN)的組合物和 方法。公開的方法和組合物的其他優(yōu)勢將在所采用的說明書中部分地提出，并根據(jù)說明 書得以部分地理解，或者通過實(shí)施公開的方法和組合物得以領(lǐng)會。公開的方法和組合物的 優(yōu)勢通過在附加的權(quán)利要求書中特別指出的要素和組合將得以實(shí)現(xiàn)和獲得。可以理解的 是，前文的一般性描述以及下文的詳細(xì)描述僅是示例性和解釋性的，不是限制請求保護(hù)的 本發(fā)明。附圖簡要說明附圖并入并組成了本發(fā)明的一部分，其圖示公開的方法和組合物的幾個實(shí)施方案 以及描述，作用是解釋公開的方法和組合物的原理。圖 1 表示 β -防衛(wèi)素-1 (DEFBl)表達(dá)的定量 RT-PCR(quantitativeRT_PCR， QRT-PCR)分析。為了證明DEFBl表達(dá)的誘導(dǎo)，進(jìn)行QRT-PCR。圖IA表示與來自經(jīng)歷了前列 腺根治術(shù)(radicalprostatectomies)的6位患者的臨床樣品相比，DEFBI的相對表達(dá)水平。 圖IB表示DEFBI誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后，與在良性和惡性前列腺臨床樣品、hPrEC細(xì)胞、前列腺癌 細(xì)胞相比，DEFBl的相對表達(dá)水平。圖IC表示在單個組織切片的良性組織、惡性組織以及 前列腺上皮內(nèi)瘤變(PIN)中分析的DEFBI相對表達(dá)水平。圖ID表示與良性組織中發(fā)現(xiàn)的 平均DEFBl表達(dá)水平相比，在一患者良性組織、惡性組織以及PIN中的DEFBl表達(dá)。
5
圖2表示DEFBl誘導(dǎo)的膜完整性和細(xì)胞形態(tài)變化的顯微鏡分析。DEFBl誘導(dǎo)48小 時后，利用相差顯微鏡方法分析DU145、PC3以及LNCaP的細(xì)胞形態(tài)。黑箭頭表示膜邊緣波 動，白箭頭表示凋亡小體。圖3表示DEFBl在前列腺癌細(xì)胞中的細(xì)胞毒性分析。用PonA處理前列腺細(xì)胞系 DU145、PC3以及LNCaP，誘導(dǎo)DEFBl表達(dá)1_3天，之后進(jìn)行MTT測定，測定細(xì)胞活力。結(jié)果表 示為平均值士s. d.，η = 9。圖4表示DEFBl對DU145和PC3細(xì)胞的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)。在前列腺癌細(xì)胞系DU145 (A) 以及PC3 (B)中誘導(dǎo)DEFBl表達(dá)，隨后進(jìn)行膜聯(lián)蛋白V (Annexin V) /FITC/碘化丙啶染色和 流式細(xì)胞術(shù)分析。對碘化丙啶和膜聯(lián)蛋白V陽性的細(xì)胞被認(rèn)為是凋亡的細(xì)胞。將誘導(dǎo)的時 間顯示于每一面板的下面。鄰近框的每一時間點(diǎn)的數(shù)字表示碘化丙啶(PI) —膜聯(lián)蛋白V+細(xì) 胞(較低的右側(cè)象限)以及PI+膜聯(lián)蛋白V+細(xì)胞(右上象限)的百分比。數(shù)據(jù)來自代表三 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的單次實(shí)驗(yàn)。圖5表示DEFBl誘導(dǎo)后的泛半胱氨酸天冬氨酸酶(pan-caspase)分析。用 FAM-VAD-FMK標(biāo)記的氟甲基甲酮(fluoromethyl ketone)染色DU145和PC3細(xì)胞，以便檢測 半胱氨酸天冬氨酸酶活性。對于每一條件，細(xì)胞在DIC下是可視的。共聚焦顯微鏡分析表 明，在對照DU145(B)、PC3細(xì)胞(F)以及LNCaP(J)中無半胱氨酸天冬氨酸酶染色。用PonA 處理24小時以誘導(dǎo)DEFBl的細(xì)胞在DU145(D)和PC3 (H)中顯示出半胱氨酸天冬氨酸酶活 性。在LNCaP(L)中未檢測到半胱氨酸天冬氨酸酶活性。圖6表示？六乂28丨1 ^處理后，配對盒同源異形基因2化3化6(113( 11011160衍0 gene, PAX2)蛋白表達(dá)的沉默。圖6A表示用PAX2siRNA雙鏈體在O天(泳道1)、2天(泳道2)以 及4天(泳道3)轉(zhuǎn)染的PC3和DU145細(xì)胞的Western印跡分析。圖6B表示用PAX2siRNA 雙鏈體在O天(泳道1)、2天(泳道2)、4天(泳道2)以及6天(泳道4)轉(zhuǎn)染的PC3和 DU145細(xì)胞的Western印跡分析。PAX2蛋白在DU145細(xì)胞中最早處理4天后(泳道3)以 及在PC3中最早處理6天后是檢測不到的。