專利名稱：賴氨酸的三級發(fā)酵制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于氨基酸發(fā)酵領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及發(fā)酵L-賴氨酸的方法，其包括將表達(dá)二氫吡啶二羧酸合成酶變體的工程菌接入第一發(fā)酵罐培養(yǎng)并將獲得的培養(yǎng)液接種于第二發(fā)酵罐培養(yǎng)，將所得的培養(yǎng)液接種量接種于第三發(fā)酵罐培養(yǎng)，然后向第三發(fā)酵罐持續(xù)流加糖，之后向第三發(fā)酵罐持續(xù)流加糖和氮源。另外，本發(fā)明還提供了所述方法生產(chǎn)的
)口口寸。
背景技術(shù)：
L-賴氨酸是重要的氨基酸原料，可以作為調(diào)味品、食品、飼料添加劑使用，也可以作為保健品、藥品中的有效或輔料成分，廣泛應(yīng)用于食品業(yè)、飼料業(yè)、制藥業(yè)及其他化學(xué)工業(yè)中。當(dāng)前，L-賴氨酸的生產(chǎn)主要是通過微生物的發(fā)酵生產(chǎn)的，如可以利用棒狀桿菌生產(chǎn)。用于發(fā)酵生產(chǎn)的微生物可以是野生型微生物，但是更多的是通過誘變或基因工程獲得的產(chǎn)量更高的營養(yǎng)缺陷型、耐藥變異型和代謝變異型微生物。對于基因工程獲得的性狀改良的微生物來說，其中至關(guān)重要的就是性質(zhì)優(yōu)異的基因。二氫吡啶二羧酸合成酶變體是L-賴氨酸代謝途徑上重要的酶。盡管野生型吡二氫吡啶二羧酸合成酶及其部分變體已經(jīng)被公開(可參見NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)蛋白和基因登錄號AAC75531. 1 ；也可參見中國專利ZL94194962)，但是該酶的其他變體的研究卻沒有報道，也沒有啟示在新的位點(diǎn)上突變。本發(fā)明人經(jīng)過長期艱苦研究，除了令人意外地發(fā)現(xiàn)了新的二氫吡啶二羧酸合成酶之外，本發(fā)明人更詳細(xì)地研究了適合含有該酶的工程菌發(fā)酵的方法，在實(shí)際生產(chǎn)中增加了
賴氨酸的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供新的發(fā)酵L-賴氨酸的方法，其包括將表達(dá)二氫吡啶二羧酸合成酶變體的工程菌接入第一發(fā)酵罐培養(yǎng)并將獲得的培養(yǎng)液接種于第二發(fā)酵罐培養(yǎng)，將所得的培養(yǎng)液接種量接種于第三發(fā)酵罐培養(yǎng)，然后向第三發(fā)酵罐持續(xù)流加糖， 之后向第三發(fā)酵罐持續(xù)流加糖和氮源。另外，本發(fā)明還提供了所述方法生產(chǎn)的產(chǎn)品等。具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了發(fā)酵L-賴氨酸的方法，其包括(1)將表達(dá)二氫吡啶二羧酸合成酶變體的工程菌接入第一發(fā)酵罐于30_33°C培養(yǎng) 8-12小時，其中所述二氫吡啶二羧酸合成酶變體相對于野生型二氫吡啶二羧酸合成酶的活性提高；(2)將步驟(1)獲得的培養(yǎng)液以3-7% (體積)的接種量接種于第二發(fā)酵罐，于 36-40°C培養(yǎng)8-12小時;(3)將步驟(2)獲得的培養(yǎng)液以10-20% (體積)的接種量接種于第三發(fā)酵罐，于 36-40°C培養(yǎng)1-5小時；(4)向第三發(fā)酵罐持續(xù)流加糖，其中糖的每小時流加量為第三發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液量的0. 2-0. 35% (重量)，進(jìn)行10-18小時；和(5)向第三發(fā)酵罐持續(xù)流加糖和氮源，其中糖的每小時流加量為第三發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液量的0. 3-0.5% (重量)，而且氮源的每小時流加量為第三發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液量的 0. 1-0. 25% (重量)，進(jìn)行30-65小時，優(yōu)選50-55小時。在本文中，“第一”、“第二”和“第三”在修飾發(fā)酵罐的時候，是為了區(qū)分所修飾的發(fā)酵罐，即第一發(fā)酵罐、第二發(fā)酵罐和第三發(fā)酵罐之間是互不相同的。在本文中，接種量具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所能常規(guī)理解的含義，具體在以體積百分比表示的時候，指的是菌體培養(yǎng)液(接入的菌液)體積相對于被接入的培養(yǎng)基體積的百分比量。