專利名稱：一種蘿卜與苤藍屬間雜種胚離體培養(yǎng)的方法
技術領域：
本發(fā)明為植物組織培養(yǎng)快速繁殖領域，具體涉及一種蘿卜與苤藍屬間雜種胚離體培養(yǎng)的方法。
背景技術：
蘿卜(Raphanus sativus L.)是我國栽培的主要蔬菜作物之一，十字花科、蘿卜屬，一、二年生草本植物。原產(chǎn)我國，各地均有栽培，品種極多，常見有白皮蘿卜、紅皮蘿卜、 青皮蘿卜等。根供食用，鮮食生食均可，種子含油42%，可用于制肥皂或作潤滑油。種子、 鮮根、葉均可入藥，功能下氣消積，生蘿卜含淀粉酶，能助消化。苤藍(Brassica oleracea var. carlorapa D. C.)又名球莖甘藍，俗名擘藍、玉蔓青。十字花科，蕓薹屬，一、二年生草本植物。其食用部分為肉質球莖，質脆嫩，可鮮食及腌制。苤藍是甘藍中能形成肉質莖的一個變種，與結球甘藍相比，其食用部位不同。苤藍依球莖的色澤可分為綠白色、綠色及紫色三種；依生長期的長短可分為小型的早熟種和大型的晚熟種。長江流域生長期較短，應栽培早、中熟品種。苤藍適應性強易栽培，耐貯藏、運輸。其生物學物征、特性、栽培管理技術， 均與甘藍相似。蘿卜和苤藍均為根用蔬菜，但兩者的風味不同，到目前為止，還沒有見兩者遠緣雜交研究方面的報道。為此，本發(fā)明對兩者進行屬間雜交，初步研究了雜交親和性的表現(xiàn)，以及對雜種胚搶救培養(yǎng)方法進行探討。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種蘿卜與苤藍屬間雜種胚離體培養(yǎng)的方法，獲得蘿卜與苤藍屬間雜種胚，獲得雜種胚幼苗，以利于得到育種新資源。本發(fā)明采用的技術方案是一種蘿卜與苤藍屬間雜種胚離體培養(yǎng)的方法，其特征在于按以下步驟依次組成(1)材料準備以蘿卜雄性不育系為母本，以苤藍為父本；(2)播種大頭菜和苤藍種子播種在試驗大棚里，對其進行常規(guī)田間管理；(3)雜交方法在母本抽薹后開花前進行單株隔離，防止與其他十字花科植株串粉；開花后取父本有粉花朵對母本進行重復授粉，掛牌標記雜交組合、花朵數(shù)和授粉時間； 授粉后跟蹤觀察莢的生長發(fā)育，并測量雜種莢的長度和橫徑；(4)胚胎搶救1)取材考慮到目的材料的含水量，非雨天在上午10:00以后采莢，雨天一般在下午14:00后取材；2)材料處理將材料置于燒杯中，加清水將材料清洗片刻，切除果柄備用。在超凈工作臺上將材料置于小燒杯中，用75 %酒精浸泡30秒，再用0. 1 %的升汞浸泡8分鐘，最后用無菌水沖洗3次，每次3分鐘；3)接種將莢果置于滅菌牛皮紙上，剝出胚珠接種于誘導培養(yǎng)基上；。4)培養(yǎng)接種后的培養(yǎng)基置于溫度25°C、光照時間16h. d_l、光照強度2000 30001x的培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)。30天左右，誘導出胚性愈傷組織。然后將胚性愈傷組織轉移到繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。大約15天左右，將愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上。待綠芽長到 2-3cm時，轉到生根培養(yǎng)基培養(yǎng)；5)煉苗打開瓶口，在培養(yǎng)室煉苗2-3天，轉到自然條件下煉苗2-3天；6)移栽洗去小苗表面的培養(yǎng)基，移栽到小盆里，成活后移栽到大田；步驟中為了增加花粉與柱頭的親和性，采用的是重復授粉法連續(xù)授粉7天， 并注意觀察花粉與柱頭的親和性。步驟(4)種取材材料為采取授粉后3-7天的正常生長莢，連同果柄一同摘取。所述的培養(yǎng)基配方分別為誘導培養(yǎng)基MS+2，4-D 2. Omg/1+KT 0. 