將印跡洗脫并再次探查β肌動蛋白，作為內(nèi)部 對照。圖7顯示了用PAX2siRNA處理后前列腺癌細(xì)胞生長的分析。在存在正常生長培養(yǎng) 基的情況下，第6天的DU145、PC3以及LNCaP的相差顯微鏡分析。用陰性對照siRNA處理 對細(xì)胞沒有作用。然而，用PAX2siRNA處理后，所有三個系的細(xì)胞數(shù)目都顯著減少。圖8表示PAX2的siRNA沉默后細(xì)胞死亡分析。用四種PAX2siRNA或四種非特異 性對照siRNA的混合物將前列腺癌細(xì)胞系PC3、DU145以及LNCaP處理2、4或6天，其后進(jìn) 行MTT測定，測定細(xì)胞活力。結(jié)果表示為平均值士s. d.，η = 9。圖9表示半胱氨酸天冬氨酸酶活性分析。用羧基熒光素標(biāo)記的氟甲基甲酮使 DU145、PC3以及LNCaP細(xì)胞染色，以便檢測用PAX2siRNA處理后的半胱氨酸天冬氨酸酶活 性。未處理的細(xì)胞以及處理的細(xì)胞的共聚焦顯微鏡分析表明，用DIC細(xì)胞是可視的。熒光 分析在對照DU145 (B)、PC3細(xì)胞(F)和LNCaP細(xì)胞(J)中未顯示半胱氨酸天冬氨酸酶活性。 然而用PAX2siRNA處理的細(xì)胞在DU145 (D)、PC3 (H)和LNCaP (L)中誘導(dǎo)了半胱氨酸天冬氨 酸酶活性。

圖10表示PAX2siRNA處理后凋亡因子分析。在未處理的對照細(xì)胞以及用 PAX2siRNA處理6天的細(xì)胞中比較促凋亡因子表達(dá)的變化。圖IOA表示Bcl_2相關(guān)的X蛋白(Bcl-2-associated X protein, ΒΑΧ)的表達(dá)水平在 DU145、PC3 以及 LNCaP 中增加。圖 IOB 表示 ΒΗ3 相互作用結(jié)構(gòu)域死亡激動劑(BH3interacting domain death agonist, BID) 的表達(dá)在DU145和LNCaP中增加，但在PC3中沒有增加。圖IOC表示Bcl_2相關(guān)死亡啟動 子(Bcl-2-associated death promoter, BAD)的表達(dá)水平在所有三個細(xì)胞系中都增加。圖11表示與DNA識別序列結(jié)合的PAX2模型。PAX2轉(zhuǎn)錄抑制劑與CCTTG (SEQ ID NO 1)識別位點(diǎn)結(jié)合，該識別位點(diǎn)鄰近于防止轉(zhuǎn)錄和DEFBl蛋白表達(dá)的DEFB1TATA盒。PAX2 蛋白表達(dá)的抑制使正常的DEFBl得以表達(dá)。圖12示例了 DEFBl報道子構(gòu)建體。將由mRNA起始位點(diǎn)上游的最初160個堿基組 成的DEFBl啟動子從DU145細(xì)胞中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并連接于pGL3熒光素酶報道子質(zhì)粒中。圖13表示PAX2的抑制導(dǎo)致DEFBl表達(dá)。用PAX2siRNA處理LNCaP和PHrEC 48 小時。處理前的QRT-PCR分析表明，在DU145、PC3以及LNCaP中無DEFBl表達(dá)。然而，處理 后，在所有的細(xì)胞系中，重建DEFBl表達(dá)。無PAX2的HprEC用siRNA處理后，DEFBl表達(dá)無 變化。圖14表示PAX2的抑制導(dǎo)致DEFBl啟動子活性增加。產(chǎn)生PC3啟動子/pGL3構(gòu)建 體和DU145啟動子/pGL3構(gòu)建體，并分別轉(zhuǎn)染至PC3和DU145細(xì)胞內(nèi)。在通過siRNA處理 抑制PAX2之前和之后，比較啟動子的活性。處理后，DEFBl啟動子的活性在DU145中提高 了 2. 65倍，在PC3中提高了 3. 78倍。圖15表示與DEFBl啟動子結(jié)合的PAX2的ChIP分析。對DU145和PC3細(xì)胞進(jìn)行 ChIP分析。用抗PAX2抗體免疫沉淀后，進(jìn)行PCR以檢測包含GTTCC PAX2識別位點(diǎn)的DEFBl 啟動子區(qū)域。這證明，PAX2轉(zhuǎn)錄抑制劑在前列腺癌細(xì)胞系中與DEFBl啟動子結(jié)合。圖16表示用DNA預(yù)測的PrdPD和PrdHD的結(jié)構(gòu)。與DNA結(jié)合的PrdPD (Xu et al.， 1995)以及與DNA結(jié)合的PrdHD(WiIson et al.，1995)的結(jié)構(gòu)等同物用于構(gòu)建兩個結(jié)構(gòu)域 的模型，因?yàn)樗鼈兣cPHO位點(diǎn)結(jié)合。單個結(jié)合位點(diǎn)以所示的特定方位彼此鄰接?；赑rdPD 的晶體結(jié)構(gòu)定位RED結(jié)構(gòu)域。