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一種培養(yǎng)基及其應用與賴氨酸搖瓶發(fā)酵方法

文檔序號:607802閱讀:303來源:國知局
專利名稱:一種培養(yǎng)基及其應用與賴氨酸搖瓶發(fā)酵方法
技術領域
本發(fā)明涉及一種特別適用于賴氨酸搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)基及其在賴氨酸搖瓶發(fā)酵中的應用以及使用該培養(yǎng)基進行賴氨酸搖瓶發(fā)酵的方法。
背景技術
在賴氨酸發(fā)酵過程中,隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗,發(fā)酵液pH值會不斷下降,因此需要定時添加氨水或液氨來控制PH值以保證菌種的正常生長代謝,獲得高含量的賴氨酸。尤其在進行賴氨酸的搖瓶發(fā)酵以獲得賴氨酸產(chǎn)量高的菌株時,目前一般通過人工定時取樣檢測pH值并滴加氨水或液氨來調(diào)節(jié)pH值。但是人工調(diào)節(jié)pH值不好把握分寸,每次添加氨水或液氨至少需要進行2次pH值的測定,調(diào)節(jié)PH值耗費的時間較長且很容易添加過量,從而影響發(fā)酵結果。而且頻繁取樣檢測會加大染菌的幾率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足,提供一種培養(yǎng)基及其在賴氨酸搖瓶發(fā)酵中的應用以及使用該培養(yǎng)基進行賴氨酸搖瓶發(fā)酵的方法。為了實現(xiàn)上述目的,一方面,本發(fā)明提供一種培養(yǎng)基,該培養(yǎng)基含有碳源、氮源、無機鹽和水,其特征在于,該培養(yǎng)基還含有指示劑,所述指示劑的變色pH范圍為5. 5-8。另一方面,本發(fā)明提供一種上述培養(yǎng)基在賴氨酸搖瓶發(fā)酵中的應用。再一方面,本發(fā)明提供一種賴氨酸搖瓶發(fā)酵方法,該方法包括將賴氨酸發(fā)酵菌種接種到培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵,其特征在于,所述培養(yǎng)基為上述培養(yǎng)基。通過上述技術方案,操作人員不需要進行取樣檢測pH值即可以直接根據(jù)培養(yǎng)基的顏色變化確定補加氨水或液氨的時間和加量,簡化了發(fā)酵操作過程,縮短了調(diào)節(jié)pH值耗費的時間,降低了操作人員的勞動強度,進而降低了染菌幾率。另外,添加的指示劑不會對發(fā)酵產(chǎn)生負面影響。因此,使用本發(fā)明的培養(yǎng)基進行賴氨酸搖瓶發(fā)酵時,發(fā)酵的穩(wěn)定性明顯增強。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式
部分予以詳細說明。
具體實施例方式以下對本發(fā)明的具體實施方式
進行詳細說明。應當理解的是,此處所描述的具體實施方式
僅用于說明和解釋本發(fā)明,并不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明中,術語“波美度”是表示溶液濃度的一種方法,是通過波美比重計檢測溶液得到的度數(shù);“發(fā)酵液”是指接種了微生物菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)基,經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后所得產(chǎn)物;“指示劑的變色pH范圍”指的是指示劑的變色pH點所在的范圍。本發(fā)明的培養(yǎng)基含有碳源、氮源、無機鹽和水,其特征在于,該培養(yǎng)基還含有指示齊U,所述指示劑的變色pH范圍為5. 5-8。
