篩選抗分解代謝產(chǎn)物阻遏效應(yīng)的產(chǎn)纖維素酶高效突變子的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了篩選抗分解代謝產(chǎn)物阻遏效應(yīng)的產(chǎn)纖維素酶高效突變子的方法，(1)篩選培養(yǎng)基、驗(yàn)證培養(yǎng)基及搖瓶培養(yǎng)基的制備；(2)通過菌種誘變并對(duì)突變子進(jìn)行初步篩選；(3)通過搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)對(duì)突變子進(jìn)行確認(rèn)及多次驗(yàn)證。本發(fā)明方法有效篩選出抗分解代謝產(chǎn)物阻遏的木霉、青霉及曲霉高效產(chǎn)酶突變子，使真菌發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的過程中對(duì)葡萄糖等易利用碳源的限制解除，發(fā)酵可以通過添加葡萄糖作為能源加快發(fā)酵過程并提高發(fā)酵酶活，可有效的提高木霉、青霉及曲霉等纖維素酶生產(chǎn)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶效率并降低成本。
【專利說明】篩選抗分解代謝產(chǎn)物阻遏效應(yīng)的產(chǎn)纖維素酶高效突變子的 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于菌種改良領(lǐng)域，具體地說是涉及一種通過菌種誘變獲得抗分解代謝產(chǎn) 物阻遏效應(yīng)的突變子從而提高木霉、曲霉、青霉等真菌發(fā)酵產(chǎn)生纖維素酶活的方法。 技術(shù)背景
[0002] 木霉屬（fricAoofe/maspp·)、曲霉屬 C4>s776?rgi77w>sspp·)、青霉屬 spp.)等真菌由于具有較強(qiáng)的纖維素酶活力而被廣泛的研究及應(yīng)用，其中木霉屬中的里氏 木霉reesei)、曲霉中的黑曲霉)及青霉屬中的斜臥青 霉等菌株所分泌的纖維素酶具有產(chǎn)量高、種類相對(duì)齊全等特點(diǎn)， 是工業(yè)生產(chǎn)纖維素酶的主要菌株。它們所能合成的纖維素酶包括外切-β -1，4-葡聚糖 酶（6叉〇-6-1，4-8111。&]1&86)、內(nèi)切-6-1，4-葡聚糖酶（611(1〇-6-1，4-區(qū)111。&仙86)和3-葡萄糖苷酶（β-1，4-glucosedase)等三大類中的數(shù)十種，常見的有2種外切酶（CBH I、 CBHΠ )、5種內(nèi)切酶（EGI、EGΠ 、EGm、EGIV和EGV)及2個(gè)葡萄糖苷酶（BGI、BGΠ )。
[0003] 纖維素酶是誘導(dǎo)酶，其表達(dá)能力不僅與基因調(diào)控序列有關(guān)，而且同外源誘導(dǎo)物有 關(guān)。纖維素酶的誘導(dǎo)物質(zhì)主要是一些糖類，包括聚糖、寡糖和單糖等。其中以纖維素、槐糖 的誘導(dǎo)效果最好，乳糖和纖維二糖的誘導(dǎo)效果次之，山梨糖不僅具有誘導(dǎo)作用，并且可以促 進(jìn)胞外蛋白的分泌。不同誘導(dǎo)劑的物理性質(zhì)不同，如纖維素是不可溶性物質(zhì)，而其他糖類為 可溶物質(zhì)，這也造成了不同誘導(dǎo)劑進(jìn)入胞內(nèi)的方式不同，進(jìn)入胞內(nèi)所激發(fā)的的誘導(dǎo)方式也 不盡相同，這也造成了誘導(dǎo)體系的復(fù)雜性。
