專利名稱：一種利用卡那霉素葉片涂抹法田間篩選轉(zhuǎn)基因蘿卜的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為轉(zhuǎn)基因作物育種領(lǐng)域，具體涉及一種利用卡那霉素葉片涂抹法田間篩選轉(zhuǎn)基因蘿卜的方法
背景技術(shù)：
蘿卜(Raphanus sativus L.)，別名萊菔，蘆菔，屬十字花科蘿卜屬，根部為主要肉食器官，營養(yǎng)豐富，世界各地均有栽培。蘿卜的轉(zhuǎn)基因工作還處于起步階段，對于轉(zhuǎn)化材料的篩選與鑒定，使用傳統(tǒng)的分子檢測方法不僅工作量大、成本高，且不易操作。同時(shí)，對于獲得的植株還要對其后代的遺傳規(guī)律進(jìn)行研究，這些都需要大量的轉(zhuǎn)基因后代的篩選和鑒定工作。因此，利用簡便的標(biāo)記基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的快速檢測方法已越來越受到重視。卡那霉素(Kanamycin，簡寫Kan) 是目前被廣泛應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記基因，卡那霉素多用于組織培養(yǎng)階段對轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行初步篩選，再利用PCR、Southern blot雜交等方法檢測目的基因是否整合到植物基因組中?？敲顾靥镩g快速篩選轉(zhuǎn)基因植株的方法，在轉(zhuǎn)基因棉花、大豆、番茄、水稻、小麥中已有報(bào)道，但在轉(zhuǎn)基因蘿卜植株的篩選方面尚未見報(bào)道?？敲顾靥镩g快速選擇的效果因植物種類，以及對應(yīng)的涂抹濃度、觀測時(shí)間而變化很大。為此，此試驗(yàn)以帶有NPT II標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因蘿卜為材料，利用不同濃度卡那霉素葉片進(jìn)行葉片涂抹，以確定其適宜的涂抹濃度和觀測時(shí)間，并對卡那霉素涂抹方法的可靠性進(jìn)行了 PCR驗(yàn)證，其結(jié)果對于實(shí)現(xiàn)蘿卜田間轉(zhuǎn)基因植株的規(guī)?；焖龠x擇、加快育種進(jìn)程具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種利用卡那霉素葉片涂抹法田間篩選轉(zhuǎn)基因蘿卜的方法，確定了 Kan葉片涂抹田間篩選的最佳濃度、觀察時(shí)間；經(jīng)PCR檢測驗(yàn)證，Kan篩選抗性苗的陽性檢測率達(dá)到93.8%。研究建立了一種在田間對轉(zhuǎn)基因蘿卜進(jìn)行大量篩選的簡便方法，對于轉(zhuǎn)基因蘿卜材料的選育具有重要價(jià)值。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種卡那霉素葉片涂抹法田間篩選轉(zhuǎn)基因蘿卜的方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行(1)材料準(zhǔn)備試驗(yàn)材料為NPT II標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因蘿卜(為市售產(chǎn)品，購買于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所；也可通過常規(guī)基因工程技術(shù)獲得Bt基因構(gòu)建于質(zhì)粒pCMIaN中，選擇標(biāo)記為NPT II基因，農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化)(2)葉片卡那霉素涂抹適宜濃度和觀測時(shí)間的確定卡那霉素用附加0. 2%吐溫20的雙蒸水分別配制成Omg/L，250mg/L，500mg/L， 750mg/L，lOOOmg/L, 1500mg/L，2000mg/L，2500mg/L 濃度的 8 個(gè)處理，每處理重復(fù) 4 次，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)；Kan用毛筆涂抹于植株的完全展開的兩片真葉的中間葉片上，濕潤即可。分
3別在涂抹后第3、6、9、12、15天觀察記錄葉片的反應(yīng)情況，以確定蘿卜葉片的情況，卡那霉素篩選濃度和觀察時(shí)間。(3)轉(zhuǎn)基因Ttl代蘿卜卡那霉素涂抹篩選試驗(yàn)轉(zhuǎn)基因植株60個(gè)株系的后代Ttl代種子播種于育苗床，每株系40 150粒種子， 當(dāng)株高達(dá)到20 25cm時(shí)，按照上述方法用1000mg/L濃度的Kan進(jìn)行葉片涂抹，12天后調(diào)查結(jié)果，以處理部位葉面顏色正常為Kan抗性轉(zhuǎn)基因植株，葉面出現(xiàn)褪綠斑點(diǎn)的植株為Kan 敏感陰性植株。