本領域技術人員所公知的是指示劑一般以溶液的形式使用,可以直接商購獲得,也可以購買粉末狀產(chǎn)品再配制成溶液使用,且配制時使用的溶劑和配制方法為常規(guī)試劑與方法,例如,中性紅一般以0. 1-0. 3重量%濃度的溶液形式使用,配制方法包括先將0. 1-0. 3克中性紅溶于60ml濃度為100%的乙醇中,再加水至100ml。根據(jù)本發(fā)明,相對于每升培養(yǎng)基,所述指示劑的添加量優(yōu)選為0. 002-0. 012克。當指示劑的添加量在上述優(yōu)選范圍內(nèi)時,顯色明顯且不會對賴氨酸發(fā)酵產(chǎn)生影響。需要說明的是,本發(fā)明中,指示劑的添加量以指示劑的干重計,即當所述指示劑以溶液形式使用時,指示劑的添加量不包括其中溶劑的量。根據(jù)本發(fā)明,只要所述指示劑的變色pH范圍在上述范圍內(nèi)即可實現(xiàn)本發(fā)明的目 的,優(yōu)選地,所述指示劑的變色pH范圍為6. 5-8。優(yōu)選地,所述指示劑為中性紅、溴百里酚藍、酚紅、苯酚紅和石蕊中的一種。根據(jù)本發(fā)明,所述培養(yǎng)基可以作為種子培養(yǎng)基,也可以作為發(fā)酵培養(yǎng)基,所述種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基可以相同或不同。根據(jù)本發(fā)明,只要往培養(yǎng)基中添加指示劑即可實現(xiàn)本發(fā)明的目的,對培養(yǎng)基的其他成分(碳源、氮源和無機鹽)無特殊要求,可以采用本領域常規(guī)使用的物質(zhì),例如,可以用淀粉質(zhì)原料糖化清液、玉米漿、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸銨、蘇氨酸和蛋氨酸等配制種子培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明,每升種子培養(yǎng)基中各原料的用量可以在很大范圍內(nèi)改變,優(yōu)選情況下,相對于每升種子培養(yǎng)基,淀粉質(zhì)原料糖化清液的用量可以為30-40克,玉米漿(干重為20-50重量%)的用量可以為70-90克,磷酸氫二鉀的用量可以為0. 5-1. 5克,硫酸鎂的用量可以為0. 4-1. I克,硫酸銨的用量可以為5-15克,蘇氨酸的用量可以為0. 1-0. 6克,蛋氨酸的用量可以為0. 1-0. 3克。可以用淀粉質(zhì)原料糖化清液、糖蜜、玉米漿、硫酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、蘇氨酸、蛋氨酸和谷氨酸等配制發(fā)酵培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明,每升發(fā)酵培養(yǎng)基中各原料的用量可以在很大范圍內(nèi)改變,優(yōu)選情況下,相對于每升發(fā)酵培養(yǎng)基,淀粉質(zhì)原料糖化清液的用量可以為40-60克,糖蜜的用量可以為30-50克,玉米漿(干重為20-50重量%)的用量可以為20-40克,硫酸銨的用量可以為20-40克,磷酸氫二鉀的用量可以為0. 5-1. 5克,硫酸鎂的用量可以為0. 4-0. 6克,蘇氨酸的用量可以為0. 1-0. 3克,蛋氨酸的用量可以為0. 1-0. 3克,谷氨酸的用量可以為0. 2-0. 4克。所述淀粉質(zhì)原料糖化清液既可以采用干法制糖工藝制備,也可以采用濕法制糖工藝制備。從工藝簡單、設備投資少,生產(chǎn)成本較低的方面考慮,優(yōu)選通過干法制糖工藝制備。干法制糖工藝是指淀粉質(zhì)原料不經(jīng)浸泡直接進行破碎和酶解。干法制糖工藝可以包括將淀粉質(zhì)原料粉碎,將淀粉質(zhì)原料粉碎后的產(chǎn)物調(diào)漿,并加入淀粉酶對淀粉進行第一次水解;對第一次水解產(chǎn)物進行固液分離,并在得到的液相組分中加入糖化酶進行第二次水解,得到淀粉質(zhì)原料糖化清液。其中,所述調(diào)漿的方法為本領域技術人員所熟知,優(yōu)選地,調(diào)漿的方法可以包括將淀粉質(zhì)原料粉碎后的產(chǎn)物加入到水中混合均勻,水的加入量使得到的漿液的波美度可以為9-17B6。;所述淀粉質(zhì)原料可以為本領域公知的各種可以用于酶解、發(fā)酵制備賴氨酸的含有淀粉的原料,例如,可以為選自玉米、薯類(如木薯)和小麥中的一種或幾種。本發(fā)明中,所述淀粉質(zhì)原料糖化清液中的葡萄糖含量為96-98重量%。上述種子培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng)基中,所述淀粉質(zhì)原料糖化清液可以由葡萄糖代替,相對于每升種子培養(yǎng)基,葡萄糖的添加量為28-39. 