[0004] 纖維素酶表達(dá)是功能基因表達(dá)、誘導(dǎo)物正向激活和分解代謝產(chǎn)物阻遏機(jī)制共同作 用結(jié)果。引起分解代謝產(chǎn)物阻遏機(jī)制的常見物質(zhì)有甘油和葡萄糖等容易利用碳源；在產(chǎn)酶 真菌的發(fā)酵過程中，葡萄糖等物質(zhì)的存在會(huì)嚴(yán)重抑制纖維素酶的合成，該過程中起主要作 用的是CRE I (里氏木霉及斜臥木霉）或CREA (黑曲霉）阻遏蛋白，高濃度的葡萄糖可顯著 增加 cre7 mRNA或ere Z mRNA的表達(dá)水平。CRE A對(duì)黑曲霉中的木聚糖酶基因及多種纖維 素酶基因有較強(qiáng)的阻遏效應(yīng)；而CRE I對(duì)里氏木霉中的9種纖維素酶基因及斜臥青霉中的 6種主要纖維素酶基因均有阻遏效應(yīng);crW (ere X)基因缺陷性的菌種即使在含有葡萄糖 的培養(yǎng)基中也能夠產(chǎn)生纖維素酶，工業(yè)中應(yīng)用極為廣泛的里氏木霉Rut C-30就是cre7基因 突變?nèi)毕菪跃辍?br> [0005] 里氏木霉、黑曲霉及斜臥青霉等菌株的發(fā)酵碳源往往是難以利用的纖維素類物 質(zhì)，葡萄糖含量很低甚至沒有，這雖然避免了分解代謝產(chǎn)物阻遏效應(yīng)所造成的發(fā)酵酶活偏 低的問題，但是由于纖維素類物質(zhì)較難進(jìn)入菌體生理代謝，從而導(dǎo)致發(fā)酵過程菌體生長緩 慢，不僅延長了發(fā)酵時(shí)間，并且對(duì)總酶活的提升有嚴(yán)重影響。若能使菌株獲得抗分解代謝產(chǎn) 物阻遏效應(yīng)，則可以在發(fā)酵產(chǎn)酶中通過在初始培養(yǎng)基中加入適量的葡萄糖等快速利用碳源 從而使菌體大量快速生長，提高菌體總量并提前進(jìn)入產(chǎn)酶狀態(tài)；此外還可以通過發(fā)酵中途 補(bǔ)加葡萄糖以期延長菌種的次生代謝階段及產(chǎn)酶時(shí)間，從而獲得活力更高的纖維素酶。
[0006] 葡萄糖雖然對(duì)里氏木霉、黑曲霉、斜臥青霉等真菌的產(chǎn)酶過程具有阻遏效應(yīng)，但是 它可以被當(dāng)碳源或能源物質(zhì)被迅速消耗，從而削弱甚至解除分解代謝產(chǎn)物阻遏效應(yīng)；2-去 氧基葡萄糖是葡萄糖的衍生物，該物質(zhì)為非代謝型天然六碳糖，并不能作為碳源或能源物 質(zhì)被進(jìn)入微生物生理代謝途徑；與葡萄糖相同，2-去氧基葡萄糖同樣對(duì)里氏木霉等產(chǎn)酶真 菌同樣具備分解代謝產(chǎn)物阻遏效應(yīng)，能有效抑制里氏木霉等真菌產(chǎn)纖維素酶。由于以上特 性，2-去氧基葡萄糖能對(duì)里氏木霉等真菌的產(chǎn)酶過程起到持續(xù)阻遏效應(yīng)，利用這一性質(zhì)可 以在對(duì)里氏木霉等真菌進(jìn)行菌種誘變后將2-去氧基葡萄糖作為底物加入到培養(yǎng)基中，從 而為獲得具有抗分解代謝產(chǎn)物阻遏效應(yīng)的改良菌株提供了可能。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是：提供一種篩選抗分解代謝產(chǎn)物阻遏效應(yīng)的產(chǎn)纖維素酶高效突 變子的方法，通過對(duì)木霉、曲霉及青霉屬中的纖維素酶生產(chǎn)菌株進(jìn)行菌種誘變，制備含有 2_去氧基葡萄糖作為分解代謝產(chǎn)物阻遏物質(zhì)，并以預(yù)處理水稻秸桿為單一碳源的篩選培養(yǎng) 基和驗(yàn)證培養(yǎng)基，從而對(duì)誘變菌株進(jìn)行篩選，進(jìn)一步獲得具有抗分解代謝產(chǎn)物阻遏效應(yīng)的 纖維素酶高效產(chǎn)酶突變菌株。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：該篩選抗分解代謝產(chǎn)物阻遏效應(yīng)的纖維素酶高效產(chǎn)酶 突變子的方法包括如下具體步驟： (1) 培養(yǎng)基的制備 篩選培養(yǎng)基成分如下（l〇〇mL體系）：預(yù)處理水稻秸桿粉末1% ; ΚΗ2Ρ04 0. 