專利名稱：：在含粗甘油的培養(yǎng)基中生產(chǎn)酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及使用粗甘油作為培養(yǎng)中細(xì)胞生長的碳源，和在這種細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
：在某些分子生物學(xué)方法中，細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長并用于產(chǎn)生想要的蛋白質(zhì)?？梢曰厥账a(chǎn)生的想要的蛋白質(zhì)并用于多種工業(yè)和醫(yī)學(xué)應(yīng)用中。例如，所述想要的蛋白質(zhì)可用作治療蛋白(如抗體或酶)，和用于工業(yè)應(yīng)用，如清潔應(yīng)用(例如洗衣用去污劑)、造紙應(yīng)用、動物喂養(yǎng)應(yīng)用、烘焙應(yīng)用、用于淀粉水解的方法及需要大量特定酶的其它方法。使用重組細(xì)胞或非重組細(xì)胞產(chǎn)生大量的蛋白質(zhì)經(jīng)常需要在含碳源、氮源和那些細(xì)胞生長所需的其它營養(yǎng)物(例如氛基酸、維生素、礦物質(zhì)等)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。許多細(xì)胞培養(yǎng)摻入葡萄糖或葡萄糖與其它底物的組合作為細(xì)胞培養(yǎng)中的碳源，或作為細(xì)胞培養(yǎng)中的底物物料(feed)。本發(fā)明涉及用于細(xì)胞培養(yǎng)的備選碳源。本發(fā)明人在本文中已發(fā)現(xiàn)向營養(yǎng)培養(yǎng)基中添加粗甘油(作為唯一的碳源或與其它糖類(例如葡萄糖)組合)可用作碳源以通過培養(yǎng)物中生長的細(xì)胞產(chǎn)生想要的蛋白質(zhì)。在細(xì)胞培養(yǎng)物中^f吏用凈且甘油可帶來巨大的商業(yè)效益。發(fā)明簡述本發(fā)明提供含粗甘油的培養(yǎng)基。在某些實施方案中，所述粗甘油可以是培養(yǎng)基的唯一碳源。在其它實施方案中，所述培養(yǎng)基除含粗甘油外，還可含有一種或多種第二碳源，如6碳糖，其包括但不限于葡萄糖、半乳糖、果糖、山梨糖和甘露糖，或6碳糖如葡萄糖和果糖(蔗糖)、纖維素、乳糖等的組合。在其它實施方案中，所述培養(yǎng)基除含粗甘油外，還可含有一種或多種第二碳源，如蛋白質(zhì)源(例如，大豆和/或玉米)。本發(fā)明提供包含本發(fā)明的*甘油的培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物。在某些實施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)物包含復(fù)數(shù)個細(xì)胞(其在特定實施方案中可包含用于產(chǎn)生想要的蛋白質(zhì)的重組核酸)，和包含粗甘油的培養(yǎng)基。在某些實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞或真菌細(xì)胞。所述重組核酸可含有表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含有效連接的a)啟動子區(qū)，b)編碼想要的蛋白質(zhì)的編碼區(qū)；和c)終止子區(qū)。通過重組細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)對細(xì)胞可以是天然的或異源的，并且在某些實施方案中，所述蛋白質(zhì)可以是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或由細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中。所述蛋白質(zhì)例如可以是工業(yè)酶、治療蛋白、報告蛋白、可選擇標(biāo)記、食品添加劑或食品。本發(fā)明還提供蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法。一般而言，該方法包括維持上述細(xì)胞培養(yǎng)物以提供想要的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。在某些情況下，可從培養(yǎng)基中回收該蛋白質(zhì)?？赏ㄟ^組合，例如混合，粗甘油與細(xì)胞生長所需的其它組分，例如氮源和其它營養(yǎng)物，及水，來產(chǎn)生上述含粗甘油的培養(yǎng)基。在一些實施方案中，可通過組合(例如混合)a)粗甘油和b)包含用于產(chǎn)生想要蛋白質(zhì)的核酸(例如重組核酸)的細(xì)胞的培養(yǎng)物，來產(chǎn)生上述細(xì)胞培養(yǎng)物。在其它實施方案中，可通過組合(例如接種)包*甘油的細(xì)胞培養(yǎng)基與包含用于產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的重組核酸的細(xì)胞來產(chǎn)生上述細(xì)胞培養(yǎng)物。所述培養(yǎng)方法可以是分批、補料分批或連續(xù)培養(yǎng)方法。附圖簡述圖l描述了隨時間推移在分批培養(yǎng)中生長的重組變鉛青鏈霉菌(Streptomyceslividans)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)量(DCW;g細(xì)胞/kg)，所述變鉛青鏈霉菌細(xì)胞在含有粗甘油或葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，如實施例1中所述。圖2描述了隨時間推移在分批培養(yǎng)中生長的變鉛青鏈霉菌所分泌的纖維素酶的量(超過葡萄糖最大值的增加。/。)，所述變鉛青鏈霉菌在含有粗甘油或葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，如實施例l中所述。所有數(shù)據(jù)點相對于在含葡萄糖的培養(yǎng)基中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的最高水平(其設(shè)置為100%)來描述。圖3描述了隨時間推移在補料分批培養(yǎng)中生長的重組變鉛青鏈霉菌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)量(DCW;g細(xì)胞/kg),所述細(xì)胞在含有粗甘油或葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，如實施例2中所述。圖4描述了隨時間推移在補料分批培養(yǎng)中生長的變鉛青鏈霉菌所分泌的纖維素酶的量(超過葡萄糖最大值的增加。/。)，所述變鉛青鏈霉菌在含有粗甘油或葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，如實施例2中所述。所有數(shù)據(jù)點相對于在含葡萄糖的培養(yǎng)基中所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的最高水平(其設(shè)置為100%)來描述。圖5描述了隨時間推移在分批培養(yǎng)中生長的重組枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)量(在550nm處的光密度)，所述枯草芽孢桿菌細(xì)胞在含有粗甘油或葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，如實施例3中所述。圖6描述了隨時間推移在分批培養(yǎng)中生長的枯草芽孢桿菌所分泌的蛋白酶的量(超過葡萄糖最大值的增加。/。)，所述枯草芽孢桿菌在含有粗甘油或葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，如實施例3中所述。所有數(shù)據(jù)點相對于在含葡萄糖的培養(yǎng)基中所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的最高水平(其設(shè)置為100%)來描述。圖7描述了隨時間推移在補料分批培養(yǎng)中生長的重組枯草芽孢桿菌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)量(在550nm處的光密度)，所述枯草芽孢桿菌細(xì)胞在含有粗甘油或葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，如實施例4中所述。圖8描述了隨時間推移在補料分批培養(yǎng)中生長的枯草芽孢桿菌所分泌的蛋白酶的量(超過versadex最大值的增加。/。)，所述枯草芽孢桿菌在含有粗甘油或葡萄糖(versadex)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，如實施例4中所迷。所有數(shù)據(jù)點相對于在含versadex的培養(yǎng)基中所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的最高水平(其設(shè)置為100%)來描述。圖9描述了隨時間推移在分批培養(yǎng)中生長的非重組黑曲霉(Aspergillusniger)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)量(DCW;g細(xì)胞/kg)，所述黑曲霉細(xì)胞在含有粗甘油或麥芽糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，如實施例6中所述。圖10描述了隨時間推移在分批培養(yǎng)中生長的黑曲霉所分泌的葡糖淀粉酶的量(超過麥芽糖最大值的增加％)，所述黑曲霉在含有粗甘油或麥芽糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，如實施例6中所述。