圖17表示不同的成對結(jié)構(gòu)域的共有序列的比較。在該圖的頂端是Prd成對結(jié)構(gòu) 域士DNA復(fù)合物的晶體學(xué)分析所述的蛋白士DNA接觸的圖示。空框表示a螺旋，陰影框表 示b-折疊，實(shí)線表示b-反轉(zhuǎn)。單字母代碼表示接觸的氨基酸。僅顯示了直接的氨基酸士 堿基接觸?？招沫h(huán)表示大溝接觸，而紅色箭頭表示小溝接觸。針對成對結(jié)構(gòu)域蛋白的所有 已知共有序列，排列該圖(僅顯示了上游鏈)。共有序列之間的垂直線表示保守的堿基對。 位置的編號顯示于該圖的底部。圖18表示作為化學(xué)預(yù)防策略的靶向PAX2。異常PAX2的表達(dá)是癌癥開始和進(jìn)展的 早期事件。發(fā)育異?；蚱渌陌┣半A段過程中PAX2的抑制可用于預(yù)防癌癥。圖19表示血管緊張肽II (Ang II)對DU145細(xì)胞中PAX2表達(dá)的影響。為了測定 Ang II對PAX2表達(dá)的作用，處理后，監(jiān)測DEFB 1蛋白水平。在此PAX2表達(dá)水平早在4個 小時增加并持續(xù)48小時。圖20表示氯沙坦(Losartan，Los)對DU145內(nèi)PAX2表達(dá)的影響。用血管緊張 肽II 1型受體(angiotensin II type lreceptor, ATR1)阻斷劑氯沙坦處理DU145細(xì)胞。 QRT-PCR表明，處理后，PAX2信息水平降低了至少一半。圖20B表示血管緊張肽II 2型受 體(angiotensin II type 2rec印tor，ATR2)阻斷劑對 DU145 內(nèi) PAX2 表達(dá)的作用。為了測定ATR2受體對PAX2表達(dá)的作用，用ATR2受體阻斷劑PD123319處理DU145細(xì)胞。在此， PAX2的表達(dá)增加了 7-8倍。圖21表示Los阻斷AngII對DU145中PAX2表達(dá)的影響。用5 μ MAngII處理DU14572 小時，導(dǎo)致ΡΑΧ2的表達(dá)增加2倍。另外，用10 μ M處理72小時，導(dǎo)致表達(dá)增加3倍多。用 5 μ M氯沙坦處理細(xì)胞抑制增殖50%。另外在用AngII處理前用氯沙坦處理30分鐘，阻斷 了 AngII對增殖的作用。圖22表示AngII增加了 DU145細(xì)胞的增殖。用5μΜ AngII處理DU145細(xì)胞72 小時，導(dǎo)致增殖增加2倍。另外，用10 μ M處理72小時，導(dǎo)致增殖增加3倍多。圖23表示Los以及MAP激酶抑制劑對DU145細(xì)胞中PAX2表達(dá)的影響。圖23A表 示用氯沙坦處理DU145細(xì)胞抑制磷-ERK 1/2和PAX2表達(dá)；圖23B表示MEK激酶抑制劑和 AICAR抑制PAX2蛋白表達(dá)；圖23C表示MEK激酶抑制劑和氯沙坦抑制磷-STAT3蛋白表達(dá)。圖24表示Los和MEK激酶抑制劑對DU145細(xì)胞中PAX2活化的影響。圖24A表示 用ATlR信號抑制劑處理DU145細(xì)胞導(dǎo)致磷-PAX2蛋白水平降低，磷-PAX2蛋白是PAX2的 活性形式。另外，用AMP激酶誘導(dǎo)劑AICAR處理導(dǎo)致PAX2表達(dá)抑制。圖24B表示以Los降 低的磷-JNK水平抑制ATlR信號。然而，AngII增加了磷-JNK蛋白的水平。圖25表示AngII在hPrEC細(xì)胞中增加了 PAX2但降低了 DEFB1。為了測定AngII 對hPrEC細(xì)胞中PAX2水平的影響，將細(xì)胞處理72和96小時，并通過QRT-PCR檢查PAX2和 DEFBl的表達(dá)。在此，AngII處理導(dǎo)致PAX2顯著增加的水平，與PC3前列腺癌細(xì)胞中的相 似。相反，DEFBl的表達(dá)在AngII處理后顯著減少。圖26顯示AngII信號和PAX2前列腺癌的示意圖。在前列腺癌細(xì)胞中PAX2的表 達(dá)受ATlR信號通路的調(diào)節(jié)。具體來說，MEK激酶信號級聯(lián)導(dǎo)致PAX2表達(dá)增加。另外，ATlR 以及AngII經(jīng)由JNK正調(diào)節(jié)PAX2的活化。圖27顯示阻斷PAX2表達(dá)作為前列腺癌治療的示意圖。圖27A表示PAX2的表達(dá) 受ATlR信號通路的調(diào)節(jié)。PAX2表達(dá)的抑制導(dǎo)致DEFBl的再表達(dá)以及癌細(xì)胞死亡。圖27B 表示阻斷AT1R、下游激酶或者直接抑制PAX2的化合物，為治療前列腺癌提供了新方法。圖28顯示用Gleason評分比較DEFBl和PAX2表達(dá)。在來自經(jīng)歷前列腺癌根治術(shù) 的6名患者的良性臨床樣品中比較DEFBl的相對表達(dá)水平。