5克;相對于每升發(fā)酵培養(yǎng)基,葡萄糖的添加量為38-60克。本發(fā)明還提供一種上述的培養(yǎng)基在賴氨酸搖瓶發(fā)酵中的應用。本發(fā)明的賴氨酸搖瓶發(fā)酵方法包括將賴氨酸發(fā)酵菌種接種到培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵,其特征在于,所述培養(yǎng)基為上述的培養(yǎng)基。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn),隨著發(fā)酵過程中硫酸銨等營養(yǎng)物質(zhì)的消耗,發(fā)酵液的pH值逐漸下降,當PH值降至5. 4時,菌種代謝活動基本停止且不再產(chǎn)酸,但只要在pH降至5. 4后的3h內(nèi)將發(fā)酵液的pH值調(diào)節(jié)到6. 8-7. 4,菌種又可以基本恢復產(chǎn)酸能力。因此,選用變色PH范圍為5. 5-8的指示劑即可實現(xiàn)本發(fā)明的目的,優(yōu)選情況下,選用變色pH范圍為6. 5-8的指示劑。

本發(fā)明中,所述賴氨酸發(fā)酵菌種可以為本領域常規(guī)使用的賴氨酸發(fā)酵菌種,例如可以為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、大腸桿菌(Escherichia Coli)和黃色短桿菌(Brevibacterium fIavum)中的至少一種。本發(fā)明中,對所述賴氨酸搖瓶發(fā)酵的條件沒有特殊限定,優(yōu)選情況下,所述發(fā)酵的條件包括溫度為30-38°C,pH值為6. 8-7. 4,時間為28_36h,搖床的轉(zhuǎn)速為180_210rpm。本發(fā)明中,在搖瓶發(fā)酵過程中,可以通過添加氨水和/或液氨的方式調(diào)節(jié)pH值為6. 8-7. 4。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn),使用上述發(fā)酵培養(yǎng)基進行賴氨酸搖瓶發(fā)酵時,每2小時觀察發(fā)酵液的顏色變化并補加氨水和/或液氨時(本文中的每2小時表示如果8:00am觀察發(fā)酵液的顏色變化并補加了氨水和/或液氨,那么等到10:00am時再觀察發(fā)酵液的顏色變化并補加氨水和/或液氨,依此類推),可以獲得較佳的發(fā)酵結果并在最大程度上減輕操作人員的勞動強度。本領域技術人員應該理解的是,賴氨酸發(fā)酵菌種在被接種至培養(yǎng)基中之前,采用常規(guī)方法將賴氨酸發(fā)酵菌種依次經(jīng)過菌種活化和種子培養(yǎng)。種子培養(yǎng)的培養(yǎng)程度可以通過取樣顯微鏡鏡檢、OD (optical density)值測定對產(chǎn)賴氨酸微生物的生長進行觀察,當通過上述方法觀察菌體形態(tài)正常、測定OD值達到0. 08以上時停止培養(yǎng),將此時的種子液稱為成熟種子液。然后再將成熟種子液接入培養(yǎng)基中。因此,本發(fā)明中,賴氨酸發(fā)酵菌種的接種量為12-18體積%,指的是接入發(fā)酵培養(yǎng)基中的成熟種子液的體積占接入成熟種子液后發(fā)酵培養(yǎng)基體積的12-18%。以下將通過實施例對本發(fā)明進行詳細描述。以下實施例中,成熟種子液的培養(yǎng)方法包括配制種子培養(yǎng)基(具體組成為相對于每升培養(yǎng)基,葡萄糖的用量為35克,玉米漿(干重為35重量%)的用量為80克,磷酸氫二鉀的用量為I. 0克,硫酸鎂的用量為0. 5克,硫酸銨的用量為10克,蘇氨酸的用量為0. 2克,蛋氨酸的用量為0. 2克),121°C、102. 9kPa滅菌30分鐘,將活化后的黃色短桿菌菌種(菌株原種FB42購自江南大學)接入冷卻后的種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),培養(yǎng)過程中120分鐘后,根據(jù)菌體生長情況每隔60分鐘取樣鏡檢并測定OD值,當鏡檢菌體形態(tài)正常且OD值達到0. 8時停止培養(yǎng),得到成熟種子液。