所有數(shù)據(jù)點相對于在含麥芽糖的培養(yǎng)基中所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的最高水平(其設(shè)置為100%)來描述。圖ll描述了隨時間推移在分批培養(yǎng)中生長的重組銹赤鏈霉菌(Streptomycesrubigenosis)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)量(DCW;g細(xì)胞/kg)，所述銹赤鏈霉菌細(xì)胞在含有粗甘油或葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，如實施例7中所述。圖12描述了隨時間推移在分批培養(yǎng)中生長的銹赤鏈霉菌所分泌的細(xì)胞內(nèi)葡萄糖異構(gòu)酶的量(超過葡萄糖最大值的增加。/。)，所述銹赤鏈霉菌在含有粗甘油或葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，如實施例7中所述。所有數(shù)據(jù)點相對于在含葡萄糖的培養(yǎng)基中所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的最高水平(其設(shè)置為100%)來描述。圖13描述了隨時間推移在分批培養(yǎng)中生長的重組多形漢遜氏酵母(Hansenulapolymorpha)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)量(在550nm處的光密度)，所迷多形漢遜氏酵母細(xì)胞在含有蒸餾甘油或粗甘油的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，如實施例8中所述。圖14描述了隨時間推移在分批培養(yǎng)中生長的多形漢遜氏酵母所分泌的脂肪酶的量(超過甘油最大值的增加％)，所述多形漢遜氏酵母在含有蒸餾甘油或粗甘油的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，如實施例8中所述。所有數(shù)據(jù)點相對于在含蒸餾甘油的培養(yǎng)基中所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的最高水平(其設(shè)置為100%)來描述。發(fā)明詳述定義除非本文另有定義，否則本文中所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明隸屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中的技術(shù)人員通常理解的相同含義。Singleton，等，DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY,第2版，JohnWileyandSons,NewYork(1994)，和Hale&Marham，THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY,HarperPerennial,NY(1991)為技術(shù)人員提供了用于本發(fā)明的許多術(shù)語的常用字典。還可參考Atkinson等,BiochemicalEngineeringandBiotechnologyHandbook,第2版，StocktonPress(1991)作為一般參考。盡管與此處所述的那些類似或等價的任何方法和材料均可用于本發(fā)明的實踐或測試中，但還描述了優(yōu)選的方法和材料。本文中涉及的所有專利和出版物，包括這些專利和出版物中公開的所有序列，被清楚地引入作為參考。數(shù)值范圍包括定義范圍的數(shù)值。除非另有說明，核酸以5'到3'方向從左到右書寫；氨基*列以氨基到氛基方向從左到右書寫。此處提供的標(biāo)題不旨在限制本發(fā)明的各個方面或?qū)嵤┓桨?，這些方面和實施方案可參考說明書整體而得到。因此，以下術(shù)語通過參考說明書整體而得到更充分的定義。"甘油，，指(<:311803)1，2，3-丙烷，也稱作1，2，3-三羥基丙烷。該術(shù)語也與"甘油(glycerin)，，和"甘油(glycerine)"互換使用。術(shù)語"粗甘油，，(rawglycerol)此處定義為具有％純度低于99%(v/v)，例如至少25%并低于95。/。的甘油(v/v)，95%到98。/。甘油(v/v)，95%到99%甘油(v/v)，或98%到99。/。甘油(v/v)的水溶液。如此處所用的術(shù)語"精制甘油"(refinedglycerol)指具有^f氐于1%鹽(w/v)的"粗甘油"。術(shù)語"蒸餾甘油"(distilledglycerol)在此處定義為具有95%或更高的。/。純度的甘油(v/v)(大于約95%且不超過100%甘油(￥))的水溶液。術(shù)語"培養(yǎng)基"在此處定義為液體的或固體的人造組合物，其含有碳源、氮源和培養(yǎng)細(xì)胞所需的其它營養(yǎng)物，例如氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等。培養(yǎng)基不含細(xì)胞。可用細(xì)胞接種培養(yǎng)基，以產(chǎn)生含有細(xì)胞和所述培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物。術(shù)語"細(xì)胞培養(yǎng)物，，和"細(xì)胞的培養(yǎng)物"可互換地使用來描述含有活細(xì)胞(通常為單一一種)和培養(yǎng)基的液體組合物?？梢酝ㄟ^用細(xì)胞接種培養(yǎng)基來產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物。細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞在代謝上是活躍的，然而，它們可以發(fā)生或不發(fā)生活躍生長或分裂。細(xì)胞培養(yǎng)物存在于體外。術(shù)語"分批，，描述了分批細(xì)胞培養(yǎng)物，其中在一開始于發(fā)酵運行開始時向所述培養(yǎng)物中加入固體形式或濃縮液體形式的底物(substrate)。通過向該培養(yǎng)基中接種細(xì)胞來啟始分批培養(yǎng)，并且隨后無營養(yǎng)物的流入。培養(yǎng)基中營養(yǎng)物和代謝物的濃度取決于在該批中的起始濃度以及營養(yǎng)物料的組成隨后因細(xì)胞發(fā)酵活動而發(fā)生的改變。術(shù)語"補料分批"描述了這樣的分批細(xì)胞培養(yǎng)，其中在發(fā)酵運行過程中周期性地或連續(xù)地向所述培養(yǎng)物中加入固體形式或濃縮液體形式的底物。通過向該培養(yǎng)基中接種細(xì)胞開始補料分批培養(yǎng)，但隨后有營養(yǎng)物流入，例如通過濃縮的營養(yǎng)物料。然而，沒有培養(yǎng)液或細(xì)胞的系統(tǒng)性的移出。術(shù)語"連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)"或"連續(xù)培養(yǎng)"指特征為連續(xù)流入液體營養(yǎng)物料和連續(xù)流出液體的培養(yǎng)。術(shù)語"容器，，指用于培養(yǎng)細(xì)胞的任何合適的容器，包括但不限于罐、瓶、燒瓶、袋子、生物反應(yīng)器，和用于進(jìn)行本發(fā)明方法的任何其它合適的容器。術(shù)語"啟動子，，在此處定義為在細(xì)胞中指導(dǎo)下游多核苷酸轉(zhuǎn)錄的核酸。在某些情況下，所述多核苷酸可以含有編碼序列，并且啟動子可以指導(dǎo)所述編碼序列轉(zhuǎn)錄成可翻譯的RNA。如此處定義的術(shù)語"分離的"指將化合物、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、核*列或氨基酸從與其天然相關(guān)的至少一種組分中移出。術(shù)語"編碼序列"在此處定義為核酸，當(dāng)其置于合適的控制序列(包括啟動子)的控制之下時轉(zhuǎn)錄成能翻譯成多肽的mRNA。編碼序列可含有單個可讀框或例如由內(nèi)含子分隔開的幾個可讀框。編碼序列例如可以是cDNA、基因組DNA、合成DNA或重組DNA。編碼序列通常在起始密碼子(例如ATG)處開始，并在終止密碼子(例如UAA、UAG和UGA)處終止。術(shù)語"重組的"指不是在宿主細(xì)胞中天然出現(xiàn)的多核苷酸或多肽。重組分子可以含有兩個或更多天然發(fā)生的序列，其以非天然發(fā)生的方式連接在一起。術(shù)語"異源的"指正常相互無關(guān)的元件。例如，如果重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)，那么該蛋白質(zhì)不由相同類型的野生型宿主細(xì)胞產(chǎn)生，異源啟動子是在與野生型宿主細(xì)胞內(nèi)源的核酸中不存在的啟動子，并且有效連接異源編碼序列的啟動子是有效連接如下編碼序列的啟動子，所述編碼序列在野生型宿主細(xì)胞中通常不與該啟動子有效連接。術(shù)語"有效連接，，指允許元件在功能上相關(guān)聯(lián)的元件布置方式。例如，如果啟動子控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么該啟動子有效連接該編碼序列，如果信號序列指導(dǎo)蛋白質(zhì)通過宿主細(xì)胞的分泌系統(tǒng)，那么該信號序列有效連接該蛋白質(zhì)。術(shù)語"核酸"包括單鏈或雙鏈DNA、單鏈或雙鏈RNA及其修飾。術(shù)語"核酸，，和"多核苷酸"此處可互換使用。如此處所用的術(shù)語"DNA構(gòu)建體"指包含至少兩個DNA多核苷酸片段的核^列。