(4) Kan涂抹結(jié)果的PCR檢測驗(yàn)證為檢測Kan涂抹結(jié)果的可靠性，隨機(jī)挑選4個(gè)等級的68個(gè)轉(zhuǎn)化植株和1 個(gè)未轉(zhuǎn)化的植株為陰性對照，小量法抽提DNA，并利用BtCrylIa基因的引物Pl 5，-AGCCGTTTGTTAGTGCCT-3，；P2 :5，-ACTTGGATGCGGATGGAC-3，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條帶為 769bp，擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。所述的Kan葉片涂抹田間篩選的最佳濃度為1000mg/L，觀察時(shí)間以12天為宜。本發(fā)明取得的有益效果經(jīng)PCR檢測驗(yàn)證，Kan篩選抗性苗的陽性檢測率達(dá)到93.8%。研究建立了一種在田間對轉(zhuǎn)基因蘿卜進(jìn)行大量篩選的簡便方法，對于轉(zhuǎn)基因蘿卜材料的選育具有重要價(jià)值。
具體實(shí)施例方式下面對本發(fā)明作一詳細(xì)說明實(shí)施例1材料與方法1.1試驗(yàn)材料1. 1. 1植物材料(1)材料準(zhǔn)備試驗(yàn)材料為NPT II標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因蘿卜(為市售產(chǎn)品，購買于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所；也可通過常規(guī)基因工程技術(shù)獲得Bt基因構(gòu)建于質(zhì)粒pCMIaN中，選擇標(biāo)記為NPT II基因，農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化)1. 2葉片卡那霉素涂抹適宜濃度和觀測時(shí)間的確定卡那霉素用附加0. 2%吐溫20的雙蒸水分別配制成0mg/L，250mg/L，500mg/L， 750mg/L，lOOOmg/L, 1500mg/L，2000mg/L，2500mg/L 濃度的 8 個(gè)處理，每處理重復(fù) 4 次，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)；Kan用毛筆涂抹于植株的完全展開的兩片真葉的中間葉片上，濕潤即可。分別在涂抹后第3、6、9、12、15天觀察記錄葉片的反應(yīng)情況，以確定蘿卜葉片的情況，卡那霉素篩選濃度和觀察時(shí)間。1. 3轉(zhuǎn)基因TO代蘿卜卡那霉素涂抹篩選試驗(yàn)轉(zhuǎn)基因植株60個(gè)株系的后代TO代種子播種于育苗床，每株系40 150粒種子， 當(dāng)株高達(dá)到20 25cm時(shí)，按照上述方法用1000mg/L濃度的Kan進(jìn)行葉片涂抹，12天后調(diào)查結(jié)果，以處理部位葉面顏色正常為Kan抗性轉(zhuǎn)基因植株，葉面出現(xiàn)褪綠斑點(diǎn)的植株為Kan 敏感陰性植株。1. 4 Kan涂抹結(jié)果的PCR檢測驗(yàn)證
4
為檢測Kan涂抹結(jié)果的可靠性，隨機(jī)挑選4個(gè)等級的68個(gè)轉(zhuǎn)化植株和1個(gè)未轉(zhuǎn)化的植株(為陰性對照)，小量法抽提DNA，并利用引物(Pl 5‘-AGCCGTTTGTTAGTGCCT-3‘ ；P2 5’ -ACTTGGATGCGGATGGAC-3’ )進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條帶為769bp，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。2結(jié)果與分析2. 1蘿卜葉片對Kan處理后的變色效果以未轉(zhuǎn)化Bt基因蘿卜品種)(D2-A為供試材料，觀測了 Kan涂抹后葉片顏色的變化情況。根據(jù)田間觀察的結(jié)果，蘿卜葉片對Kan處理后的最終反應(yīng)程度劃分為4個(gè)等級。1 級涂抹部位葉色正常；2級葉片涂抹部位的葉色輕微變黃(與周邊正常葉色略有差異， 但不明顯)，葉色仍為綠色；3級涂抹部位失綠，葉色由綠轉(zhuǎn)黃，與周邊正常葉色差異明顯； 4級處理部位嚴(yán)重失綠，葉色轉(zhuǎn)白色或褐色。在以上4個(gè)等級中，葉片反應(yīng)處在1、2級的處理，未能完全消除蘿卜葉片自身對卡那霉素抗性的限度，在轉(zhuǎn)基因植株的檢測中，會增加假陽性單株的數(shù)量，從而影響選擇的效果。葉片在3級的處理，基本上消除了葉片自身對卡那霉素處理的負(fù)面效應(yīng)，可作為卡那霉素起始篩選的標(biāo)準(zhǔn)。2. 2 Kan的篩選濃度及觀察時(shí)間當(dāng)篩選濃度為250mg/L時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長葉片顏色幾乎無變化，主要呈現(xiàn)1 級反應(yīng)；當(dāng)篩選濃度為500mg/L時(shí)，葉片對Kan的反應(yīng)隨時(shí)間的延長變化不明顯，主要表現(xiàn)為2級反應(yīng)，因此若以上述濃度進(jìn)行篩選，會增加假陽性單株的數(shù)量，影響選擇的效果；當(dāng) Kan濃度彡1000mg/L時(shí)，葉片顏色迅速變黃，甚至枯死。