在此，Gleason評分與鄰近的 良性前列腺組織中DEFBl的表達(dá)水平為負(fù)相關(guān)。相對DEFBl表達(dá)水平高于0. 005的患者的 Gleason評分為6。然而，表達(dá)水平小于0. 005的那些患者的Gleason評分為7。圖29顯示作為前列腺癌發(fā)展預(yù)測因素的PAX2-DEFB比。對激光捕獲顯微切割 (laser capture microdissection, LCM)前列腺組織切片進(jìn)行 QRT-PCR，以測定相對 DEFBl 和PAX2表達(dá)水平。從正常(Normal)到PIN到癌癥，DEFBl的表達(dá)水平降低。然而從正常 到PIN到癌癥，PAX2的表達(dá)水平增加。另外，患有Gleason評分為6的癌癥的患者#1457, 與患有Gleason評分為7的癌癥患者#1569相比，在正常組織和PIN中具有更多的DEFB1。 相反，與患者#1457相比，患者#1569在癌性區(qū)域具有更高的PAX2水平。圖 30 表示 Donald 預(yù)測因素(Donald Predictive Factor, DPF)是以相對 PAX2-DEFB1表達(dá)比為基礎(chǔ)的。前列腺組織DPF的增加，增加了發(fā)展前列腺癌的機(jī)會?；?PDF，PAX2-DEFB1比介于0_39之間的組織是正常的(良性的)?；赑DF級別，PAX2-DEFB1 比介于40-99之間的組織表示PIN(癌前的)。最后，PAX2-DEFB1比介于100-500的組織是惡性的(低到高分級癌癥)。圖31表示人前列腺組織中hBD-Ι表達(dá)的分析。在來自經(jīng)歷了前列腺癌根治術(shù)患 者的正常臨床樣品中比較hBD-Ι的相對表達(dá)水平。虛線為比較從總樣品和LCM衍生樣品中 獲得的值的參考點(diǎn)。Gleason評分顯示于每個柱的上方。圖31A表示與在通過粗切割獲得 的組織中相比的hBD-Ι的表達(dá)水平。圖31B表示與通過激光捕獲顯微切割獲得的組織中相 比的hBD-Ι的表達(dá)水平。圖32表示前列腺細(xì)胞系中hBD-Ι表達(dá)的分析。圖32A表示hBD_l誘導(dǎo)前和誘導(dǎo) 后，相對于hPrEC細(xì)胞比較的前列腺癌細(xì)胞系中hBD-Ι的表達(dá)水平。星號表示與hPrEC相比 統(tǒng)計(jì)上更高的表達(dá)水平。雙星號表示與hBD-Ι誘導(dǎo)前的細(xì)胞系相比統(tǒng)計(jì)上顯著的水平(斯 式t-檢驗(yàn)，ρ < 0. 05)。圖32B表示通過免疫化學(xué)在前列腺癌細(xì)胞系中證實(shí)的hBD-Ι的異 位表達(dá)。染色hPrEC細(xì)胞的hBD-Ι作為陰性對照(a :DIC, b 熒光)。用hBD_l轉(zhuǎn)染DU145 細(xì)胞并誘導(dǎo)18小時(c =DIC, d 熒光)。比例尺=20 μ Μ。圖33表示前列腺癌細(xì)胞中hBD-Ι細(xì)胞毒性分析。用Pon A處理前列腺細(xì)胞系 DU145、PC3、PC3/AR+以及LNCaP，以誘導(dǎo)hBD_l表達(dá)1_3天，其后進(jìn)行MTT測定，測定細(xì)胞活 力。每個柱表示進(jìn)行三次的三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士S.E.M.。圖34表示在人正常、PIN以及腫瘤前列腺組織LCM切片中hBD_l和cMYC表達(dá)的 QRT-PCR分析。每個基因的表達(dá)表示與β肌動蛋白相比的表達(dá)比。圖35Α表示正常、PIN 以及腫瘤切片中hBD-Ι表達(dá)水平的比較。圖35B表示正常、PIN以及腫瘤切片中cMYC表達(dá) 水平的比較。圖35表示用siRNA減少PAX2后hBD_l的QRT-PCR分析。hBD_l的表達(dá)水平表示 為與β肌動蛋白相比的表達(dá)比。星號表示與PAX2siRNA處理前的細(xì)胞系相比統(tǒng)計(jì)學(xué)上更 高的表達(dá)水平(斯氏t-檢驗(yàn)，ρ < 0. 05)。圖36表示PAX2siRNA處理后PAX2蛋白表達(dá)的沉默。圖37A表示在HPrEC前列腺 初級細(xì)胞(泳道1)、DU145 (泳道2)、PC3 (泳道3)以及LNCaP (泳道4)前列腺癌細(xì)胞中通 過Western印跡分析檢測的PAX2的表達(dá)。除去印跡并再探測作為內(nèi)部對照的肌動蛋白以確 保上樣量等同。圖37B表示用PAX2siRNA雙鏈體轉(zhuǎn)染后，DU145、PC3以及LNCaP的Western 印跡分析都證實(shí)PAX2表達(dá)減少。再次除去印跡并探測作為內(nèi)部對照的β肌動蛋白。