2% ; (NH4) 2S04 〇· 3% ;剛果紅(λ 1% ;瓊脂粉2% ;2-去氧基葡萄糖50ppm (w/v); 搖瓶培養(yǎng)基成分如下（l〇〇mL體系）：預(yù)處理水稻秸桿2% ;KH2P04 0. 2% ; (NH4) 2S04 0. 3% ; 驗(yàn)證培養(yǎng)基成分如下（l〇〇mL體系）：預(yù)處理水稻秸桿2% ;KH2P04 0. 2% ; (NH4) 2S04 0. 3% ; 2-去氧基葡萄糖0. 05 %(w/v); 水稻秸桿預(yù)處理方法：將自然風(fēng)干的水稻秸桿置于1. 2-2Mpa的高壓蒸氣中處理 5-10min，再將其用自來水沖洗2-4次，隨后置于60°C烘箱中過夜； 2_去氧基葡萄糖滅菌方法：以蒸餾水為溶劑制備質(zhì)量濃度0. 1%的2-去氧基葡萄糖母 液，于115°C下滅菌30min，隨后將滅過菌的母液加入滅過菌的篩選培養(yǎng)基中使其最終濃度 達(dá)到50ppm(W/v)，將滅過菌的母液加入到滅過菌的驗(yàn)證培養(yǎng)基中使其最終濃度達(dá)到0. 05% (w/v)； (2) 抗分解代謝產(chǎn)物阻遏突變子的初步篩選：將提前制備好的真菌孢子懸液置于30°C 恒溫?fù)u床內(nèi)培養(yǎng)30min，以提高休眠孢子成活率，之后進(jìn)行菌種誘變(物理誘變、化學(xué)誘變)， 使孢子致死率達(dá)70%-90%，隨后均勻涂布于篩選培養(yǎng)基表面，置于30°C恒溫箱中避光培養(yǎng)； 將原始菌株的孢子涂布篩選平板作為對(duì)照；避光培養(yǎng)70-80h后，觀察并記錄篩選培養(yǎng)基中 的菌落形態(tài)，挑選直徑大于對(duì)照組原始菌株單菌落30%，且菌落直徑與產(chǎn)孢區(qū)直徑比值大于 2的單菌落，將其作為待確認(rèn)突變子； (3) 突變子的確認(rèn)及驗(yàn)證：將步驟2中篩選出的突變子轉(zhuǎn)接至3ml PDB試管中（2個(gè)重 復(fù)）；30°C恒溫?fù)u床內(nèi)培養(yǎng)24h，隨后將其分別接種于驗(yàn)證培養(yǎng)基和搖瓶培養(yǎng)基中，160 rpm 轉(zhuǎn)速下30°C恒溫培養(yǎng)；將其原始菌株作為對(duì)照做以上相同處理；于發(fā)酵開始后120h-180h 取發(fā)酵液樣品lml，離心取上清液；通過國標(biāo)法測(cè)定上清液的纖維素酶的濾紙片酶活（FPU); 若在搖瓶培養(yǎng)基中突變子的FPU酶活大于原始菌株FPU的120% ;并且該突變子在驗(yàn)證培養(yǎng) 基的FPU酶活大于其在搖瓶培養(yǎng)基的90%，則初步斷定該突變子為正突變子；之后重復(fù)（3) 中上述步驟三次，若結(jié)果一致，則確定該突變子為抗分解代謝產(chǎn)物阻遏高效產(chǎn)酶突變子。
[0009] 本發(fā)明特征效果如下：通過本發(fā)明方法可以有效篩選出抗分解代謝產(chǎn)物阻遏的木 霉、青霉及曲霉高效產(chǎn)酶突變子，并使真菌發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的過程中對(duì)葡萄糖等易利用碳 源的限制解除，發(fā)酵可以通過添加葡萄糖作為能源加快發(fā)酵過程并提高發(fā)酵酶活，可有效 的提高木霉、青霉及曲霉等纖維素酶生產(chǎn)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶效率并降低成本。

【具體實(shí)施方式】
