專利名稱：賴氨酸的發(fā)酵制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于氨基酸發(fā)酵領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及L-賴氨酸的發(fā)酵方法，其包括將編碼二氫吡啶二羧酸合成酶變體的多核苷酸導(dǎo)入產(chǎn)L-賴氨酸的菌，從而使所獲得的菌表達(dá)所述二氫吡啶二羧酸合成酶變體；和在發(fā)酵條件下培養(yǎng)獲得的菌。另外，本發(fā)明還提供了所述發(fā)酵方法中所用的中間產(chǎn)物，和利用所述發(fā)酵方法進一步生產(chǎn)產(chǎn)品等。
背景技術(shù)：
L-賴氨酸是重要的氨基酸原料，可以作為調(diào)味品、食品、飼料添加劑使用，也可以作為保健品、藥品中的有效或輔料成分，廣泛應(yīng)用于食品業(yè)、飼料業(yè)、制藥業(yè)及其他化學(xué)工業(yè)中。當(dāng)前，L-賴氨酸的生產(chǎn)主要是通過微生物的發(fā)酵生產(chǎn)的，如可以利用棒狀桿菌生產(chǎn)。用于發(fā)酵生產(chǎn)的微生物可以是野生型微生物，但是更多的是通過誘變或基因工程獲得的產(chǎn)量更高的營養(yǎng)缺陷型、耐藥變異型和代謝變異型微生物。對于基因工程獲得的性狀改良的微生物來說，其中至關(guān)重要的就是性質(zhì)優(yōu)異的基因。二氫吡啶二羧酸合成酶變體是L-賴氨酸代謝途徑上重要的酶。盡管野生型吡二氫吡啶二羧酸合成酶及其部分變體已經(jīng)被公開(可參見NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)蛋白和基因登錄號AAC75531. 1 ；也可參見中國專利ZL94194962)，但是該酶的其他變體的研究卻沒有報道，也沒有啟示在新的位點上突變。本發(fā)明人經(jīng)過長期艱苦研究，令人意外地發(fā)現(xiàn)了新的二氫吡啶二羧酸合成酶，其在導(dǎo)入工程菌發(fā)酵的時候也獲得了更高的賴氨酸產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供L-賴氨酸的發(fā)酵方法，其包括將編碼二氫吡啶二羧酸合成酶變體的多核苷酸導(dǎo)入產(chǎn)L-賴氨酸的菌，從而使所獲得的菌表達(dá)所述二氫吡啶二羧酸合成酶變體。另外，本發(fā)明還提供了所述發(fā)酵方法中所用的中間產(chǎn)物，和利用所述發(fā)酵方法進一步生產(chǎn)產(chǎn)品等具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了 L-賴氨酸的發(fā)酵方法，其包括(1)將編碼二氫吡啶二羧酸合成酶變體的多核苷酸導(dǎo)入產(chǎn)L-賴氨酸的菌，從而使所獲得的菌表達(dá)所述二氫吡啶二羧酸合成酶變體，其中所述二氫吡啶二羧酸合成酶變體在野生型二氫吡啶二羧酸合成酶的M13、V60或A83的位置上被其他天然氨基酸替換；和(2)在發(fā)酵條件下培養(yǎng)步驟(1)獲得的菌。其中，野生型二氫吡啶二羧酸合成酶是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的，其序列如 NCBI (http//www. ncbi. nlm. nih. gov)蛋白和基因登錄號 AAC75531. 1 所示。優(yōu)選本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法中，所述多核苷酸編碼二氫吡啶二羧酸合成酶變體，如其核苷酸序列如SEQ ID No 2所示。優(yōu)選本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法中，所述二氫吡啶二羧酸合成酶變體在野生型二氫吡啶二羧酸合成酶的M13、V60和A83的位置上被其他天然氨基酸替換，優(yōu)選替換選自M13K、V60L和A83G。在本發(fā)明的具體實施方式
中，所述二氫吡啶二羧酸合成酶變體的氨基酸序列如SEQ ID No 1所示。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)二氫吡啶二羧酸合成酶變體的氨基酸序列推導(dǎo)出其編碼核苷酸序列，優(yōu)選是密碼子優(yōu)化的核苷酸序列，如針對發(fā)酵所用的菌密碼子使用情況優(yōu)化的。在本發(fā)明的具體實施方式