圖37表示用PAX2siRNA處理后，前列腺癌細(xì)胞生長分析。在存在陰性對照非特異 性siRNA的情況下，第6天的HPrEC (A)、LNCaP (C)、DU145 (E)以及PC3 (G)的相差顯微鏡分 析。用PAX2siRNA處理后，DU145(D)、PC3(F)以及LNCaP(H)的細(xì)胞數(shù)目顯著減少。然而， 看起來在HPrEC(B)中沒有作用。比例尺=20 μ m。圖38表示PAX2的siRNA沉默后細(xì)胞死亡分析。用PAX2siRNA或非特異性陰性對 照siRNAs將前列腺細(xì)胞癌細(xì)胞系PC3、DU145以及LNCaP處理2、4或6天，其后進(jìn)行MTT測 定。PAX2的減少導(dǎo)致所有三個系中相對細(xì)胞活力的降低。結(jié)果表示為平均值士SD，n = 9。圖39表示半胱氨酸天冬氨酸酶活性分析。用羧基熒光素標(biāo)記的氟甲基甲酮染色 DU145、PC3和LNCaP細(xì)胞，以檢測PAX2siRNA處理后的半胱氨酸天冬氨酸酶活性。熒光下 的分析表明，在對照DU145(A)、PC3細(xì)胞(C)以及LNCaP細(xì)胞(E)中無半胱氨酸天冬氨酸酶 染色。然而，用PAX2siRNA處理的細(xì)胞在DU145(B)、PC3(D)和LNCaP(F)中誘導(dǎo)了半胱氨酸 天冬氨酸酶活性。比例尺=20 μ m。
圖40表示PAX2siRNA處理后凋亡因子的分析。在未處理的對照細(xì)胞中以及在用 PAX2siRNA處理6天的細(xì)胞中，比較促凋亡因子表達(dá)的變化。圖41A表示PAX2減少后，BAD 表達(dá)在DU145、PC3以及LNCaP中增加。圖41B表示BID表達(dá)水平在LNCaP和DU145增加 但未在PC3細(xì)胞中增加。圖41C表示AKT表達(dá)在LNCaP和DU145中減少。然而，PAX2減少 后，PC3細(xì)胞中AKT的表達(dá)無變化。結(jié)果表示為平均值士SD，n = 9。星號表示統(tǒng)計(jì)差異(ρ < 0. 05)。發(fā)明的詳細(xì)描述通過參考具體實(shí)施方案和其中包括的實(shí)施例、參考附圖和它們的前文描述以及下 列描述，可更容易地理解公開的方法和組合物。公開了材料、組合物和組分，其可以用于公開的方法和組合物、與公開的方法和組 合物聯(lián)合使用或?yàn)楣_方法和組合物的產(chǎn)物。本文公開了這些材料和其他的材料，并且可 以理解的是，公開了這些材料的組合、子集、相互作用物、基團(tuán)等，盡管未明確地公開每個各 種單個和集體組合以及這些化合物置換的具體參考，但是本文明確地考慮并描述了每一個 具體參考。例如，如果公開和討論了肽，則討論了對包括該肽的許多分子所做的許多修飾。 特別考慮了肽的每個組合和置換以及可能的修飾物，除非另有說明。因此，如果公開了一類 分子Α、Β和C以及一類分子D、E和F，以及公開了組合分子A-D的實(shí)例，則即使未單獨(dú)地引 用每個，但都單獨(dú)和共同地考慮了每一個。因此，例子就是，特別考慮了組合A-E、A-F、B-D、 B-E、B-F、C-D、C-E以及C-F的每一個，并認(rèn)為由A、B和C以及D、E和F公開的內(nèi)容以及實(shí) 例組合A-D公開。因此，例如，特別考慮了 A-E、B-F以及C-E的亞組，并認(rèn)為由A、B和C以 及D、E和F公開的內(nèi)容以及實(shí)例組合A-D公開。這種概念適用于本發(fā)明的所有方面，包括 但不限于制備和使用公開組合物的方法中的步驟。因此，如果存在可進(jìn)行的多種其他步驟， 則可以理解的是，這些其他步驟中的每一個可以與公開方法的具體實(shí)施方案或?qū)嵤┓桨傅?組合一起進(jìn)行，以及特別考慮了此類組合并認(rèn)為是公開的。本領(lǐng)域技術(shù)人員僅僅利用常規(guī)實(shí)驗(yàn)法就能看出本文所述方法和組合物的具體實(shí) 施方案的許多等同物。規(guī)定此類等同物包含于下文的權(quán)利要求書內(nèi)?？梢岳斫獾氖?，并非將公開的方法和組合物限于所述的具體方法、實(shí)驗(yàn)方案以及 試劑，因?yàn)樗鼈兛梢宰兓Ｒ部梢岳斫獾氖?，本文所用的術(shù)語僅是出于描述具體實(shí)施方案的 目的，并非意圖限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅受附加的權(quán)利要求書的限制。A.診斷、治療和預(yù)防前列腺癌本文公開了診斷、預(yù)防和治療前列腺癌以及前列腺上皮內(nèi)瘤變(PIN)的組合物和 方法。1.前列腺癌前列腺癌在許多國家已成為主要的疾病，并且是西方國家男性中最常診斷的惡性 腫瘤，其發(fā)生隨著年齡顯著增加。