第一發(fā)酵罐和第二發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基配方可以是相同的，也可以是不同的，優(yōu)選是相同的。優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，第一發(fā)酵罐和第二發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基配方為 每18立方米培養(yǎng)基中含，葡萄糖500-750公斤，甘蔗糖蜜50-300公斤，玉米漿400-600公斤，KH2PO4 30-80 公斤，MgSO4 ·7Η20 3-15 公斤，F(xiàn)eSO4 · 7Η20 0. 1-1 公斤，MnSO4 · 7Η20 0. 1-1 公斤，生物素5-30克，和葉酸3-10克。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，第一發(fā)酵罐和第二發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基配方為每18立方米培養(yǎng)基中含，葡萄糖600公斤，甘蔗糖蜜200公斤，玉米漿 520 公斤，KH2PO4 45 公斤，MgSO4 · 7Η20 7 公斤，F(xiàn)eSO4 · 7Η20 0. 5 公斤，MnSO4 · 7Η200· 5 公斤，生物素12克，和葉酸5克。優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，第三發(fā)酵罐的培養(yǎng)基配方為每300立方米培養(yǎng)基中含，蔗糖10000-15000公斤，玉米漿10000-15000公斤，ΚΗ2Ρ04700_1200公斤， MgSO4 · 7Η20 5-220 公斤，F(xiàn)eSO4 · 7Η20 5-25 公斤，MnSO4 · 7Η205_220 公斤，生物素 150-300 克，和葉酸50-120克。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，第三發(fā)酵罐的培養(yǎng)基配方為每300立方米培養(yǎng)基中含，蔗糖12000公斤，玉米漿12000公斤，KH2PO4 1000公斤，MgSO4 · 7Η20 100 公斤，F(xiàn)eSO4 · 7Η20 12公斤，MnSO4 · 7Η20 120公斤，生物素200克，和葉酸85克。步驟⑷和(5)的部分培養(yǎng)條件(如，溫度，PH等)與步驟(3)的可以相同也可以不同。優(yōu)選步驟⑷和(5)中的溫度與步驟(3)中的溫度相同，即均為36-40°C，優(yōu)選均為 38-39°C。步驟(3)中，不進(jìn)行流加操作；而在步驟(4)和(5)中，pH則維持在6. 5至7. 8 之間，這可以簡單地通過流加堿或酸來實(shí)現(xiàn)。在本文中，流加量具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所能常規(guī)理解的含義，具體在以重量百分比表示的時候，指的是加入物質(zhì)的重量占被加入物質(zhì)(如，培養(yǎng)液)的重量的百分比量。步驟(4)和( 中的糖可以是葡萄糖、果糖或者蔗糖。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，盡管通常蔗糖被微生物同化的效果弱于葡萄糖，從而影響發(fā)酵效果，但是在本發(fā)明中，在其他發(fā)酵條件相同的情況下，流加葡萄糖和流加蔗糖之間沒有顯著的區(qū)別。因此，優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中， 步驟(4)和(5)中的糖是蔗糖。在步驟中，蔗糖的每小時流加量為第三發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液量的0.2-0. 35% (重量)，優(yōu)選為0.27-0. 33% (重量)。在步驟(5)中，蔗糖的每小時流加量為第三發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液量的0. 3-0. 5% (重量)，優(yōu)選為0. 42-0. 48% (重量)。優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，步驟(5)中的氮源是無機(jī)氮源，優(yōu)選是硫酸銨或氯化銨，如硫酸銨。在步驟(5)中，硫酸銨的每小時流加量為第三發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液量的 0. 1-0. 25% (重量)，優(yōu)選為 0. 17-0. 23% (重量)。在本發(fā)明中，野生型二氫吡啶二羧酸合成酶是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的，其序列如 NCBI (http//www. ncbi. nlm. nih. gov)蛋白和基因登錄號 AAC75531. 1 所示。