中，所述二氫吡啶二羧酸合成酶變體由如SEQ ID No:2所示的多核苷酸編碼。所述多核苷酸可以通過各種本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方式被導(dǎo)入產(chǎn)L-賴氨酸的菌，只要能夠使產(chǎn)L-賴氨酸的菌表達(dá)所述吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶變體即可。所述多核苷酸可以直接被導(dǎo)入，例如利用微粒體、基因槍等導(dǎo)入細(xì)胞；也可以間接被導(dǎo)入，例如可以通過構(gòu)建在質(zhì)粒載體上導(dǎo)入細(xì)胞。導(dǎo)入的所述多核苷酸可以整合在細(xì)胞的基因組上表達(dá)，也可以游離表達(dá)。通常，由于產(chǎn)L-賴氨酸的菌本身不適于作為克隆宿主菌，因此優(yōu)選所述多核苷酸是通過穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入產(chǎn)L-賴氨酸的菌的。其中，所述穿梭質(zhì)粒優(yōu)選是大腸桿菌和產(chǎn)L-賴氨酸的菌的穿梭質(zhì)粒。這樣便能夠很方便地在大腸桿菌宿主中進行DNA重組操作。產(chǎn)L-賴氨酸的菌有許多種，本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的包括埃希氏桿菌、棒狀桿菌和沙雷氏桿菌，優(yōu)選是棒狀桿菌。在本發(fā)明的具體實施方式
中，所述產(chǎn)L-賴氨酸的菌是 Corynebacterium glutamicum0優(yōu)選本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法中，所述發(fā)酵條件的發(fā)酵溫度為觀_351，優(yōu)選為 29-33 0C，更優(yōu)選為 30-32 0C，如 30 °C。也優(yōu)選本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法中，所述發(fā)酵條件的培養(yǎng)基包含糖，NH4Cl, CaCl2,KH2PO4，蛋白胨，MgSO4,FeSO4,MnSO4，生物素，和葉酸。在本發(fā)明的具體實施方式
中，所述培養(yǎng)基的配方為:40g蔗糖，20g NH4Cl, 2g CaCl2, IgKH2PO4, Ig蛋白胨，5OOmg MgSO4 ·7Η20， 15mg FeSO4 ·7Η20，IOmgMnSO4 ·7Η20，200 μ g 生物素，和 50 μ g 葉酸，ρΗ7· 3，用水補足至 1 升。在第二方面，本發(fā)明提供了 L-賴氨酸飼料添加劑的制備方法，其包括(1)實施本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法中的步驟⑵；和(2)收集發(fā)酵液依次進行膜分離并對濾液進行噴霧干燥；(3)對步驟⑵噴霧干燥獲得的顆粒進行篩分；(4)將篩分得到的粒徑大于等于1. 5mm的顆粒破碎，并將其與篩分得到的粒徑小于1. 5mm的顆?；旌?，再次進行噴霧干燥；和(5)對步驟(4)噴霧干燥獲得的顆粒進行篩分，收集粒徑小于1. 5mm的顆粒。其中，為了使最終顆粒飼料添加劑的形狀更為均勻，流化床干燥機內(nèi)尾氣溫度不宜過高，通常不應(yīng)高于85 °C，優(yōu)選保持在80 士 3°C。本發(fā)明第二方面的制備方法還可以在實施本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法中的步驟 (2)之前，包括實施本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法中的步驟(1)。但是，這通常不是優(yōu)選的，因此本發(fā)明第二方面的制備方法不包括實施本發(fā)明第一方面的發(fā)酵方法中的步驟(1)，而包括在發(fā)酵條件下培養(yǎng)產(chǎn)L-賴氨酸的菌(尤其是高產(chǎn)L-賴氨酸的菌)的步驟，這也涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。