如此處所用，術(shù)語"報道分子"指可被容易地檢測并測定的蛋白質(zhì)。在某些情況下，報道分子可以是光學(xué)上可檢測的，例如熒光的、發(fā)光的或生色的。如此處所用，術(shù)語"可選擇的標(biāo)記"指生物聚合體——多肽或多核苷酸，其使得可以從含所述生物聚合體的其它細(xì)胞中選出含有所述生物聚合體的宿主細(xì)胞。可選擇的標(biāo)記可以提供對毒性化合物(如抗生素、除草劑等)的抗性。術(shù)語"信號序列"或"信號肽"指蛋白質(zhì)N末端部分的M酸序列，其促進(jìn)所述蛋白質(zhì)的成熟形式分泌到細(xì)胞外。細(xì)胞外蛋白質(zhì)的成熟形式缺少信號序列，其在分泌過程中被切掉。術(shù)語"載體"在此處定義為設(shè)計來攜帶待引入一種或多種細(xì)胞類型中的核酸序列的多核苷酸。栽體包括克隆栽體、表達(dá)栽體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌體或病毒顆粒、DNA構(gòu)建體、盒等。表達(dá)載體可包括調(diào)節(jié)序列，如啟動子、信號序列、編碼序列和轉(zhuǎn)錄終止子。如此處所用的"表達(dá)載體"指包含有效連接合適控制序列的編碼序列的DNA構(gòu)建體，所述控制序列能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)在合適宿主中的表達(dá)。這種控制序列可包括實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的啟動子、任選的控制轉(zhuǎn)錄的操縱基因序列、編碼合適的核糖體結(jié)合位點的序列、增強子及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。如此處所用，術(shù)語"多肽"和"蛋白質(zhì)"互換使用，并包括提及任何數(shù)量氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語適用于這樣的氮基酸聚合物，其中一個或更多氨基酸殘基是相應(yīng)的天然發(fā)生氨基酸的人工化學(xué)類似物，該術(shù)語也適用于天然發(fā)生的氨基酸的聚合物。該術(shù)語也適用于含有保守M酸替換的聚合物，所述替換使得該多肽保持功能性。"肽"是具有少于50個氨基酸殘基的多肽。"宿主細(xì)胞"指表達(dá)載體的合適宿主，所^達(dá)栽體包含編碼想要的蛋白質(zhì)的DNA構(gòu)建體。宿主細(xì)胞可以是任何細(xì)胞類型。術(shù)語"絲狀真菌，，指真菌亞門的所有絲狀真菌形式(參閱Alexopoulos，C.J.(1962)，INTRODUCTORYMYCOLOGY,Wiley,NewYork)。這些真菌特征在于具有由殼多糖、葡聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的細(xì)胞壁的營養(yǎng)菌絲體。本發(fā)明的絲狀真菌在形態(tài)學(xué)上、生理學(xué)上和遺傳學(xué)上不同于酵母。絲狀真菌的營養(yǎng)生長是菌絲伸長，并且碳代謝是專性需氧的。"非病原，，菌林是對人不具致病性的菌林。培養(yǎng)基如上指出，本發(fā)明提供含粗甘油的培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基可含有氮源、粗甘油和細(xì)胞培養(yǎng)物所需的其它營養(yǎng)物，例如氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等。所述粗甘油可以被生長在該培養(yǎng)基中的細(xì)胞用作碳源。在某些實施方案中，培養(yǎng)基可包含其它碳源，例如糖用于細(xì)胞生長。因此，在某些實施方案中，粗甘油可以是用于細(xì)胞的唯一碳源。在其它實施方案中，所述粗甘油可與一種或更多種其它笫二碳源共同存在用于細(xì)胞。在示例性實施方案中，培養(yǎng)基中粗甘油可具有25%到85%(v/v);還有25%到50%(v/v);還有50%到75%(v/v);還有75%到85%(v/v);還有85%到卯％(v/v)，或還有卯％到低于95%(v/v)的百分比甘油純度。在一些實施方案中，所述粗甘油可以具有95。/。到98。/o(v/v)的甘油純度。在一些實施方案中，所述粗甘油可具有低于99%(v/v)的甘油純度。在某些實施方案中，粗甘油可含有鹽(例如KCl或NaCl;硫酸鈉或硫酸鉀、磷酸鈉或磷酸鉀，或硝酸鈉或硝酸鉀)，其濃度不超過12%(w/v)，例如在1%到10%(w/v);1%到5%(w/v);5%到8%(w/v)或8%到12%(w/v)的范圍內(nèi)。精制甘油含有低于1。/。的鹽(w/v)，例如濃度在0.01%到0.1%(w/v)、0.1%到0.5%(w/v)或0.5%到低于1%(w/v)范圍內(nèi)的鹽。在一個實施方案中，所述粗甘油基本不包含鹽(0到0.01%,或0到0.001%的鹽)。盡管在優(yōu)選實施方案中粗甘油用于培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)物中，但某些實施方案中可使用蒸餾甘油。在一些實施方案中，定義為具有95%或更高純度的蒸餾甘油可具有至少95%并低于99.5%(v/v)，例如高于95%到97%甘油(v/v)、97%到99。/o甘油(v/v)或99。/。到低于99.5。/。甘油(v/v)的純度。在一些實施方案中，在本發(fā)明涵蓋的方法中^f吏用的蒸餾甘油將具有至少99.5%,例如至少99.6%、至少99.7%或至少99.9"/。甘油(v/v)的純度。具有上述范圍內(nèi)的。/。純度的甘油可稱作工業(yè)級甘油(例如，高于95。/。到低于99.5%)和醫(yī)藥級甘油(例如，至少99.5%甘油到至少99.9%甘油v/v))。培養(yǎng)基中存在的粗甘油的量可以根據(jù)所用的生長方法(例如，細(xì)胞是在分批培養(yǎng)(例如在搖瓶中)、連續(xù)培養(yǎng)，還是補料分批培養(yǎng)中生長)而有很大變化。在某些實施方案中，所述培養(yǎng)基可包含0.1%到75%的粗甘油(v/v)，例如0.5%到2%的粗甘油(特別是如果細(xì)胞培養(yǎng)物在連續(xù)或補料分批方法下生長時，在所述方法中碳源將被培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞快速消耗)、2%到5°/。的粗甘油、5%到10%的粗甘油、10%到30%的粗甘油、30%到50%的粗甘油或50%到75%的粗甘油。在一些實施方案中，所述粗甘油的濃度為大約O.l、0.5、1、5、10、15、20或25%(v/v)中的任何一個濃度至大約50、55、60、65、70、75或80%(v/v)中的任何一個濃度。在一些實施方案中，細(xì)胞在分批發(fā)酵工藝中生長，并且所述培養(yǎng)基包含大約1%到大約5。/。的粗甘油(v/v)。在一些實施方案中，細(xì)胞在補料分批發(fā)酵工藝中生長，并且所述培養(yǎng)基包含大約20%到大約50。/。的粗甘油(v/v)。如果在培養(yǎng)基中存在第二碳源，那么所述第二碳源可以是糖，例如葡萄糖、半乳糖、果糖、麥芽糖、木糖、阿拉伯糖、右旋糖或蔗糖等。如果在培養(yǎng)基中存在第二碳源，那么所述第二碳源和粗甘油可以以l:99(例如，l摩爾的第二碳源比99摩爾的甘油)到99:1(例如，99摩爾的第二碳源比l摩爾的甘油)的相對摩爾濃度存在。例如，第二碳源和粗甘油可以以在1:99到1:10、1:10到1:2、1:2到2:1、10:1到2:1或10:1到99:1范圍內(nèi)的相對摩爾濃度存在。在一些優(yōu)選實施方案中，所迷第二碳源可以是葡萄糖，并特別是當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)物包含真菌細(xì)胞時，一些葡萄糖將被提供為碳源。在一些優(yōu)選實施方案中，粗甘油與葡萄糖的比將在1:4到4:1，和可以在2:1到1:2的范圍內(nèi)?？稍诒景l(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)基中使用的其它組分(例如氮源和其它營養(yǎng)物等)的身份及合適濃度通常取決于在培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞的類型。這種組分通常為本領(lǐng)域所熟知(參閱，例如，Ausubel，等，ShortProtocolsinMolecularBiology,第3版，Wiley&Sons,1995'，Sambrook，等，MolecularCloning:ALaboratoryMa腿l，第2版，1989ColdSpringHarbor,N.Y.;Talbot,MolecularandCellularBiologyofFilamentousFungi:APracticalApproach,OxfordUniversityPress,2001;Kinghorn和Turner,AppliedMolecularGeneticsofFilamentousFungi,CambridgeUniversityPress,1992;和ColinR.Harwood，PlenumPress,1989的Bacillus(BiotechnologyHandbooks);Bacillussubtilis:FromGenestoCells,Sonenshein，A丄.，Hoch,J.A.和Losick，RASM(2001)，及例如Ilmen等，Appl.Environ.Microbiol.199763:1298-1306;O，Herrin等Hum.Immunol.199651:63-72;Westers等，J.Biotechnol.2006123:211-24和Yang等,Biochim.Biophys.Acta20041703:43-51)。