優(yōu)選本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法中，所述多核苷酸編碼二氫吡啶二羧酸合成酶變體，如其核苷酸序列如SEQ ID No 2所示。優(yōu)選本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法中，所述二氫吡啶二羧酸合成酶變體在野生型二氫吡啶二羧酸合成酶的M13、V60和A83的位置上被其他天然氨基酸替換，優(yōu)選替換選自 M13K、V60L和A83G。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，所述二氫吡啶二羧酸合成酶變體的氨基酸序列如SEQ ID No 1所示。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)二氫吡啶二羧酸合成酶變體的氨基酸序列推導(dǎo)出其編碼核苷酸序列，優(yōu)選是密碼子優(yōu)化的核苷酸序列，如針對發(fā)酵所用的菌密碼子使用情況優(yōu)化的。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，所述二氫吡啶二羧酸合成酶變體由如SEQ ID No:2所示的多核苷酸編碼。所述多核苷酸可以通過各種本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方式被導(dǎo)入產(chǎn)L-賴氨酸的菌，只要能夠使產(chǎn)L-賴氨酸的菌表達(dá)所述吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶變體即可。所述多核苷酸可以直接被導(dǎo)入，例如利用微粒體、基因槍等導(dǎo)入細(xì)胞；也可以間接被導(dǎo)入，例如可以通過構(gòu)建在質(zhì)粒載體上導(dǎo)入細(xì)胞。導(dǎo)入的所述多核苷酸可以整合在細(xì)胞的基因組上表達(dá)，也可以游離表達(dá)。優(yōu)選本發(fā)明第一方面的方法中，工程菌是棒狀桿菌。由于棒狀桿菌本身不適于作為克隆宿主菌，因此優(yōu)選所述多核苷酸是通過穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入棒狀桿菌的。其中，所述穿梭質(zhì)粒優(yōu)選是大腸桿菌和棒狀桿菌的穿梭質(zhì)粒。這樣便能夠很方便地在大腸桿菌宿主中進(jìn)行DNA 重組操作。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，工程菌是Corynekicterium glutamicum。在第二方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明得到的產(chǎn)品。具體而言，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面的方法制備的發(fā)酵液，其中L-賴氨酸的含量不低于155g/L，優(yōu)選不低于170g/ L。該發(fā)酵液可以直接干燥成為L-賴氨酸飼料添加劑。本發(fā)明具有以下有益效果發(fā)酵方法適合表達(dá)二氫吡啶二羧酸合成酶變體的工程菌產(chǎn)生賴氨酸；賴氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量在工業(yè)化生產(chǎn)中得到了很有效的提高；發(fā)酵生產(chǎn)的時間較短，提高了單位時間的產(chǎn)量；發(fā)酵需要控制的參數(shù)較少，簡化了操作，更適宜工業(yè)化的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)；變體酶與野生型酶結(jié)構(gòu)差異不大，都可以順利降解，無安全隱患。為了便于理解，以下將通過具體的實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。另外，本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過一樣。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容。如未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段和市售的常用儀器、試劑，可參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第3版)》(科學(xué)出版社)、《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(第4版)》(高等教育出版社)以及相應(yīng)儀器和試劑的廠商說明書等參考。