由于本發(fā)明第二方面的制備方法已經(jīng)能夠生產(chǎn)出符合國家標(biāo)準(zhǔn)的顆粒飼料添加劑，因此優(yōu)選其中不包括包衣的過程，相應(yīng)可以降低成本，更便于商業(yè)推廣。在第三方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明得到的產(chǎn)品以及本發(fā)明中使用的中間產(chǎn)物。具體而言，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明第二方面的制備方法得到的L-賴氨酸飼料添加劑，優(yōu)選其中不含包衣劑(如，環(huán)糊精等)。另外，本發(fā)明提供了二氫吡啶二羧酸合成酶變體，其在野生型二氫吡啶二羧酸合成酶的M13、V60或A83的位置上被其他天然氨基酸替換。優(yōu)選所述二氫吡啶二羧酸合成酶變體在野生型二氫吡啶二羧酸合成酶的M13、V60和A83的位置上被其他天然氨基酸替換， 優(yōu)選替換選自M13K、V60L和A83G。在本發(fā)明的具體實施方式
中，所述二氫吡啶二羧酸合成酶變體的氨基酸序列如SEQ IDNo 1所示。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了編碼二氫吡啶二羧酸合成酶變體的多核苷酸，優(yōu)選其核苷酸序列如SEQ ID No 2所示。本發(fā)明具有以下有益效果賴氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量得到有效提高；發(fā)酵液質(zhì)量穩(wěn)定； 變體酶與野生型酶結(jié)構(gòu)差異不大，都可以順利降解，無安全隱患；發(fā)酵液可以直接用于生產(chǎn)顆粒飼料添加劑；生產(chǎn)顆粒飼料添加劑的步驟簡便，無需引入包衣劑即可達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)的要求。為了便于理解，以下將通過具體的實施例對本發(fā)明進行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。另外，本發(fā)明引用了公開文獻，這些文獻是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過一樣。
具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容。如未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段和市售的常用儀器、試劑，可參見《分子克隆實驗指南(第3版)》(科學(xué)出版社)、《微生物學(xué)實驗(第4版)》(高等教育出版社)以及相應(yīng)儀器和試劑的廠商說明書等參考。實施例1 二氫吡啶二羧酸合成酶變體基因的制備根據(jù)我們設(shè)計的序列，通過商業(yè)途徑委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成編碼二氫吡啶二羧酸合成酶變體基因并構(gòu)建入大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭質(zhì)粒PMS2 (可購自美國典型微生物保藏中心(ATCC)，商品編號ATCC 67189)中?？寺∵^程參照《分子克隆實驗指南》 以及所用商品化試劑的操作指南進行，簡要過程如下通過DNA自動合成儀，合成二氫吡啶二羧酸合成酶變體基因的核酸片段，用T4多核苷酸激酶(購自TaKaRa公司)將這些核酸片段的5’端進行磷酸化，然后等摩爾比混合這5個核酸片段后于65°C變性5分鐘，退火降溫至16°C，加入T4 DNA連接酶(購自TaKaRa 公司)連接12小時。然后，取1 μ L上述連接產(chǎn)物在50 μ L反應(yīng)體積中進行PCR擴增，其中正向引物如序列表的SEQ ID Νο:3所示(引入了 EcoR I內(nèi)切酶位點)、反向引物如序列表的SEQ ID Νο:4所示(引入了 )(ba I內(nèi)切酶位點)，反應(yīng)條件為以94°C變性4分鐘，然后以94°C變性30秒、63°C退火60秒并72°C延伸30秒進行35個循環(huán)，最后以72°C延伸4分鐘并降溫至4°C。