[0010] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這 些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0011] 實(shí)施例1 :選取里氏木霉Rut C-30作為原始菌株，30°C下對(duì)孢子懸浮液溫浴培養(yǎng) 30min后，使用20w功率的紫外燈于50cm高度照射2min，使孢子致死率達(dá)88. 7% ;將經(jīng)紫外 誘變的孢子懸液涂布于初篩平板培養(yǎng)72h進(jìn)行菌落觀察，發(fā)現(xiàn)編號(hào)為RUV1-1的菌株菌落直 徑為1. 5cm，為原始菌種（1. lcm)的1.36倍，菌落直徑（1.5cm)與產(chǎn)孢區(qū)直徑（0.6)的比值 為2. 5倍；經(jīng)過三次搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)RUV1-1于120h的FPU酶活分別為1. 28U、1. 21U及1. 10U， 分別為相同條件下RutC-30 FPU酶活（三次相對(duì)應(yīng)的酶活為0. 91U、0. 87U、0. 82U)的1. 41 倍、1. 39倍及1. 34倍；經(jīng)過三次驗(yàn)證培養(yǎng)基發(fā)酵實(shí)驗(yàn)RUV1-1于124h的FPU酶活分別為 1. 16U、1. 17U、1. 21U，分別為RUV1-1在搖瓶發(fā)酵酶活（三次相對(duì)應(yīng)的酶活為1. 28U、1. 21U 及1. 10U)的90. 6%、96. 7%及110% ;Rut C-30在驗(yàn)證培養(yǎng)基中的三次酶活分別為0. 64U、 0. 52U及0. 57U，分別為其在搖瓶發(fā)酵酶活（三次相對(duì)應(yīng)的酶活為0. 91U、0. 87U、0. 82U)的 70. 3%、59. 8%及69. 5%。表明RUV1-1是具備抗分解代謝產(chǎn)物阻遏效應(yīng)的高效產(chǎn)酶突變子。
[0012] 實(shí)施例2 :選取里氏木霉QM9414作為原始菌種，30°C下對(duì)其孢子懸浮液溫浴培養(yǎng) 30min后，加入等體積的500 μ g/ml NTG使孢子懸浮液終濃達(dá)107, NTG濃度達(dá)250 μ g /ml， 30°C水浴處理25min，使孢子致死率達(dá)71. 5% ;將經(jīng)NTG化學(xué)誘變的孢子懸液涂布于初篩平 板，培養(yǎng)80h時(shí)進(jìn)行菌落觀察，編號(hào)為QNTG-12的菌落直徑為1. 6cm，為原始菌株（0. 9cm)的 1. 78倍，菌落直徑（1. 7cm)與產(chǎn)孢區(qū)直徑（0. 8cm)的比值為2. 13倍；經(jīng)過三次搖瓶發(fā)酵實(shí) 驗(yàn)QNTG-12于180h的FPU酶活分別為1. 43U、1. 34U及1. 28U，分別為QM9414 FPU酶活（三 次相對(duì)應(yīng)的酶活為〇. 72U、0. 68U、0. 77U)的1. 99倍、1. 97倍及1. 66倍；經(jīng)過三次驗(yàn)證培養(yǎng) 基發(fā)酵實(shí)驗(yàn)QNTG-12于144h的FPU酶活分別為1. 36U、1. 28U、1. 24U，分別為QNTG-12在搖 瓶發(fā)酵酶活（1. 43U、1. 34U及1. 28U)的95. 1%、95. 5%及96. 9% ;QM9414在驗(yàn)證培養(yǎng)基中的 三次酶活分別為〇. 44U、0. 32U及0. 37U分別為其在搖瓶發(fā)酵酶活（三次相對(duì)應(yīng)的酶活為 0. 72U、0. 68U、0. 77U)的61. 1%、47. 1%及48. 1%。表明QNTG-12是具備較強(qiáng)抗分解代謝產(chǎn)物 阻遏效應(yīng)的高效產(chǎn)酶突變子。