因此，以1000mg/L作為篩選的臨界濃度較為理想，在該篩選濃度下，葉片失綠明顯，且隨著篩選時(shí)間的延長反應(yīng)級明顯升高， 便于區(qū)分和觀察。除250mg/L和500mg/L處理隨著時(shí)間的延長葉片反應(yīng)無明顯變化外，其他濃度處理，1 12天反應(yīng)級持續(xù)增高，12天后基本趨于穩(wěn)定，故觀察時(shí)間以12天為宜。2. 3 TO代轉(zhuǎn)基因蘿卜Kan涂抹結(jié)果用1000mg/L濃度的Kan進(jìn)行葉片涂抹，12天后可以看到，對照植株涂抹部位有明顯的褪綠斑點(diǎn)，而轉(zhuǎn)基因株系則表現(xiàn)為不明顯的褪綠。2. 4 Kan涂抹結(jié)果的PCR檢測驗(yàn)證隨機(jī)挑選1000mg/L濃度Kan涂抹篩選轉(zhuǎn)基因植株36株，其中1級反應(yīng)PCR檢測陽性率為100%，2級反應(yīng)PCR檢測陽性率為87. 5%，3、4級反應(yīng)PCR檢測陽性率均為0。對Kan表現(xiàn)高抗和抗性的植株(反應(yīng)1 2級)中，Kan涂抹檢測結(jié)果與PCR檢測結(jié)果的符合度為93.8%。由此表明，利用Kan葉片涂抹法可以快速、準(zhǔn)確的篩選轉(zhuǎn)基因蘿
卜植株的外源基因的情況，其涂抹檢測結(jié)果與PCR檢測具有較好的一致性。
權(quán)利要求
1.一種利用卡那霉素葉片涂抹法田間篩選轉(zhuǎn)基因蘿卜的方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行(1)材料準(zhǔn)備試驗(yàn)材料為NPTII標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因蘿卜；(2)葉片卡那霉素涂抹適宜濃度和觀測時(shí)間的確定卡那霉素用附加0. 2%吐溫20的雙蒸水分別配制成Omg/L，250mg/L，500mg/L，750mg/ L，lOOOmg/L, 1500mg/L，2000mg/L，2500mg/L濃度的8個(gè)處理，每處理重復(fù)4次，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)；Kan用毛筆涂抹于植株的完全展開的兩片真葉的中間葉片上，濕潤即可；分別在涂抹后第3、6、9、12、15天觀察記錄葉片的反應(yīng)情況，以確定蘿卜葉片的情況，卡那霉素篩選濃度和觀察時(shí)間；(3)轉(zhuǎn)基因Ttl代蘿卜卡那霉素涂抹篩選試驗(yàn)轉(zhuǎn)基因植株60個(gè)株系的后代Ttl代種子播種于育苗床，每株系40 150粒種子，當(dāng)株高達(dá)到20 25cm時(shí)，按照上述方法用1000mg/L濃度的Kan進(jìn)行葉片涂抹，12天后調(diào)查結(jié)果，以處理部位葉面顏色正常為Kan抗性轉(zhuǎn)基因植株，葉面出現(xiàn)褪綠斑點(diǎn)的植株為Kan敏感陰性植株；(4)Kan涂抹結(jié)果的PCR檢測驗(yàn)證為檢測Kan涂抹結(jié)果的可靠性，隨機(jī)挑選4個(gè)等級的68個(gè)轉(zhuǎn)化植株和1個(gè)未轉(zhuǎn)化的植株為陰性對照，小量法抽提DNA，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條帶為769bp，擴(kuò)增產(chǎn)物用 1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟(2)中Kan葉片涂抹田間篩選的最佳濃度為1000mg/L，觀察時(shí)間為12天。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的步驟⑷中設(shè)計(jì)引物具體為P1 5，-AGCCGTTTGTTAGTGCCT-3，；P2 :5’ -ACTTGGATGCGGATGGAC-3，。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用卡那霉素葉片涂抹法田間篩選轉(zhuǎn)基因蘿卜的方法，試驗(yàn)材料為NPT II標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因蘿卜，Kan葉片涂抹田間篩選的最佳濃度為1000mg/L，觀察時(shí)間以12天為宜；經(jīng)PCR檢測驗(yàn)證，Kan篩選抗性苗的陽性檢測率達(dá)到93.8％。研究建立了一種在田間對轉(zhuǎn)基因蘿卜進(jìn)行大量篩選的簡便方法，對于轉(zhuǎn)基因蘿卜材料的選育具有重要價(jià)值。
文檔編號A01G1/00GK102217472SQ20111006544
公開日2011年10月19日 申請日期2011年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月18日
發(fā)明者丁自立, 何云啟, 崔磊, 張興中, 梅時(shí)勇, 梅雪飛, 王晴芳, 甘彩霞, 高翔, 黃來春 申請人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所