瓊脂糖凝膠電泳上述PCR產(chǎn)物，回收約0.91Λ大小的片段，用EcoR I和)(ba I雙酶切該片段，并與經(jīng)這兩個內(nèi)切酶酶切的PMS2質(zhì)粒用T4DNA連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌ToplOF’中。挑出陽性克隆，抽提出其中的質(zhì)粒，經(jīng)測序驗證，相應(yīng)核苷酸序列如序列表的SEQ ID No :1所示，順序編碼了如SEQ ID No :2所示的二氫吡啶二羧酸合成酶變體的完整0RF，由公司將構(gòu)建好的質(zhì)粒(命名為pMS2-dap)以及相應(yīng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化株(命名為 E. coli-cispnt)寄回。實施例2棒狀桿菌的發(fā)酵實驗通過電轉(zhuǎn)化法將pMS2-dap質(zhì)粒轉(zhuǎn)入L-賴氨酸發(fā)酵的棒狀桿菌工程菌(可購自美國典型微生物保藏中心(ATCC)，商品編號ATCC 31269)中，其簡要過程是將棒狀桿菌在 50mL LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至0D500達(dá)到0. 7，離心收集菌體，用0°C預(yù)冷的10% (V/ V)甘油溶液洗滌后將菌體重懸于200 μ L預(yù)冷的10% (V/V)甘油溶液中，加入pMS2-dap質(zhì)粒，混合均勻后轉(zhuǎn)移入0. Icm電擊杯中，于1. SkV持續(xù)5ms的條件進行電擊，然后立即加入 ImL含0. 5% (M/M)葡萄糖的液體LB培養(yǎng)基，于42°C溫浴5分鐘，然后涂布在含100 μ g/mL 氨芐青霉素和35 μ g/mL卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基上于30°C培養(yǎng)36小時。生長出的轉(zhuǎn)化菌株提取總DNA后，用上述正向引物和反向引物PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)有約0. 9kb 大小的片段，表明已經(jīng)將如序列表的SEQ ID No :1所示的基因構(gòu)建體導(dǎo)入了棒狀桿菌工程菌中。同時將PMS2質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入L-賴氨酸發(fā)酵的棒狀桿菌工程菌，形成陰性對照菌。將上述電轉(zhuǎn)化的陽性棒狀桿菌工程菌和陰性對照菌分別在液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至0D500達(dá)到0. 5，以5%的接種量接入賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基配方為 40g 蔗糖，20g NH4Cl, 2g CaCl2, Ig KH2PO4, Ig 蛋白胨，500mgMgS04 · 7H20，15mg FeSO4 · 7H20， IOmg MnSO4 · 7H20, 200 μ g 生物素，和 50 μ g 葉酸，用 Tris-HCl 調(diào)節(jié)至 ρΗ7· 3)中以 30°C振蕩(150rpm)培養(yǎng)72小時。離心收集培養(yǎng)基上清液(即，發(fā)酵液)，用紙層析法分離并定量培養(yǎng)基中的L-賴氨酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽性棒狀桿菌工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中L-賴氨酸的含量達(dá)到了 19. 6g/L，而陰性對照菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中L-賴氨酸的含量僅為12. Og/L，表明導(dǎo)入了如序列表的SEQ ID No :1所示的基因構(gòu)建體，產(chǎn)量提高了 63.3%，高于現(xiàn)有技術(shù)中導(dǎo)入野生型吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶的工程菌的產(chǎn)量提高比率。