這種增加以及最近許多知名人士由于前列腺癌而死亡，已 促使對這種癌癥采取某些措施的需要顯得重要。已經(jīng)建議更廣泛有效性篩選可限制前列腺 癌的死亡率。前列腺癌篩選目前由直腸檢查以及測量前列腺特異性抗原(prostate specific antigen, PSA)水平組成。這些方法缺少特異性，因?yàn)橹蹦c指檢(digital rectal examination)具有相當(dāng)?shù)臋z查者間的變異性，且PSA水平在良性前列腺增生(benignprostatic hyperplasia, BPH)、前列腺炎癥以及其他狀態(tài)中可以是升高的。盡管包括于醫(yī) 師健康研究(Physicians Health Study)中，但在發(fā)展了前列腺癌的366名男性中證實(shí)了 作為診斷檢測的PSA的相當(dāng)失敗(comparative failure)，醫(yī)師健康研究為超過22，000名 男性的前瞻性研究。測量血清中的PSA水平，該血清是在研究開始時存儲的，在隨后的四年 內(nèi)發(fā)展為前列腺癌的男性中，僅有47%的男性發(fā)現(xiàn)了 PSA水平升高(Garm et al，1995)。利用Gleason系統(tǒng)，可對前列腺癌進(jìn)行評分，這對本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員而言是公知 的(Gleason，et al. 1966)。其利用組織結(jié)構(gòu)而不是細(xì)胞系特征。使用級別1_5(完全分化 至分化不良)，并結(jié)合了病灶的最常見區(qū)域和較嚴(yán)重區(qū)域的組合評分。Gleason評分除了評 估腫瘤的階段(分期)外，還提供有價值的預(yù)后信息。2-4以及8-10的Gleason評分具有 良好的預(yù)測價值，但3/4的腫瘤具有中間值。對前列腺癌進(jìn)行分期，使用兩種主要的系統(tǒng) M系統(tǒng)和Jewett系統(tǒng)(Benson & Olsson, et al. 1989)。分期包括考慮腫瘤的任何轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，并且是困難的，因?yàn)殡y以評估局 部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(lymph nodeinvolvement)或局部入侵。腫瘤的大小也難以測量，因?yàn)椴荒?在宏觀上區(qū)分腫瘤組織和正常的前列腺組織，且因?yàn)榍傲邢偃鄙偾逦哪?，并被一層纖維 性脂肪組織包圍。從T1-T4的四種類型描述了前列腺癌的分期。對于Tl而言，癌癥是微觀的、單側(cè) 的且非易察覺的。醫(yī)師不能觸摸到腫瘤或者利用如經(jīng)直腸超聲的成像看到它。BPH的治療 可能已經(jīng)公開了疾病，或其通過使用由于PSA升高而進(jìn)行的針吸活檢而得到證實(shí)。對于T2 而言，醫(yī)師通過DRE可觸摸到腫瘤?？雌饋碓摬【窒抻谙袤w一側(cè)或兩側(cè)的前列腺。對于T3 而言，癌癥侵襲到直接在腺體外的組織。對于T4而言，癌癥已擴(kuò)散至身體的其他部分。因此，目前的篩選方法是令人不滿意的；還沒有診斷癌癥或預(yù)測或預(yù)防其可能的 轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的可靠方法，這是大多數(shù)患者死亡的主要原因。2. PAX2Pax基因是編碼核轉(zhuǎn)錄因子的9個發(fā)育對照基因的家族。它們在胚胎發(fā)生中起 重要作用，并以非常有序的時間和空間方式進(jìn)行表達(dá)。它們都包含編碼DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的 384個堿基對的“配對盒”，所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化中是高度保守的(Stuart，E Τ, et al. 1994)。Pax基因?qū)Πl(fā)育過程的影響已由許多天然小鼠和人的綜合癥證實(shí)，所述綜合癥可 恰好直接歸因于Pax基因中的雜合不足。Dressier，et al. 1990中給出了 PAX2序列。已 檢測到PAX2表達(dá)的癌癥的實(shí)例列于表1中。表1 表達(dá)PAX2的癌癥
1權(quán)利要求
診斷個體前列腺癌的方法，包括檢測所述個體前列腺細(xì)胞中PAX2和β 防衛(wèi)素 1(DEFB1)的水平，其中PAX2與DEFB1的比是至少約100∶1。
2.診斷個體前列腺上皮內(nèi)瘤變(PIN)的方法，包括檢測所述個體前列腺細(xì)胞中ΡΑΧ2和 β-防衛(wèi)素-I(DEFBl)的水平，其中ΡΑΧ2與DEFBl的比是至少約40 1且小于約100 1。