也可在科學(xué)文獻(xiàn)中和/或從真菌來源(如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)和FungalGeneticsStockCenter)中找到用于給定細(xì)胞類型的培養(yǎng)條件。可在培養(yǎng)基中使用的示例性組分包括，但不限于來自微生物、動物或植物細(xì)胞的提取物，例如大豆粉、大豆蛋白、大豆?jié)饪s物、玉米漿、玉米粉、玉米谷蛋白、酵母提取物、大豆面、棉花粉、花生粉、馬鈴薯蛋白、乳清、魚粉、細(xì)菌用胰蛋白胨、細(xì)菌用蛋白胨等，鹽，例如KH2P04、MgS04、CaCl2、NaCl、FeCl3、MgCl2、MnCl2，其它化合物，例如氯化硫胺素、生物素、維生素B12、NaH2P04H3B03、ZnS04、Na2Mo04和CuS04，和任選地，一種或更多種第二碳源，如上討論的。在某些情況下，已知的培養(yǎng)基中的碳源可被替換為甘油(例如粗甘油)。下文中示例了含粗甘油的培養(yǎng)基。如將在下文更詳細(xì)地進(jìn)行描述，培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)含有用于表達(dá)蛋白質(zhì)的重組核酸的細(xì)胞。因為在某些實施方案中，重組核酸可以含有可選擇的標(biāo)記以選擇含所迷重組核酸的細(xì)胞，所以所述培養(yǎng)基還可以含有細(xì)胞的可選擇標(biāo)記能賦予對其的抗性選擇劑，如抗生素，如氨千青霉素、四環(huán)素、卡那霉素、潮霉素、博來霉素、氯霉素(chloroamphenicol)、鏈霉素或腐草霉素，或除草劑。在某些情況下，所述培養(yǎng)基還可含有從細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)。如將在下文中更詳細(xì)地描述，蛋白質(zhì)對細(xì)胞可以是內(nèi)源的，或?qū)?xì)胞是非內(nèi)源的。在特定實施方案中，可特別地配制培養(yǎng)基用于培養(yǎng)特定細(xì)胞(例如含有用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的重組核酸的宿主細(xì)胞)。如將在下文中更詳細(xì)地描述，這種宿主細(xì)胞包括，但不限于某些細(xì)菌和真菌宿主細(xì)胞。本發(fā)明培養(yǎng)基中存在的甘油(例如，粗甘油)可來自任何來源。在特定實施方案中，本發(fā)明培養(yǎng)基中存在的甘油(例如，粗甘油)可以是生物柴油或肥皂生產(chǎn)方法的副產(chǎn)物，即通過植物和/或動物甘油三酯的轉(zhuǎn)酯作用生產(chǎn)可燃性烷基酯的副產(chǎn)物，或通過植物和/或動物甘油三酯的皂化作用生產(chǎn)脂肪酸鹽的副產(chǎn)物。例如可從Novance(法國)、Reidel-deHaen(德國)、Sigma-Aldrich和ADM獲得商業(yè)來源的甘油。可使用任何便利方法制備本發(fā)明培養(yǎng)基。在一個實施方案中，將所有的培養(yǎng)基組分(包括粗甘油和水)在使用前組合并滅菌，例如進(jìn)行高壓滅菌或過濾除菌。在另一實施方案中，可在使用前向生長培養(yǎng)基的其它組分中加入粗甘油。如果所迷培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基可含有瓊脂或其它固化劑。細(xì)胞培養(yǎng)本發(fā)明提供包含a)復(fù)數(shù)個宿主細(xì)胞和b)上述培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物。在某些實施方案中，細(xì)胞可含有用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的重組核酸。在特定實施方案中，本發(fā)明宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞，其包括以下物種的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞芽孢桿菌屬物種(Bacillussp.)，包括但不限于枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、遲緩芽孢桿菌(B.lentus)、短桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothe腸philus)、嗜堿芽孢桿菌(B.alkalophihis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、克勞氏芽抱軒菌(B.clausii)、B.halodurans、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、凝結(jié)芽孢桿菌(B.eoagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)、B.lautus和蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis);鏈霉菌屬物種(Str印tomycessp.)，包括但不局限于變鉛青鏈霉菌(S.lividans)、S.carbophilus、銹赤鏈霉菌(S.rubigenosus)和淡蠟黃鏈霉菌(S.helvaticus);Pantoea屬物種，包括P.citrea;葡糖桿菌屬物種(Gluconobactersp.);歐文氏菌屬物種(Erwiniasp.);和大腸桿菌(E.coli)。在其它實施方案中，本發(fā)明宿主細(xì)胞可以是以下物種的真菌細(xì)胞木霉屬物種(Trichodermasp.)，(例如，里氏木霉(Trichodermareesei)(先前分類為長枝木霉(T.longibrachiatum)并且目前也稱為Hypocreajecorina)、綠色木霉(Trichodermaviride)、康寧木霉(Trichodermakoningii)和Trichodermaharzianum);青霉屬物種(Penicilliumsp.)、腐質(zhì)霉物種(Humicolasp.)(例如，特異腐質(zhì)霉(Humieolainsolens)和Humicolagrisea);Chrysosporium屬物種(例如，C.hicknowense)、粘帚霉屬物種(Gliocladiumsp.)、曲霉屬物種(Aspergillussp.)(例如，米曲霉(Aspergillusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、Aspergilluskawachi、棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、醬油曲霉(Aspergillussojae)和泡盛曲霉(Aspergillusawamori))，鐮孢霉屬物種(Fusariumsp.)、毛霉屬物種(Mucorsp.)、脈孢霉屬物種(Neurosporasp.)、肉座菌屬物種(Hypocreasp.)或Emericella屬物種。用于培養(yǎng)這些細(xì)胞的方法，包括可用于培養(yǎng)這些細(xì)胞的合適的培養(yǎng)基組分，是已知的。如上指出，細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞可含有用于表達(dá)蛋白質(zhì)的重組核酸。在某些實施方案中，所述重組核酸可包含用于表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)盒，即啟動子、編碼序列(即，編碼所述蛋白質(zhì)的多核苷酸)和終止子，其中所述啟動子、編碼序列和終止子有效連接，使得所述編碼序列能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA，并使得該RNA能翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)。所述啟動子、編碼序列和終止子中的每一個均可以獨立地對宿主細(xì)胞是內(nèi)源的(即天然的)或非內(nèi)源的。同樣，所述蛋白質(zhì)對宿主細(xì)胞可以是內(nèi)源的(即天然的)或非內(nèi)源的。在某些實施方案中，所述編碼序列可以被密碼子優(yōu)化以用于在特定宿主細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)。因為列出許多細(xì)胞中每個密碼子的使用的密碼子選擇表為本領(lǐng)域已知(參閱，例如Nakamura等，Nucl.AcidsRes.200028:292)，或者可容易地推出來，所以給出待表達(dá)蛋白質(zhì)的氨基i^列，即可以容易地設(shè)計出這種核酸。所編碼的蛋白質(zhì)可以是酶、治療蛋白、報告蛋白、可選擇標(biāo)記、食品添加劑或食品等。在一個實施方案中，蛋白質(zhì)可以是酶，如糖酶，如a-淀粉酶、P-淀粉酶、纖維素酶；葡聚糖酶，a-葡糖苷酶、a-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、半纖維素酶、戊聚糖酶、木聚糖酶、轉(zhuǎn)化酶、乳糖酶、柚皮苷酶(naringanase)、果膠酶或支鏈淀粉酶；蛋白酶，如酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、肽酶、粗制凝乳酶、凝乳酶(reimin)、凝乳酶(chymosin)、枯草桿菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶，或胰蛋白酶；脂酶或酯酶，如甘油三酯酶、磷脂酶、pregastric酯酶、磷酸酶、植酸酶、酰胺酶、亞#^酰基轉(zhuǎn)移酶、谷氨酰胺酶、溶菌酶或青霉素?