實施例3L-賴氨酸飼料添加劑的制備用實施例2制備的發(fā)酵液通過Simtar-III型超濾膜(可購自三達(dá)膜科技有限公司)進行膜分離。然后，將濾液直接以霧狀噴入流化床干燥機內(nèi)并保持尾氣溫度在80士3°C 不變，收集出料的顆粒。對出料的顆粒進行篩分，對于粒徑大于等于1. 5mm的顆粒送入破碎機破碎，然后將破碎后的顆粒與篩分得到的粒徑小于1. 5mm的顆?；旌喜⒃俅螄娙肓骰哺稍餀C內(nèi)并保持尾氣溫度在80士3°C不變，收集出料的顆粒并篩分出粒徑小于1. 5mm的顆粒，即為L-賴氨酸飼料添加劑。粒徑大于1. 5mm的顆粒再次破碎后，與下一批次的濾液干燥得到的出料的顆粒混合。以上制備的L-賴氨酸飼料添加劑經(jīng)檢測，含水量< 1 % ；顆粒粒徑小于1. 5mm,無明顯可見粉塵；混合變異系數(shù)為7 9 ；堆積密度為550 630g/L ；不含其他添加劑，完全達(dá)到了國家標(biāo)準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.L-賴氨酸的發(fā)酵方法，其包括(1)將編碼二氫吡啶二羧酸合成酶變體的多核苷酸導(dǎo)入產(chǎn)L-賴氨酸的菌，從而使所獲得的菌表達(dá)所述二氫吡啶二羧酸合成酶變體，其中所述二氫吡啶二羧酸合成酶變體在野生型二氫吡啶二羧酸合成酶的M13、V60或A83的位置上被其他天然氨基酸替換；和(2)在發(fā)酵條件下培養(yǎng)步驟(1)獲得的菌。
2.權(quán)利要求1所述的發(fā)酵方法，其中所述二氫吡啶二羧酸合成酶變體在野生型二氫吡啶二羧酸合成酶的M13、V60和A83的位置上被其他天然氨基酸替換，優(yōu)選替換選自M13K、 V60L 和 A83G。
3.權(quán)利要求2所述的發(fā)酵方法，其中所述二氫吡啶二羧酸合成酶變體的氨基酸序列如 SEQ ID No :1所示，優(yōu)選其由如SEQ ID No :2所示的核苷酸序列編碼。
4.權(quán)利要求1所述的發(fā)酵方法，其中所述多核苷酸是通過穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入產(chǎn)L-賴氨酸的菌的。
5.權(quán)利要求1所述的發(fā)酵方法，其中所述菌是棒狀桿菌。
6.權(quán)利要求5所述的發(fā)酵方法，其中所述發(fā)酵條件的發(fā)酵溫度為觀-351，優(yōu)選為 29-33 0C，更優(yōu)選為 30-32 0C，如 30 °C。
7.權(quán)利要求2所述的發(fā)酵方法，其中所述發(fā)酵條件的培養(yǎng)基包含糖，NH4Cl,CaCl2, KH2PO4,蛋白胨，MgSO4, FeSO4, MnSO4,生物素，和葉酸。
8.L-賴氨酸飼料添加劑的制備方法，其包括(1)實施權(quán)利要求1-7之任一所述的發(fā)酵方法的步驟O)；和(2)收集發(fā)酵液依次進行膜分離并對濾液進行噴霧干燥；(3)對步驟( 噴霧干燥獲得的顆粒進行篩分；(4)將篩分得到的粒徑大于等于1.5mm的顆粒破碎，并將其與篩分得到的粒徑小于 1. 5mm的顆粒混合，再次進行噴霧干燥；和(5)對步驟(4)噴霧干燥獲得的顆粒進行篩分，收集粒徑小于1.5mm的顆粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法得到的L-賴氨酸飼料添加劑。
10.二氫吡啶二羧酸合成酶變體及其編碼基因。
全文摘要
本發(fā)明提供了L-賴氨酸的發(fā)酵方法，其包括將編碼二氫吡啶二羧酸合成酶變體的多核苷酸導(dǎo)入產(chǎn)L-賴氨酸的菌，從而使所獲得的菌表達(dá)所述二氫吡啶二羧酸合成酶變體；和在發(fā)酵條件下培養(yǎng)獲得的菌。另外，本發(fā)明還提供了所述發(fā)酵方法中所用的中間產(chǎn)物，和利用所述發(fā)酵方法進一步生產(chǎn)產(chǎn)品等。
文檔編號A23K1/16GK102191289SQ201110065699
公開日2011年9月21日 申請日期2011年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月18日
發(fā)明者劉鑫, 孟剛, 曹洪, 程耀東, 陳崇安, 馬吉銀 申請人:寧夏伊品生物科技股份有限公司