5mg/l+蔗糖 3 % + 瓊脂 0. 6 % ；繼代培養(yǎng)基:MS+2,4-D 2. Omg/1+KT 0. 5mg/l+ 蔗糖 30g/l+ 瓊脂 0.6% ；分化培養(yǎng)基MS+IAA 0. 5mg/l+KT 1. 5mg/l+蔗糖3 % +瓊脂0. 6 % ；生根培養(yǎng)基: 1/2MS+NAA0. 2mg/l+IAA0. 5mg/l+ 蔗糖 3% + 瓊脂 0. 6%。本發(fā)明取得了以下有益效果(1)蘿卜與苤藍屬間雜交未見報道，填補相關研究空白；(2)確定了蘿卜與苤藍屬間雜種胚胚搶救的最佳時間蘿卜與苤藍雜交的雜交莢莢長快速生長期是在授粉后的第2至第5天，而橫徑快速生長期是在授粉后第2至第4天。 雜種胚適宜的搶救期是在授粉后第6天、第7天進行；(3)確定了雜種胚胚搶救的培養(yǎng)階段和具體的培養(yǎng)基配方。(4)采用本試驗所提到的生芽和生根培養(yǎng)基能培育出成功的試管苗有利于種資資源的創(chuàng)新。
具體實施例方式下面對本發(fā)明作一詳細說明實施例1材料與方法1. 1 材料以蘿卜DH303A雄性不育系Qn = 18)植株7株為母本，分別掛牌標記為A、B、C、 D、E、F、G株，以苤藍為父本。試驗在湖北省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜科技研究中心基地完成。1. 2 方法1. 2. 1雜交方法在母本抽薹后開花前進行單株隔離，防止與其他十字花科植株串粉；開花后取父本有粉花朵對母本進行重復授粉，掛牌標記雜交組合、花朵數(shù)和授粉時間。授粉后跟蹤觀察莢的生長發(fā)育，并測量雜種莢的長度和橫徑。1.2.2雜種胚搶救由于遠緣雜交中，雜種胚往往是敗育的，需要對雜種胚胎進行胚搶救，需要在胚胎敗育之前獲取離體胚胎，根據(jù)觀察所得經(jīng)驗，取3、4、5、6、7天的莢，進行胚胎搶救。其胚搶救的培養(yǎng)基如下誘導培養(yǎng)基:MS+2,4-D2. Omg/1+KT 0. 5mg/l+ 蔗糖 3% + 瓊脂 0. 6%繼代培養(yǎng)基MS+2，4-D2. Omg/1+KT 0. 5mg/l+ 蔗糖 30g/l+ 瓊脂 0. 6%
分化培養(yǎng)基:MS+IAA0. 5mg/l+KT 1. 5mg/l+ 蔗糖 3% + 瓊脂 0. 6%生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.2mg/l+IAA0. 5mg/l+ 蔗糖 3 % + 瓊脂 0.6%胚搶救過程1)取材考慮到目的材料的含水量，非雨天在上午10:00以后采莢，雨天一般在下午14:00后取材。采取授粉后3-7天的正常生長莢，連同果柄一同摘取。2)材料處理將材料置于燒杯中，加清水將材料清洗片刻，切除果柄備用。在超凈工作臺上將材料置于小燒杯中，用75 %酒精浸泡30秒，再用0. 1 %的升汞浸泡8分鐘，最后用無菌水沖洗3次，每次3分鐘。3)接種將莢果置于滅菌牛皮紙上，剝出胚珠接種于誘導培養(yǎng)基上。4)培養(yǎng)接種后的培養(yǎng)基置于溫度25°C、光照時間16h. cf1、光照強度2000 30001x的培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)。30天左右，誘導出胚性愈傷組織。然后將胚性愈傷組織轉移到繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。大約15天左右，將愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上。待綠芽長到 2-3cm時，轉到生根培養(yǎng)基培養(yǎng)。5)煉苗。打開瓶口，在培養(yǎng)室煉苗2-3天，轉到自然條件下煉苗2-3天。6)移栽。洗去小苗表面的培養(yǎng)基，移栽到小盆里，成活后移栽到大田。2結果與分析2. 1蘿卜X苤藍雜交親和性表現(xiàn)表1蘿卜X苤藍雜交若干天后的結莢數(shù)*