；D(zhuǎn)移酶；異構(gòu)酶，如葡萄糖異構(gòu)酶；氧化還原酶，例如氨基酸氧化酶、過氧化氫酶、氯過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、羥基類固醇脫氫酶或過氧化物酶；裂合酶，如乙酰乳酸脫羧酶、天冬氨酸p-脫羧酶、延胡索酸酶或組氨酸酶(histadase);轉(zhuǎn)移酶，如環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶；或連接酶，等。在特定實施方案中，蛋白質(zhì)可以是氨基肽酶、羧肽酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶(cutinase)、脫氧核糖核酸酶、a-半乳糖苷酶、卩-半乳糖苷酶、ji-葡糖苷酶、漆酶、甘露糖苷酶、mutanase、果膠裂合酶(pectinolyticenyme)、多酚氧化酶、核糖核酸酶或轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，等。在其它實施方案中，蛋白質(zhì)可以是治療蛋白(即，具有治療生物活性的蛋白質(zhì))。合適的治療蛋白的實例包括促紅細(xì)胞生成素，細(xì)胞因子，如干擾素-a、干擾素-p、干擾素-y、干擾素-o和粒細(xì)胞-CSF、GM-CSF，凝血因子如因子vin、因子ix，和人蛋白c、抗凝血酶m、凝血酶、可溶性IgE受體a-鏈、IgG、IgG片段、IgG融合物、IgM、IgA、白細(xì)胞介素、尿激酶、胰凝乳蛋白酶和尿胰蛋白酶抑制劑、IGF-結(jié)合蛋白、表皮生長因子、生長激素釋;故因子、膜聯(lián)蛋白V融合蛋白、制管張素、血管內(nèi)皮生長因子-2、髓系祖細(xì)胞(myeloidprogenitor)抑制因子-1、骨保護素、a-l-抗胰蛋白酶、曱胎蛋白、DNA酶II、人纖溶酶原的kringle3、葡糖腦苷脂酶、TNF結(jié)合蛋白1、促卵泡激素、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4-Ig、跨膜激活劑及鉀調(diào)親環(huán)蛋白配體、可溶性TNF受體Fc融合物、胰高血糖素樣蛋白1和IL-2受體激動劑?？贵w蛋白質(zhì)(特異性結(jié)合并識別抗原的含有來自免疫球蛋白基因的構(gòu)架區(qū)的多肽或其片段(例如可以人源化的單克隆抗體)尤其有意義。在其它實施方案中，蛋白質(zhì)可以是報告蛋白。這種報告蛋白例如可以是在光學(xué)上可檢測的或是生色的。在該實施方案中，所述蛋白質(zhì)可以是(J-半乳糖苷酶(lacZ)、(5-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、螢光素酶、堿性磷酸酶、月因脂堿合酶(NOS)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、辣才艮過氧化物酶(HRP)或熒光蛋白，例如綠色焚光蛋白(GFP)或其衍生物?？蛇x捧標(biāo)記的實例包括但不限于賦予抗微生物抗性的標(biāo)記(例如對潮霉素、博來霉素、氯霉素或腐草霉素的抗性)，和賦予代謝優(yōu)勢的蛋白質(zhì)，例如amdS、argB和pyr4。可選擇標(biāo)記還描述于Kelley等，(1985)EMBOJ.4:475-479;Penttila等，(1987)Gene61:155-164和Kinghorn等(1992)AppliedMolecularGeneticsofFilamentousFungi,BlackieAcademicandProfessional,ChapmanandHall,London中。在某些實施方案中，編碼序列可編碼融合蛋白。在這些實施方案中的一些實施方案中，所述融合蛋白可提供蛋白質(zhì)從表達(dá)其的宿主細(xì)胞中的分泌，并且由此可含有有效連接到蛋白質(zhì)N末端的信號序列，其中所述信號序列含有使所述蛋白質(zhì)定向于宿主細(xì)胞分泌系統(tǒng)的氨基^列，從而導(dǎo)致所述蛋白質(zhì)從宿主細(xì)胞分泌到宿主細(xì)胞生長所處的培養(yǎng)基中。在蛋白質(zhì)分泌之前信號序列從融合蛋白上被切掉。所使用的信號序列對宿主細(xì)胞可以是內(nèi)源的或非內(nèi)源的，并且在某些實施方案中，其可以是已知從宿主細(xì)胞大量分泌的蛋白質(zhì)的信號序列。在特定實施方案中，信號序列蛋白可以是任何有利于蛋白質(zhì)從絲狀真菌(例如，木霉或曲霉)宿主細(xì)胞或細(xì)菌(例如，芽孢桿菌或鏈霉菌)宿主細(xì)胞中分泌的信號序列。這種信號序列包括，但不限于例如，纖維二糖水解酶I、纖維二糖水解酶II、內(nèi)切葡聚糖酶I、內(nèi)切葡聚糖酶II、內(nèi)切葡聚糖酶III、a-淀粉酶、天冬氨酰蛋白酶、葡糖淀粉酶、甘露聚糖酶、糖苷酶和大麥內(nèi)肽酶B的信號序列(參閱Saarelainen，Appl.Environ.Microbiol.199763:4938-4940)。其它信號序列是來源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA)、a因子基因(酵母，例如酵母屬(Saccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)和漢遜氏酵母屬(Hansenula))或a淀粉酶基因(芽孢桿菌屬)的那些序列。因此在某些實施方案中，本發(fā)明重組核酸可以包含編碼信號序列的核酸，所述核酸有效連接編碼蛋白質(zhì)的核酸，其在宿主細(xì)胞中的翻譯產(chǎn)生融合蛋白，所述融合蛋白包含具有用于從宿主細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)的N末端信號序列的蛋白質(zhì)。在特定實施方案中，融合蛋白還可以含有"載體蛋白"，其是宿主細(xì)胞內(nèi)源的并由宿主細(xì)胞大量分泌的蛋白質(zhì)的一部分。合適的載體蛋白包括里氏木霉甘露聚糖酶I(Man5A或MANI)、里氏木霉纖維二糖水解酶11(Cel6A或CBHII)(參閱，例如Paloheimo等Appl.Environ.Microbiol.2003December;69(12):7073-7082)或里氏木霉纖維二糖水解酶I(CBHI)的那些。在一個實施方案中，所述載體蛋白是截短的里氏木霉CBHl蛋白，其包括CBHI核心區(qū)和部分CBHI接頭區(qū)。因此提供從氨基末端到羧基末端含有有效連接的信號序列、載體蛋白和目的蛋白的融合蛋白，及編碼該蛋白質(zhì)的核酸。本發(fā)明重組核酸可存在于載體中，或整合到宿主細(xì)胞的基因組中。所述重組核酸可存在于在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制的載體中，例如噬菌體、質(zhì)粒、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。用于表達(dá)重組蛋白質(zhì)的載體為本領(lǐng)域所熟知(Ausubel，等,ShortProtocolsinMolecularBiology，第3版，Wiley&Sons,1995;Sambrook，等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，(1989)ColdSpringHarbor,N.Y.)。因為在上述培養(yǎng)基中含有粗甘油，該粗甘油在某些實施方案中可以是用于制備生物柴油或肥皂的反應(yīng)的含甘油副產(chǎn)物，故本文所述培養(yǎng)基在某些實施方案中可含有痕量可檢測量的，例如低于1%、低于0.5%、低于0.2%、低于0.1%、低于0.05%、低于0.01%、低于0.005%、低于0.001%或低于0.0005%(v/v)的、用于這些反應(yīng)的組分或這些反應(yīng)的其它產(chǎn)物或副產(chǎn)物。例如，在某些實施方案中，根據(jù)用于產(chǎn)生粗甘油的反應(yīng)本發(fā)明培養(yǎng)基可含有痕量脂肪酸的烷基酯或烷基鹽(所述脂肪酸存在于植物油，例如菜籽油、大豆油、巰基芥子油、棕櫚油、大麻油、麻風(fēng)樹油、廢烹飪油的甘油三酯，或動物脂肪，例如，牛油、豬油、黃油脂或魚油的甘油三酯中)，皂，反應(yīng)催化劑，例如甲氧基鈉或硅酸鈉，或醇，例如乙醇或甲醇，脂肪酸、灰分、硫酸、磷酸、醋酸和e-甲氧基，1，2-丙二醇。方法可使用多種不同方法制備上述細(xì)胞培養(yǎng)物。例如，在某些實施方案中，例如通過在水中將培養(yǎng)基的所有成分混和在一起，加入粗甘油，然后將培養(yǎng)基用宿主細(xì)胞接種來制4^a甘油的培養(yǎng)基?？稍谌萜髦杏诩?xì)胞生長的合適條件下維持細(xì)胞培養(yǎng)物(例如，在振蕩溫育箱中合適溫度下，如生物反應(yīng)器中室溫、30。C或37。C)。在其它實施方案中，可向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入(例如與其混和)粗甘油。在這些實施方案中，可將粗甘油與細(xì)胞培養(yǎng)物快速(例如在幾秒鐘之內(nèi))混合，或逐漸(例如在幾分鐘或幾小時之內(nèi))混合。像這樣，在某些實施方案中，本發(fā)明方法可包括在缺少粗甘油(即，使用不是粗甘油的碳源)的情況下培養(yǎng)細(xì)胞，然后向細(xì)胞中加入粗甘油。在其它實施方案中，在存在粗甘油的情況下培養(yǎng)細(xì)胞一段時間(例如數(shù)分鐘或數(shù)小時)，然后向培養(yǎng)物中加入另一碳源。如上指出，所述粗甘油可以是或可以不是用于細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞的唯一碳源。在特定實施方案中，可在使用前，從遠(yuǎn)距離場所，例如遠(yuǎn)離細(xì)胞培養(yǎng)場所的肥皂或生物柴油生產(chǎn)廠，例如不同的城市或國家，接收粗甘油。可以貯存粗甘油，并在使用前滅菌。本發(fā)明還提^H吏用上述細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法。