3.鑒定個體具有正常前列腺的方法，包括檢測所述個體前列腺細(xì)胞中ΡΑΧ2和β-防衛(wèi) 素-1 (DEFBl)的水平，其中ΡΑΧ2與DEFBl的比小于約40 1。
4.區(qū)分個體正常、癌前和癌性前列腺狀態(tài)的方法，包括檢測所述個體前列腺細(xì)胞中 ΡΑΧ2和β -防衛(wèi)素-1 (DEFBl)的水平，其中(a)如果PAX2和DEFBl的比小于約40 1，則檢測到正常前列腺狀態(tài)；(b)如果PAX2和DEFBl的比是至少約40 1且小于約100 1，則檢測到癌前狀態(tài);以及(c)如果PAX2和DEFBl的比是至少約100 1，則檢測到癌性前列腺。
5.預(yù)防個體前列腺癌的方法，包括給予經(jīng)診斷患有前列腺上皮內(nèi)瘤變(PIN)的個體包 含PAX2表達(dá)或活性抑制劑的組合物。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述抑制劑是血管緊張肽II或血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶 (ACE)的選擇性拮抗物。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述抑制劑是血管緊張肽IIl型受體(ATlR)的選擇 性拮抗物。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述抑制劑是促分裂原激活蛋白/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié) 激酶(MEK)的選擇性拮抗物。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述抑制劑是細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)I和/或 ERK2的選擇性拮抗物。
10.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述抑制劑是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(STAT3)的 選擇性拮抗物。
11.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述抑制劑是配對盒2(PAX2)的選擇性抑制劑。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述抑制劑阻斷PAX2與β-防衛(wèi)素-I(DEFBl)啟 動子的結(jié)合。
13.預(yù)防個體前列腺癌的方法，包括(a)診斷個體患有前列腺上皮瘤變(PIN)，(b)給予所述個體包含PAX2表達(dá)或活性的抑制劑的組合物。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中通過檢測所述個體前列腺細(xì)胞中PAX2和β-防衛(wèi) 素-1 (DEFBl)的水平，診斷所述個體患有ΡΙΝ，其中ΡΑΧ2與DEFBl的比是至少約40 1且 小于約100 1。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述抑制劑是血管緊張肽II或血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶 (ACE)的選擇性拮抗物。
16.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述抑制劑是血管緊張肽IIl型受體(ATlR)的選 擇性拮抗物。
17.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述抑制劑是MEK的選擇性拮抗物。
18.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述抑制劑是ERK1，2的選擇性拮抗物。
19.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述抑制劑是STAT3的選擇性拮抗物。
20.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述抑制劑是PAX2的選擇性拮抗物。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述抑制劑阻斷β-防衛(wèi)素-I(DEFBl)與ΡΑΧ2啟 動子的結(jié)合。