權利要求
1.一種蘿卜與苤藍屬間雜種胚離體培養(yǎng)的方法，其特征在于按以下步驟依次組成(1)材料準備以蘿卜雄性不育系為母本，以苤藍為父本；(2)播種大頭菜和苤藍種子播種在試驗大棚里，對其進行常規(guī)田間管理；(3)雜交方法在母本抽薹后開花前進行單株隔離，防止與其他十字花科植株串粉；開花后取父本有粉花朵對母本進行重復授粉，掛牌標記雜交組合、花朵數(shù)和授粉時間；授粉后跟蹤觀察莢的生長發(fā)育，并測量雜種莢的長度和橫徑；(4)胚胎搶救1)取材考慮到目的材料的含水量，非雨天在上午10:00以后采莢，雨天一般在下午 14:00后取材；2)材料處理將材料置于燒杯中，加清水將材料清洗片刻，切除果柄備用。在超凈工作臺上將材料置于小燒杯中，用75%酒精浸泡30秒，再用0. 1 %的升汞浸泡8分鐘，最后用無菌水沖洗3次，每次3分鐘；3)接種將莢果置于滅菌牛皮紙上，剝出胚珠接種于誘導培養(yǎng)基上；。4)培養(yǎng)接種后的培養(yǎng)基置于溫度25°C、光照時間16h.d-1、光照強度2000 30001x 的培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)。30天左右，誘導出胚性愈傷組織。然后將胚性愈傷組織轉移到繼代培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。大約15天左右，將愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上。待綠芽長到2-3cm 時，轉到生根培養(yǎng)基培養(yǎng)；5)煉苗打開瓶口，在培養(yǎng)室煉苗2-3天，轉到自然條件下煉苗2-3天；6)移栽洗去小苗表面的培養(yǎng)基，移栽到小盆里，成活后移栽到大田；
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中為了增加花粉與柱頭的親和性， 采用的是重復授粉法。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟(4)中取材材料為采取授粉后3-7 天的正常生長莢。
4.如權利要求1-3之一所述的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基配方分別為誘導培養(yǎng)基MS+2，4-D 2. Omg/1+KT 0. 5mg/+ 蔗糖 3% + 瓊脂 0. 6% ；繼代培養(yǎng)基MS+2，4_D 2. Omg/ 1+KT 0. 5mg/l+ 蔗糖 30g/l+ 瓊脂 0.6% ；分化培養(yǎng)基MS+IAA 0. 5mg/l+KT 1. 5mg/l+ 蔗糖 3% + 瓊脂 0.6% ；生根培養(yǎng)基:1/2MS+NAA0. 2mg/l+IAA0. 5mg/l+ 蔗糖 3% + 瓊脂 0.6%o
全文摘要
一種蘿卜與苤藍屬間雜種胚離體培養(yǎng)的方法，其特征在于按以下步驟依次組成(1)材料準備、(2)播種、(3)雜交、(4)胚胎搶救，采用本發(fā)明的方法成功獲得蘿卜與苤藍屬間雜種胚，并培養(yǎng)出雜種胚幼苗，以利于得到育種新資源。
文檔編號A01H4/00GK102210258SQ20111006545
公開日2011年10月12日 申請日期2011年3月18日 優(yōu)先權日2011年3月18日
發(fā)明者丁自立, 何云啟, 崔磊, 張興中, 梅時勇, 梅雪飛, 王晴芳, 甘彩霞, 高翔, 黃來春 申請人:湖北省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所