在某些實施方案中，該蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法包括維持上述細(xì)胞培養(yǎng)物以提供蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。在某些實施方案中并如上討論，所述蛋白質(zhì)可分泌到培養(yǎng)基中。像這樣，所述方法的某些實施方案包括從培養(yǎng)基中回收蛋白質(zhì)的步驟。由細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可用于多種方法中。在一些實施方案中，可在分批或連續(xù)發(fā)酵條件下培養(yǎng)細(xì)胞。經(jīng)典的分批發(fā)酵方法使用封閉系統(tǒng)，其中在發(fā)酵運行開始前將培養(yǎng)基滅菌，用想要的生物接種所述培養(yǎng)基，并且在隨后不向培養(yǎng)基中加入任何組分的情況下進(jìn)行發(fā)酵。在某些情況下，在分批方法過程中，可改變生長培養(yǎng)基的pH和氧含量，但不能改變其碳源含量。分批系統(tǒng)的代謝物和細(xì)胞生物量不斷變化，直至發(fā)酵結(jié)束。在分批系統(tǒng)中，細(xì)胞通常從靜止的延滯期發(fā)展到高速生長的對數(shù)期，并最終達(dá)到生長速率降低或停止的穩(wěn)定期。如果不加處理，穩(wěn)定期的細(xì)胞最終會死亡。一般而言，對數(shù)期和穩(wěn)定期的細(xì)胞產(chǎn)生大多數(shù)的蛋白質(zhì)。在標(biāo)準(zhǔn)分批系統(tǒng)上的變異是"補料分批發(fā)酵"系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，當(dāng)培養(yǎng)物中營養(yǎng)物的濃度降到閾值以下時，加入營養(yǎng)物(例如，碳源如粗甘油，氮源，鹽、02或其它營養(yǎng)物)。當(dāng)分解代謝產(chǎn)物阻遏易于抑制細(xì)胞的代謝時以及當(dāng)期望在培養(yǎng)基中具有有限量的營養(yǎng)物時，補料分批系統(tǒng)是有用的?？梢曰诳蓹z測因素如pH、溶解氧和廢氣如C02的分壓的變化，估計補料分批系統(tǒng)中實際營養(yǎng)物濃度的測定。分批和補料分批發(fā)酵為本領(lǐng)域常見并已知。連續(xù)發(fā)酵是開放系統(tǒng)，其中向生物反應(yīng)器中連續(xù)加入*甘油的確定成分培養(yǎng)基，并且同時移出等量的條件培養(yǎng)基用于加工。連續(xù)發(fā)酵通常維持培養(yǎng)物在恒定的高密度，其中細(xì)胞主要處于對數(shù)期生長。連續(xù)發(fā)酵允許調(diào)整影響細(xì)胞生長和/或終產(chǎn)物濃度的一個因素或任何數(shù)目的因素。例如，在一個實施方案中，將限制性營養(yǎng)物如碳源(粗甘油)或氮源維持在固定比例，而允許調(diào)節(jié)所有其它參數(shù)。在其它系統(tǒng)中，可不斷改變影響生長的多個因素，而保持通過培養(yǎng)基混濁度測量到的細(xì)胞濃度恒定。連續(xù)系統(tǒng)力求維持穩(wěn)定狀態(tài)的生長條件。因此，由抽離培養(yǎng)基造成的細(xì)胞損失可由發(fā)酵中細(xì)胞生長速度進(jìn)行平衡。調(diào)整營養(yǎng)物和生長因素用于連續(xù)發(fā)酵工藝的方法及用于使產(chǎn)物形成速度最大化的技術(shù)是已知的。發(fā)酵反應(yīng)是需氧過程，其中通過例如含分子氧的氣體，如空氣或富氧空氣提供分子氧。盡管通氣速率可在相當(dāng)大范圍內(nèi)變化，但通常以在每分鐘發(fā)酵罐中每液體體積約0.5到10，優(yōu)選約0.5到7體積(在25°C在所用的壓力)含氧氣體的速率進(jìn)行通氣。該量基于應(yīng)用于反應(yīng)器的具正常氧含量的空氣，就純氧氣而言，相應(yīng)范圍可以是每分鐘發(fā)酵罐中每液體體積約0.1到1.7體積(在所用壓力和25。C下)的氧氣。用于微生物轉(zhuǎn)化過程的壓力范圍可以寬范圍地變化。壓力通常在約0到50psi的范圍內(nèi)。發(fā)酵溫度可稍微有些變化，但對于絲狀真菌和細(xì)菌而言，根據(jù)菌種和生物，溫度通常在20。C到45°C的范圍內(nèi)。-敝生物所需的氮源可以是任何含氮化合物或能夠以適合于微生物代謝利用的形式釋放氮的化合物。雖然可使用多種有機氮源化合物，如蛋白質(zhì)水解物，但通常會利用廉價的含氮化合物，如氨、氫氧化銨、尿素硫酸銨、磷酸銨、氯化銨和其它銨化合物。氨氣可用于大規(guī)模的操作，并可通過向水性發(fā)酵培養(yǎng)基鼓泡而被使用。在水性微生物發(fā)酵中pH范圍應(yīng)該在pH2.0到8.0的典型范圍內(nèi)。對于一些微生物而言，pH將在pH3.5到6.0的范圍內(nèi)，對于其它微生物而言，優(yōu)選pH為pH6.0到7.5。平均發(fā)酵時間根據(jù)考慮的培養(yǎng)或發(fā)酵類型而將有很大變化，但通常運行時間將在12到400小時之間。所用發(fā)酵罐的類型并不是關(guān)鍵性的，例如可以使用15LBiolafitte(Saint-Germain-en-Laye-，法國)。在一些實施方案中，發(fā)酵液通常含有細(xì)胞碎片，包括細(xì)胞和多種懸浮固體和可能地其它生物質(zhì)污染物，及想要的蛋白質(zhì)?？赏ㄟ^任何便利方法，例如通過沉淀、離心、親和、過濾或本領(lǐng)域已知的任何其它方法從生長培養(yǎng)基中回收蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，發(fā)酵將包括ri秀導(dǎo)性物料(inducingfeed)組合物用于刺激想要的蛋白質(zhì)在某些宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。例如，當(dāng)木霉是宿主細(xì)胞時，并尤其當(dāng)木霉用作生產(chǎn)纖維素酶基因的宿主細(xì)胞時，可利用誘導(dǎo)性物料組合物，并可參考2004年4月29日公布的WO04/035070。在一些實施方案中，使用*甘油的培養(yǎng)基比使用只含有基于糖的碳源的其它培養(yǎng)基提供更多量的細(xì)胞量和/或分泌的蛋白。例如，在某些實施方案中，在含粗甘油的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞，與在含基于糖的碳源(例如，蔗糖或葡萄糖)的等同培養(yǎng)物相比，產(chǎn)生多至少2%的蛋白質(zhì)、多至少5%的蛋白質(zhì)、多至少10%的蛋白質(zhì)、多至少50%的蛋白質(zhì)、多至少100%的蛋白質(zhì)或多至少1000%的蛋白質(zhì)，其中所述等同培養(yǎng)物即在等同含糖培養(yǎng)基中相同條件下培養(yǎng)相等時間量的物含有相同細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)。更具體而言，包含粗甘油作為唯一碳源的細(xì)胞培養(yǎng)物，比包含6-碳糖(例如葡萄糖)或6碳糖混合物(例如蔗糖、葡萄糖、果糖)作為唯一碳源的等同培養(yǎng)物，產(chǎn)生多至少5%的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，在含粗甘油的培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞，與在基于糖的碳源(例如沒有甘油的葡萄糖或蔗糖)中生長的等同細(xì)胞相比，細(xì)胞量相同或更多。例如，對于用甘油物料生長的細(xì)胞，相比于用葡萄糖物料生長的細(xì)胞，當(dāng)在相同時期(例如在第20、30或40小時)進(jìn)行測量時，通過g細(xì)胞/kg測量到的細(xì)胞量可以高1%、2%、3%、5%、10%、20%或更高。實施例為了進(jìn)一步闡明本發(fā)明及其優(yōu)勢，給出以下具體實施例，應(yīng)理解提供它們旨在舉例說明本發(fā)明，而不應(yīng)理解為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。適用于細(xì)菌培養(yǎng)物的維持和生長的材料和方法為本領(lǐng)域所熟知。適用(PhillippGerhardt，R.G.E.Murray,RalphN.Costilow，EugeneW.Nester，WillisA.Wood,NodR.Krieg，和G.BriggsPhillips，編輯)，AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,D.C.(1994);或ThomasD.BrockinBiotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,第2版(1989)SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,Mass。除非另有i兌明,從SigmaAldrich(St.Louis,Mo.)、GD(FranklinLakes,NJ)或QBiogene(Irvine,CA)獲得了用于細(xì)菌細(xì)胞生長和維持的所有試劑和材料。在隨后的公開內(nèi)容和實驗部分，應(yīng)用以下縮寫°C(攝氏度)；rpm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù))；H20(水)；dH20(去離子水)；dIH20(去離子水，Milli-Q過濾)；aa或AA(氨基酸)；bp(^tt對)；kb(千^&對)；kD(千道爾頓)；g或gm(克)；照(微克)；mg(毫克)；pL(微升)；ml和mL(毫升)；mm(毫米)；jim(微米)；M(摩爾)；mM(毫摩爾)；(孩傳爾)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(s)或s(s)(秒/復(fù)數(shù)秒)；min(s)或m(s)(分鐘/復(fù)數(shù)分鐘)；hr(s)或h(s)(小時/復(fù)數(shù)小時)；DIFCO(DIFCO實驗室)；m/v(質(zhì)量/體積)；和v/v(體積/體積)；OUR(在單位時間內(nèi)每單位發(fā)酵罐體積微生物用于呼吸的氧氣量)；DO%(相對于通過膜探針測量到的最大可溶量，溶解在發(fā)酵肉湯中的氧氣量)。