以下實施例中,發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為相對于每升發(fā)酵培養(yǎng)基,葡萄糖的用量為50克,糖蜜(產(chǎn)地新疆)的用量為40克,玉米漿(干重為35重量%)的用量為30克,硫酸銨的用量為30克,磷酸氫二鉀的用量為I. 0克,硫酸鎂的用量為0. 5克,蘇氨酸的用量為0. 2克,蛋氨酸的用量為0. 2克,谷氨酸的用量為0. 3克,適量的指示劑,調(diào)節(jié)pH值為6. 8。以下實施例中,按照GB10794-89標準檢測發(fā)酵液中的賴氨酸含量(以賴氨酸鹽酸鹽計);按照GB/T5009. 7-2008的方法測定發(fā)酵液中還原性糖的濃度;pH值的檢測使用梅特勒DeLTA320pH計;轉(zhuǎn)化率(%)=產(chǎn)酸量/耗糖量X 100%,其中,產(chǎn)酸量等于發(fā)酵終點發(fā)酵液中的賴氨酸含量X發(fā)酵終點體積;耗糖量等于發(fā)酵培養(yǎng)基中還原性糖質(zhì)量減去發(fā)酵終點發(fā)酵液中還原性糖質(zhì)量;賴氨酸搖瓶發(fā)酵的穩(wěn)定性通過計算發(fā)酵結束后三個500ml三角燒瓶中發(fā)酵液中賴氨酸含量的標準差來判斷,標準差值越小,表明搖瓶發(fā)酵的穩(wěn)定性越高,標
準差的計算公式為
權利要求
1.一種培養(yǎng)基,該培養(yǎng)基含有碳源、氮源、無機鹽和水,其特征在于,該培養(yǎng)基還含有指示劑,所述指示劑的變色pH范圍為5. 5-8O
2.根據(jù)權利要求I所述的培養(yǎng)基,其中,所述指示劑的變色pH范圍為6.5-8。
3.根據(jù)權利要求I所述的培養(yǎng)基,其中,相對于每升培養(yǎng)基,所述指示劑的添加量為O. 002-0. 012 克。
4.根據(jù)權利要求1-3中任意一項所述的培養(yǎng)基,其中,所述指示劑為中性紅、溴百里酚藍、酚紅、苯酚紅和石蕊中的一種。
5.權利要求1-4中任意一項所述的培養(yǎng)基在賴氨酸搖瓶發(fā)酵中的應用。
6.一種賴氨酸搖瓶發(fā)酵方法,該方法包括將賴氨酸發(fā)酵菌種接種到培養(yǎng)基中進行搖瓶發(fā)酵,其特征在于,所述培養(yǎng)基為權利要求1-4中任意一項所述的培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法,其中,所述賴氨酸發(fā)酵菌種為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、大腸桿菌(Escherichia Coli)和黃色短桿菌(Brevibacterium fIavum)中的至少一種。
8.根據(jù)權利要求6所述的方法,其中,所述搖瓶發(fā)酵的條件包括溫度為30-38°C,pH值為6. 8-7. 4,時間為28-36h,搖床的轉(zhuǎn)速為180_210rpm。
9.根據(jù)權利要求6所述的方法,其中,在所述搖瓶發(fā)酵過程中,通過添加氨水和/或液氨的方式調(diào)節(jié)PH值為6. 8-7. 4。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培養(yǎng)基及其在賴氨酸搖瓶發(fā)酵中的應用與利用該培養(yǎng)基的賴氨酸搖瓶發(fā)酵方法,該培養(yǎng)基含有碳源、氮源、無機鹽和水,其特征在于,該培養(yǎng)基還含有指示劑,所述指示劑的變色pH范圍為5.5-8。通過上述技術方案,操作人員不需要進行取樣檢測pH值即可以直接根據(jù)培養(yǎng)基的顏色變化確定補加氨水或液氨的時間和加量,簡化了發(fā)酵操作過程,縮短了調(diào)節(jié)pH值耗費的時間,降低了操作人員的勞動強度,進而降低了染菌幾率。另外,添加的指示劑不會對發(fā)酵產(chǎn)生負面影響。因此,使用本發(fā)明的培養(yǎng)基進行賴氨酸搖瓶發(fā)酵時,發(fā)酵的穩(wěn)定性明顯增強。
文檔編號C12R1/19GK102766662SQ20121026847
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月30日 優(yōu)先權日2012年7月30日
發(fā)明者馮志菲, 盧宗梅, 吳曉艷, 張軍華, 熊結青 申請人:中糧生物化學(安徽)股份有限公司
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