實(shí)施例1 二氫吡啶二羧酸合成酶變體基因的制備根據(jù)我們設(shè)計(jì)的序列，通過商業(yè)途徑委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成編碼二氫吡啶二羧酸合成酶變體基因并構(gòu)建入大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭質(zhì)粒PMS2 (可購自美國典型微生物保藏中心(ATCC)，商品編號ATCC 67189)中?？寺∵^程參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》 以及所用商品化試劑的操作指南進(jìn)行，簡要過程如下通過DNA自動合成儀，合成二氫吡啶二羧酸合成酶變體基因的核酸片段，用T4多核苷酸激酶(購自TaKaRa公司)將這些核酸片段的5’端進(jìn)行磷酸化，然后等摩爾比混合這5個核酸片段后于65°C變性5分鐘，退火降溫至16°C，加入T4 DNA連接酶(購自TaKaRa 公司)連接12小時。然后，取1 μ L上述連接產(chǎn)物在50 μ L反應(yīng)體積中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中正向引物如序列表的SEQ ID Νο:3所示(引入了 EcoR I內(nèi)切酶位點(diǎn))、反向引物如序列表的SEQ ID Νο:4所示(引入了 )(ba I內(nèi)切酶位點(diǎn))，反應(yīng)條件為以94°C變性4分鐘，然后以94°C變性30秒、63°C退火60秒并72°C延伸30秒進(jìn)行35個循環(huán)，最后以72°C延伸4分鐘并降溫至4°C。瓊脂糖凝膠電泳上述PCR產(chǎn)物，回收約0.91Λ大小的片段，用EcoR I和)(ba I雙酶切該片段，并與經(jīng)這兩個內(nèi)切酶酶切的PMS2質(zhì)粒用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌ToplO F’中。挑出陽性克隆，抽提出其中的質(zhì)粒，經(jīng)測序驗(yàn)證，相應(yīng)核苷酸序列如序列表的SEQ ID No 1所示，順序編碼了如SEQ ID No 2所示的二氫吡啶二羧酸合成酶變體的完整0RF，由公司將構(gòu)建好的質(zhì)粒(命名為pMS2-dap)以及相應(yīng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化株(命名為 E. coli-dap)寄回。實(shí)施例2棒狀桿菌的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)通過電轉(zhuǎn)化法將pMS2-dap質(zhì)粒轉(zhuǎn)入L-賴氨酸發(fā)酵的棒狀桿菌工程菌(可購自美國典型微生物保藏中心(ATCC)，商品編號ATCC 31269)中，其簡要過程是將棒狀桿菌在 50mL LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至0D500達(dá)到0. 7，離心收集菌體，用0°C預(yù)冷的10% (V/ V)甘油溶液洗滌后將菌體重懸于200 μ L預(yù)冷的10% (V/V)甘油溶液中，加入pMS2-dap質(zhì)粒，混合均勻后轉(zhuǎn)移入0. Icm電擊杯中，于1. SkV持續(xù)5ms的條件進(jìn)行電擊，然后立即加入 ImL含0. 5% (M/M)葡萄糖的液體LB培養(yǎng)基，于42°C溫浴5分鐘，然后涂布在含100 μ g/mL 氨芐青霉素和35 μ g/mL卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基上于30°C培養(yǎng)36小時。生長出的轉(zhuǎn)化菌株提取總DNA后，用上述正向引物和反向引物PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)有約0. 9kb 大小的片段，表明已經(jīng)將如序列表的SEQ ID No :1所示的基因構(gòu)建體導(dǎo)入了棒狀桿菌工程菌中。同時將PMS2質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入L-賴氨酸發(fā)酵的棒狀桿菌工程菌，形成陰性對照菌。將上述電轉(zhuǎn)化的陽性棒狀桿菌工程菌和陰性對照菌分別在液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至0D500達(dá)到0. 5，以5%的接種量接入賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基配方為 40g 蔗糖，20g NH4Cl, 2g CaCl2, Ig KH2PO4, Ig 蛋白胨，500mgMgS04 · 7H20，15mg FeSO4 · 7H20， IOmg MnSO4 · 7H20, 200 μ g 生物素，和 50 μ g 葉酸，用 Tris-HCl 調(diào)節(jié)至 ρΗ7· 3)中以 30°C振蕩(150rpm)培養(yǎng)72小時。