22.治療個體前列腺上皮內(nèi)瘤變(PIN)的方法，包括(a)個體經(jīng)診斷患有PIN，(b)給予所述個體包含PAX2表達(dá)或活性的抑制劑的組合物。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中通過檢測所述個體前列腺細(xì)胞內(nèi)PAX2和β-防衛(wèi) 素-1 (DEFBl)的水平，診斷所述個體患有ΡΙΝ，其中ΡΑΧ2和DEFBl的比是至少約40 1且 小于約100 1。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述抑制劑是血管緊張肽II或血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶 (ACE)的選擇性拮抗物。
25.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述抑制劑是血管緊張肽IIl型受體(ATlR)的選 擇性拮抗物。
26.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述抑制劑是MEK的選擇性拮抗物。
27.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述抑制劑是ERK1，2的選擇性拮抗物。
28.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述抑制劑是STAT3的選擇性拮抗物。
29.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述抑制劑是PAX2的選擇性拮抗物。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述抑制劑阻斷β-防衛(wèi)素-I(DEFBl)與ΡΑΧ2啟 動子的結(jié)合。
31.治療個體前列腺癌的方法，包括(a)個體經(jīng)診斷患有前列腺癌，(b)給予所述個體包含PAX2表達(dá)或活性的抑制劑的組合物。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中通過檢測所述個體前列腺細(xì)胞中PAX2和β-防 衛(wèi)素-1 (DEFBl)的水平，診斷所述個體患有前列腺癌，其中ΡΑΧ2和DEFBl的比是至少約 100 1。
33.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述抑制劑是血管緊張肽II或血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶 (ACE)的拮抗物。
34.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述抑制劑是血管緊張肽IIl型受體(ATlR)的選 擇性拮抗物。
35.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述抑制劑是MEK的選擇性拮抗物。
36.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述抑制劑是ERK，2的選擇性拮抗物。
37.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述抑制劑是STAT3的選擇性拮抗物。
38.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述抑制劑是ΡΑΧ2的選擇性拮抗物。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述抑制劑阻斷β-防衛(wèi)素-I(DEFBl)與ΡΑΧ2啟 動子的結(jié)合。
40.治療或預(yù)防個體前列腺癌的方法，包括給予所述個體包含MEK和/或ERKl，2的選 擇性拮抗物的組合物。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述選擇性拮抗物是U0126或PD98059。
42.治療或預(yù)防個體前列腺癌的方法，包括給予所述個體包含STAT3的選擇性拮抗物 的組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了診斷、預(yù)防以及治療前列腺癌和前列腺上皮內(nèi)瘤變(PIN)的方法和組合物。
文檔編號C12Q1/68GK101970685SQ200880002349
公開日2011年2月9日 申請日期2008年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月16日
發(fā)明者卡爾頓·D·唐納德 申請人:Musc研究發(fā)展基金會