在表l中提供了用于下文實施例的粗甘油來源。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>M.O,N.G.—非甘油有機物(MatterOrganicNonGlycerol)N.A.-信息未得實施例l在分批培養(yǎng)中生長的變鉛青鏈霉菌在具有50mL工作體積的500mL搖瓶中，通過常規(guī)分批發(fā)酵，在有氧和浸沒條件下培養(yǎng)表達(dá)來自纖維單胞菌(Cellulomonas)的中性纖維素酶的變鉛青鏈霉菌細(xì)胞。營養(yǎng)培養(yǎng)基含有酵母提取物(BiospringerB)、硫酸銨、檸檬酸和硫酸鎂(固體形式)，及硼酸、檸檬酸、硫酸亞鐵、氯化錳、硫酸鋅的溶液，和l。/。(w/v)葡萄糖或粗甘油。對用于細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)和生產(chǎn)培養(yǎng)基的詳細(xì)描述，特別參考美國專利號7,135,309實施例16和PCT申請?zhí)朩O06/071598A1實施例2。簡言之，通過從二日齡TSA平板(胰胨豆胨瓊脂，BBL#11043)接種，開始在豐富培養(yǎng)基搖瓶中的培養(yǎng)。其它豐富培養(yǎng)基是TSB(胰胨豆胨培養(yǎng)液，BBL#11768)、液體培養(yǎng)液(其每升含有16g胰蛋白胨、10g酵母提取物和5gNaCl)、培養(yǎng)基B(每升TSB補充10.0g甘油、2mL改良Balch's痕量元素溶液，其中NTA被檸檬酸替換，改良Balch's痕量元素溶液的組成可見于MethodsforGeneralandMolecularBacteriology(P.Gerhardt等，編輯，第158頁，AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,D.C.(1994))。通過從二日齡液體TSB培養(yǎng)物，使用1/30(v/v)接種物接種，開始在基本培養(yǎng)基搖瓶中的培養(yǎng)?；九囵B(yǎng)基是MM322(其每升含有12.0g甘油、11.3gK2HP04、l.Og(NH4)2S04、0.2gDifco酵母提取物、0.1gNaCl和10mL如上改變的改良Balch's痕量元素溶液，最終pH6.7(HC1));培養(yǎng)基D(補充有2gNa2C(VL的培養(yǎng)基MM322，最終pH7.2);或培養(yǎng)基E(培養(yǎng)基Dm，最終H6.4)。將培養(yǎng)基B和C及基本培養(yǎng)基過濾除菌，其它培養(yǎng)基高壓滅菌。此外，合適的培養(yǎng)條件可見于科學(xué)文獻(xiàn)，如Sambrook(1989)，上引文；Kieser等(2000)PracticalStreptomycesGenetics,JohnlimesFoundation,Norwich,UK;和來自美國典型培養(yǎng)物保藏中心fATCC),www.atcc.org。搖并瓦在30。C溫育并劇烈振蕩。在5天時間里取樣，并通過測定纖維素酶活性來分析細(xì)胞生長(DCW)和蛋白質(zhì)產(chǎn)生J吏用OMNIMARKpWave(OmnimarkInstrumentsCorporation,Tempe，AZ)測定DCW。才艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)4支術(shù)測定纖維素酶活性(參閱PCT申請?zhí)朠CT/US2005/045859和WO06/071598中描述的微量滴定板測定法)。結(jié)果呈現(xiàn)于圖1和2中。實施例2在補料分批培養(yǎng)中生長的變鉛青鏈霉菌在上文實施例l中描述的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，通過常規(guī)補料分批發(fā)酵，在有氧浸沒條件下培養(yǎng)表達(dá)來自纖維單胞菌的中性纖維素酶的變鉛青鏈霉菌。用60%wt/wt葡萄糖補料(CargillDE99右旋糖)或等價60%wt/wt粗甘油對14L分批發(fā)酵物進(jìn)行補料。以20的氧攝取速率(mmol/L-h的OUR)開始補料。補料速率在幾小時內(nèi)傾斜升高(ramp)。對甘油補料而言，基于相等的碳來調(diào)整補料速率。使用28%w/v氫氧化銨控制pH在pH7.0。發(fā)酵溫度控制在32。C并劇烈攪動。在整個過程中對多種其它參數(shù)，如pH、DO%、氣流和壓力進(jìn)行監(jiān)測。DO。/。維持在30以上。在5天時間里取樣，并分析細(xì)胞生長(DCW)和蛋白質(zhì)產(chǎn)生。圖3和4的曲線圖顯示了這些實驗的結(jié)果。實施例3在分批培養(yǎng)中生長的枯草芽孢桿菌在具有50mL工作體積的500mL搖瓶中，通過常規(guī)分批發(fā)酵，在有氧浸沒條件下培養(yǎng)表達(dá)解淀粉芽孢桿菌絲氨酸蛋白酶的微生物枯草芽孢桿菌細(xì)胞。營養(yǎng)培養(yǎng)基含有7g/1大豆粉(Cargill)、0.03g/1硫酸鎂、0.22g/1磷酸氫二鉀、21g/1磷酸二氫鈉和16g/1磷酸氫二鈉(固體形式)，和3.6g/1尿素的溶液，5%的葡萄糖或粗甘油。高壓滅菌后pH為7.5。在將包括尿素的大豆粉和鹽培養(yǎng)基滅菌后加入葡萄糖或甘油。其它培養(yǎng)基配方包括在Arbige等，F(xiàn)ermentationofBacillus，第871-891頁和Ferrari等，CommercialProductionofExtracellularEnzymes,笫917—937頁,Sonenshein等(兩者均在BacillussubtilisandOtherGram-positiveBacteria:Biochemistry,PhysiologyandMolecularGenetics,(1993)AmericanSocietyforMicrobiology)中描述的那些。對可使用的培養(yǎng)和生產(chǎn)培養(yǎng)基的描述，特別參考美國專利號7，135，309實施例17。將搖瓶置于37。C并以170rpm(2"搖床偏心距(shakerthrow》振蕩。在2天時間里取樣，并用于分析細(xì)胞生長(在550nm處的光密度；"OD5S0")和蛋白質(zhì)產(chǎn)生。使用SpectronicGenesys2在550nm處測定光密度(SprectronicAnalyticalInstruments,Garforth，WestYorkshire,UK)。還可通過本領(lǐng)域所熟知的技術(shù)，例如在ManualofMethodsforGeneralBacteriology(PhillippGerhardt,R.G.E.Murray,RalphN.Costilow，EugeneW.Nester，WillisA.Wood,NoelR.Krieg，和G.BriggsPhillips,編輯)中描述的技術(shù)來測定光密度(OD)。還可以如Estell等(l985)J.Biol.Chem.260(11):6518-21中描述來測定蛋白質(zhì)產(chǎn)生。圖5和6的曲線圖顯示了該實驗的結(jié)果。實施例4在補料分批培養(yǎng)中生長的枯草芽孢桿菌在含有0-15。/。大豆粉(Cargi11)、5-25g/1磷酸鈉和磷酸鉀、0.5-4g/l硫酸鎂及5-15g/l檸檬酸、氯化鐵和氯化錳的溶液的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，基本如K.Anstrup(1974)IndustrialAspectsofBiochemistry,B.Spencer,編輯，第23-46頁中描述的，通過常規(guī)補料分批發(fā)酵，在有氧浸沒條件下培養(yǎng)表達(dá)解淀粉芽孢桿菌絲氨酸蛋白酶的微生物枯草芽孢桿菌。在發(fā)酵前，使用包括纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶的酶混合物將培養(yǎng)基浸解90分鐘(參閱WO95/04134)。用60%wt/wt葡萄糖補料(CargillDE99右旋糖)、versadex綠或轉(zhuǎn)化糖或等價60%wt/wt粗甘油(生物柴油副產(chǎn)物)向14L分批發(fā)酵物補料。當(dāng)在批(batch)中檢測不到葡萄糖或甘油時開始補料。補料速率在幾小時內(nèi)傾斜升高。基于相等的碳，調(diào)整補料速率以加入粗甘油。使用28%w/v氫氧化銨將pH控制在7。在起泡的情況下，向培養(yǎng)基中加入消泡劑(MazuDF204，l-3g/L)。發(fā)酵溫度控制在37。C，并以750rpm攪動。在整個過程中對多種其它參數(shù)，如pH、DO%、氣流和壓力，進(jìn)行監(jiān)測。DO%維持在20以上。在2天時間里取樣，并分析細(xì)胞生長(OD550nm)和蛋白質(zhì)產(chǎn)生。如實施例3中所述來測定細(xì)胞生長和蛋白質(zhì)產(chǎn)生。圖7和8的曲線圖顯示了這些實驗的結(jié)果。實施例5在分批培養(yǎng)中生長的里氏木霉在搖瓶中通過分批發(fā)酵來培養(yǎng)表達(dá)木霉屬葡糖淀粉酶的里氏木霉細(xì)胞。在Vogel氏基本培養(yǎng)基上維持轉(zhuǎn)化體(Davis等，(1970)MethodsinEnzymology17A，第79—143頁和Davis,Rowland,Neurospora,ContributionsofaModelOrganism,OxfordUniversityPress(2000))。