離心收集培養(yǎng)基上清液(即，發(fā)酵液)，用紙層析法分離并定量培養(yǎng)基中的L-賴氨酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽性棒狀桿菌工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中L-賴氨酸的含量達(dá)到了 19. 6g/L，而陰性對照菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中L-賴氨酸的含量僅為12. Og/L，表明導(dǎo)入了如序列表的SEQ ID No :1所示的基因構(gòu)建體，產(chǎn)量提高了 63.3%，高于現(xiàn)有技術(shù)中導(dǎo)入野生型吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶的工程菌的產(chǎn)量提高比率。實(shí)施例3L-賴氨酸的三級發(fā)酵實(shí)例1第一級制備將實(shí)施例2的轉(zhuǎn)化有pMS2-dap質(zhì)粒的棒狀桿菌工程菌以0. 5%的接種量接入20立方米發(fā)酵罐(其中的培養(yǎng)基配方為葡萄糖600公斤，甘蔗糖蜜200公斤，玉
6米漿 520 公斤，KH2PO4 45 公斤，MgSO4 · 7H20 7 公斤，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 5 公斤，MnSO4 · 7H20 0. 5 公斤，生物素12克，和葉酸5克，用水定容至18立方米)，于31°C飽和通氣培養(yǎng)10小時，提高菌體密度。期間，用葡萄糖累積的活菌量顯著優(yōu)于使用蔗糖。第二級制備將20立方米發(fā)酵罐的培養(yǎng)液以5%的接種量注入50立方米發(fā)酵罐 (其中培養(yǎng)基配方與上相同)，于38°C飽和通氣培養(yǎng)10小時，使菌體適宜產(chǎn)酸。第三級制備將50立方米發(fā)酵罐的培養(yǎng)液直接注入350立方米發(fā)酵罐(其中的培養(yǎng)基配方為蔗糖12000公斤，玉米漿12000公斤，KH2PO4 1000公斤，MgSO4 ·7Η20 100公斤， FeSO4 · 7Η20 12公斤，MnSO4 · 7Η20 120公斤，生物素200克，和葉酸85克，用水定容至300 立方米)，于38°C飽和通氣培養(yǎng)3小時。然后，每小時流加1000公斤蔗糖，持續(xù)15小時，期間排出蒸汽以保持體積；之后，每小時流加1500公斤蔗糖和650公斤硫酸銨，持續(xù)發(fā)酵50 小時，期間排出蒸汽以保持體積。流加期間，加入NaOH和濃鹽酸使pH維持在6. 5至7. 8之間，即低于低限時加堿，高于高限時加酸。流加時，可以放出1立方米培養(yǎng)液溶解100公斤蔗糖或硫酸銨，流加入。發(fā)酵完畢，薄層層析檢測其中產(chǎn)L-賴氨酸159g/L，達(dá)到工業(yè)應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施例4L-賴氨酸的三級發(fā)酵實(shí)例2基本同實(shí)施例3，所不同的是，將50立方米發(fā)酵罐的培養(yǎng)液直接注入350立方米發(fā)酵罐，于39°C飽和通氣2. 5小時。然后，每小時流加1100公斤蔗糖，持續(xù)12小時；之后，每小時流加1500公斤蔗糖和700公斤硫酸銨，持續(xù)發(fā)酵55小時，薄層層析檢測其中產(chǎn)L-賴氨酸 177g/L。實(shí)施例5L-賴氨酸的三級發(fā)酵實(shí)例3基本同實(shí)施例3，所不同的是，將50立方米發(fā)酵罐的培養(yǎng)液直接注入350立方米發(fā)酵罐，于39°C攪拌培養(yǎng)3小時。然后，每小時流加1100公斤蔗糖，持續(xù)18小時；之后，每小時流加1500公斤蔗糖和700公斤硫酸銨，持續(xù)發(fā)酵50小時，薄層層析檢測其中產(chǎn)L-賴氨酸 170g/L。
權(quán)利要求
1.發(fā)酵L-賴氨酸的方法，其包括(1)將表達(dá)二氫吡啶二羧酸合成酶變體的工程菌接入第一發(fā)酵罐于30-33°C培養(yǎng)8-12 小時，其中所述二氫吡啶二羧酸合成酶變體相對于野生型二氫吡啶二羧酸合成酶的活性提尚；(2)將步驟(1)獲得的培養(yǎng)液以3-7%(體積)的接種量接種于第二發(fā)酵罐，于36-40°C 培養(yǎng)8-12小時；(3)將步驟(2)獲得的培養(yǎng)液以10-20%(體積)的接種量接種于第三發(fā)酵罐，于 36-40°C培養(yǎng)1-5小時；(4)向第三發(fā)酵罐持續(xù)流加糖，其中糖的每小時流加量為第三發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液量的 0. 2-0. 