用真菌培養(yǎng)物的瓊脂塊接種具有50mL乳糖或Proflo培養(yǎng)基的帶擋板搖瓶。在30。C溫育搖瓶并以170rpm(2"搖床偏心距)振蕩。在4天時間里取樣，并分析細(xì)胞生長(干細(xì)胞重量)和酶活性。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，通過測量干燥過程前后的重量(g/kg)來測定干細(xì)胞重量(DCW)(MVIMARKInstrumentCorporation(iWave)。乳糖培養(yǎng)基由以下組成10g/L乳糖；2g/L蛋白胨；lg/L酵母提取物；15g/LKH2P04;2g/L(NH4)2S04;0.3g/LMgS04*7H20;0.3g/LCaCI2*2H20;lmL/L痕量金屬l&存液。Proflo培養(yǎng)基由以下組成22.5g/LProflo;30g/L乳糖；6.5g/L(NH4)2S04;2g/LKH2P04;0.3g/LMgS04*7H20;0.2g/LCaCl2;0.72g/LCaC03;lmL/L痕量金屬貯存液和2mL/L10%Tween80。在兩種培養(yǎng)基中均使用的該里氏木霉痕量金屬貯存液含有5g/LFeS04*7H20;MnS04*H201.6;1.4g/LZnS04*7H20;2.8g/LCoCl2*6H20。在兩種培養(yǎng)基中，使用28%w/v氫氧化銨或5NHCI將pH調(diào)整到5.5。對任一種培養(yǎng)基，以1.5%終濃度向其中加入葡萄糖或粗甘油，作為支持生長的額外碳源。實施例6在分批培養(yǎng)中生長的黑曲霉在含有50mL于合適營養(yǎng)培養(yǎng)基中的黑曲霉的搖瓶中，通過常規(guī)的分批發(fā)酵，在有氧浸沒條件下培養(yǎng)表達(dá)曲霉屬葡糖淀粉酶的真菌黑曲霉細(xì)胞5天。使用本領(lǐng)域已知的操作，所述培養(yǎng)基含有碳源，例如麥芽糖或粗甘油，氮源和無機鹽。可從商業(yè)供應(yīng)商獲得合適的培養(yǎng)基，或可以根據(jù)公布的組成，例如在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的產(chǎn)品目錄或在Ward等Bio/Technology8:435-440(1990)、美國專利號No.5,360,732或美國專利號7，135,309B1實施例22和23中公開的組成來制備合適培養(yǎng)基。用于本研究中的營養(yǎng)培養(yǎng)基含有promosoy100(全脂大豆?jié)饪s物，CentralSoyaCo.,Chicago,IL;參閱美國專利號3,971,856)和硫酸銨、無水硫酸鎂、檸檬酸(三)鈉、磷酸鈉(如Ward等(2004)Appl.Environ.Microbiol70(5):2567-76中描述)，和作為等價替代物的5%(w/v)麥芽糖或粗甘油。用5NHCl將pH調(diào)至4.8。用磷酸鈉將培養(yǎng)基緩沖在pH4.5。使用1-3g/1MazuDF60國P(MazurChemicals,Inc.,Gurnee，Ill.)作為消泡劑。細(xì)胞在30。C170rpm(2"搖床偏心距)劇烈攪動下生長5天。在5天時間里取樣并通過標(biāo)準(zhǔn)測定法分析細(xì)胞生長(DCW)和葡糖淀粉酶產(chǎn)生(參閱Ward等(2004)Appl.Environ.Microbiol.70(5):2567-76)。結(jié)果呈現(xiàn)于圖9和10中。實施例7在分批培養(yǎng)中生長的銹赤鏈霉菌在具50mL工作體積的500mL搖瓶中，通過常規(guī)分批發(fā)酵，在有氧浸沒條件下培養(yǎng)表達(dá)銹赤鏈霉菌葡萄糖異構(gòu)酶的銹赤鏈霉菌細(xì)胞。燒瓶以來自24小時種子燒瓶的10%接種物開始，并在合適營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天。該營養(yǎng)培養(yǎng)基含有4g/l酵母提取物(BD)、2.2g/1Cerelose、6g/1馬鈴薯右旋糖淀粉(dextrosestarch)、0.5g/1工業(yè)瓊脂和3.5g/1硫酸銨，向搖瓶中加入1.4%(w/v)葡萄糖或粗甘油。用5NHC1將pH調(diào)至6。此外，合適的培養(yǎng)條件可見于科學(xué)文獻(xiàn)，如Sambrook，(1982)上文；T.Kieser，MJ.Bibb,MJ.Buttner，KFChater,和D.A.Hopwood，等，(2000)PRACTICALSTREPTOMYCESGENETICS.JohnI謂sFoundation,NorwichUK;和/或來自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC;www.atcc.org)。搖瓶在30。C進(jìn)行溫育并劇烈攪動。使用每升1滴的MazuDF60-P(MazurChemicals,Inc.，Gurnee，Ill.)作為消泡劑、在30小時時間里取樣并通過測定葡萄糖異構(gòu)酶活性分析細(xì)胞生長(DCW)和蛋白質(zhì)產(chǎn)生。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定葡萄糖異構(gòu)酶活性(美國專利號4,610,965、5,384,257、5,310,665)。結(jié)果呈現(xiàn)于圖11和12中。實施例8在分批培養(yǎng)中生長的多形漢遜氏酵母表達(dá)重組真菌脂肪酶(PCT申請?zhí)朩O2005/087918)的多形漢遜氏酵母在YPD培養(yǎng)基(DIFCO)中，通過常規(guī)分批發(fā)酵在有氧浸沒條件下生長。細(xì)胞在含有0.75升工作體積的2.8升帶擋板fernbach搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。用NaOH或H2SCXt將培養(yǎng)基調(diào)至pH6.1。培養(yǎng)物在26。C下溫育并以170rpm(2"搖床偏心距)劇烈振蕩。加入每升1滴的MazuDF204以控制起泡。在6天時間里取樣并分析細(xì)胞生長(OD550nm)和蛋白質(zhì)產(chǎn)生。根據(jù)"TIPU測定法"測定脂酶活性(PCT申請?zhí)朩O2005/087918)。結(jié)果呈現(xiàn)于圖13和14中。盡管已經(jīng)通過闡迷和實施例為清楚理解的目的在一定程度上詳細(xì)描述了前面的發(fā)明，但是對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯而易見的是，可進(jìn)行某些改變和^f務(wù)改而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，不應(yīng)該將說明書解釋為限制本發(fā)明的范圍，所述范圍由所附權(quán)利要來描述。所有在此引用的出版物、專利和專利申請為了所有目的以其整體引入作為參考，該引用程度就如同特異地和單獨地就每一出版物、專利或?qū)＠暾堉赋鰹榱怂心康亩鴮⑵湔w引入作為參考一樣。權(quán)利要求1.用于在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，所述培養(yǎng)基包含作為碳源的粗甘油，其中所述宿主細(xì)胞包含編碼所述蛋白質(zhì)的重組核酸。2.沐據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中提供所述粗甘油作為培養(yǎng)基中的唯一碳源。3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基除了包含所述粗甘油外還包含碳水化合物作為碳源。4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述細(xì)菌細(xì)胞選自變鉛青鏈霉菌、枯草芽孢桿菌和銹赤鏈霉菌。6.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞。7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述真菌細(xì)胞是黑曲霉或多形漢遜氏酵母。8.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述蛋白質(zhì)是酶。9.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述宿主細(xì)胞在分批、補料分批或連續(xù)發(fā)酵條件下進(jìn)行培養(yǎng)。10.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述蛋白質(zhì)對所述宿主細(xì)胞是天然的。11.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述蛋白質(zhì)對所述宿主細(xì)胞是異源的。12.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中，并且其中所述方法還包括從培養(yǎng)基中回收所述蛋白質(zhì)。13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述粗甘油以0.1%到75%(v/v)的濃度存在于所述培養(yǎng)基中。全文摘要本發(fā)明涉及從在包含粗甘油作為碳源的培養(yǎng)基中生長的宿主細(xì)胞產(chǎn)生想要的蛋白質(zhì)的方法。文檔編號C12N1/15GK101589155SQ200880002197公開日2009年11月25日申請日期2008年1月10日優(yōu)先權(quán)日2007年1月11日發(fā)明者G·K·肖塔尼,J·賴曼,K·赫費特申請人:丹尼斯科美國公司