35% (重量)，進(jìn)行10-18小時；和(5)向第三發(fā)酵罐持續(xù)流加糖和氮源，其中糖的每小時流加量為第三發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液量的0. 3-0.5% (重量)，而且氮源的每小時流加量為第三發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液量的0. 1-0. 25% (重量)，進(jìn)行30-65小時，優(yōu)選50-55小時。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中第一發(fā)酵罐和第二發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基配方為每18立方米培養(yǎng)基中含，葡萄糖500-750公斤，甘蔗糖蜜50-300公斤，玉米漿400-600公斤，KH2PO4 30-80 公斤，MgSO4 · 7H20 3-15 公斤，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 1-1 公斤，MnSO4 · 7H20 0. 1-1 公斤，生物素5-30克，和葉酸3-10克。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中第一發(fā)酵罐和第二發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基配方為每18立方米培養(yǎng)基中含，葡萄糖600公斤，甘蔗糖蜜200公斤，玉米漿520公斤，KH2PO4 45公斤， MgSO4 · 7H20 7 公斤，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 5 公斤，MnSO4 · 7H20 0. 5 公斤，生物素 12 克，和葉酸 5 克。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中第三發(fā)酵罐的培養(yǎng)基配方為每300立方米培養(yǎng)基中含，蔗糖 10000-15000 公斤，玉米菜 10000-15000 公斤，KH2PO4 700-1200 公斤，MgSO4 · 7H20 5-220 公斤，F(xiàn)eSO4 · 7H20 5-25 公斤，MnSO4 · 7H20 5-220 公斤，生物素 150-300 克，和葉酸 50-120 克。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中第三發(fā)酵罐的培養(yǎng)基配方為每300立方米培養(yǎng)基中含，蔗糖 12000 公斤，玉米漿 12000 公斤，KH2PO4 1000 公斤，MgSO4 ·7Η20100 公斤，F(xiàn)eSO4 ·7Η20 12公斤，MnSO4 · 7Η20 120公斤，生物素200克，和葉酸85克。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(4)和(5)中的溫度與步驟(3)中的溫度相同，優(yōu)選為 38-39 0C ο
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟⑷和(5)中的糖是蔗糖；和/或，其中步驟(5) 中的氮源是無機(jī)氮源，優(yōu)選是硫酸銨或氯化銨。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中工程菌是棒狀桿菌，優(yōu)選是CorynelDacterium glutamicum。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中二氫吡啶二羧酸合成酶變體在野生型二氫吡啶二羧酸合成酶的M13、V60或A83的位置上被其他天然氨基酸替換，優(yōu)選替換選自M13K、V60L和 A83G，最優(yōu)選二氫吡啶二羧酸合成酶變體的氨基酸序列如SEQ ID No :1所示。
10.權(quán)利要求1-9之任一所述的方法制備的發(fā)酵液，其中L-賴氨酸的含量不低于 155g/L，優(yōu)選不低于170g/L。
全文摘要
本發(fā)明提供了發(fā)酵L-賴氨酸的方法，其包括將表達(dá)二氫吡啶二羧酸合成酶變體的工程菌接入第一發(fā)酵罐培養(yǎng)并將獲得的培養(yǎng)液接種于第二發(fā)酵罐培養(yǎng)，將所得的培養(yǎng)液接種量接種于第三發(fā)酵罐培養(yǎng)，然后向第三發(fā)酵罐持續(xù)流加糖，之后向第三發(fā)酵罐持續(xù)流加糖和氮源。
文檔編號C12R1/15GK102234667SQ20111015155
公開日2011年11月9日 申請日期2011年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月8日
發(fā)明者劉鑫, 孟剛, 曹洪, 程耀東, 陳崇安, 馬吉銀 申請人:寧夏伊品生物科技股份有限公司