[0013] 實(shí)施例3 :選取由里氏木霉QM9414經(jīng)過NTG化學(xué)誘變獲得的高效產(chǎn)酶突變子 QNT-45為原始菌種，30°C下對(duì)其孢子懸浮液溫浴培養(yǎng)30min后，使用20w功率的紫外燈 于50cm高度照射2min 30s，使孢子致死率達(dá)82. 1% ;將經(jīng)紫外誘變的孢子懸液涂布于初篩 平板培養(yǎng)75h進(jìn)行菌落觀察，發(fā)現(xiàn)編號(hào)為QNT-UV-8的菌株菌落直徑為1. 4cm，為原始菌種 (1.0cm)的1.40倍，菌落直徑（1.4cm)與產(chǎn)孢區(qū)直徑（0.5)的比值為2. 8倍；經(jīng)過三次搖瓶
【權(quán)利要求】
1. 篩選抗分解代謝產(chǎn)物阻遏效應(yīng)的產(chǎn)纖維素酶高效突變子的方法，其特征是該方法包 括以下步驟： (1) 培養(yǎng)基的制備 篩選培養(yǎng)基成分如下（lOOmL體系）：預(yù)處理水稻秸桿粉末1% ; ΚΗ2Ρ04 0. 2% ; (NH4) 2S04 〇· 3% ;剛果紅(λ 1% ;瓊脂粉2% ;2-去氧基葡萄糖50ppm (w/v); 搖瓶培養(yǎng)基成分如下（l〇〇mL體系）：預(yù)處理水稻秸桿2% ;KH2P04 0. 2% ; (NH4) 2S04 0. 3% ; 驗(yàn)證培養(yǎng)基成分如下（l〇〇mL體系）：預(yù)處理水稻秸桿2% ;KH2P04 0. 2% ; (NH4) 2S04 0. 3% ; 2-去氧基葡萄糖0. 05 %(w/v); 水稻秸桿預(yù)處理方法：將自然風(fēng)干的水稻秸桿置于1. 2-2Mpa的高壓蒸氣中處理 5-10min，再將其用自來水沖洗2-4次，隨后置于60°C烘箱中過夜； 2_去氧基葡萄糖滅菌方法：以蒸餾水為溶劑制備質(zhì)量濃度0. 1%的2-去氧基葡萄糖母 液，于115°C下滅菌30min，隨后將滅過菌的母液加入滅過菌的篩選培養(yǎng)基中使其最終濃度 達(dá)到50ppm(W/v)，將滅過菌的母液加入到滅過菌的驗(yàn)證培養(yǎng)基中使其最終濃度達(dá)到0. 05% (w/v)； (2) 抗分解代謝產(chǎn)物阻遏突變子的初步篩選：將提前制備好的真菌孢子懸液置于30°C 恒溫?fù)u床內(nèi)培養(yǎng)30min，以提高休眠孢子成活率，之后進(jìn)行菌種誘變(物理誘變、化學(xué)誘變)， 使孢子致死率達(dá)70%-90%，隨后均勻涂布于篩選培養(yǎng)基表面，置于30°C恒溫箱中避光培養(yǎng)； 將原始菌株的孢子涂布篩選平板作為對(duì)照；避光培養(yǎng)70-80h后，觀察并記錄篩選培養(yǎng)基中 的菌落形態(tài)，挑選直徑大于對(duì)照組原始菌株單菌落30%，且菌落直徑與產(chǎn)孢區(qū)直徑比值大于 2的單菌落，將其作為待確認(rèn)突變子； (3) 突變子的確認(rèn)及驗(yàn)證：將步驟2中篩選出的突變子轉(zhuǎn)接至3ml PDB試管中（2個(gè)重 復(fù)）；30°C恒溫?fù)u床內(nèi)培養(yǎng)24h，隨后將其分別接種于驗(yàn)證培養(yǎng)基和搖瓶培養(yǎng)基中，160 rpm 轉(zhuǎn)速下30°C恒溫培養(yǎng)；將其原始菌株作為對(duì)照做以上相同處理；于發(fā)酵開始后120h-180h 取發(fā)酵液樣品lml，離心取上清液；通過國標(biāo)法測(cè)定上清液的纖維素酶的濾紙片酶活（FPU); 若在搖瓶培養(yǎng)基中突變子的FPU酶活大于原始菌株FPU的120% ;并且該突變子在驗(yàn)證培養(yǎng) 基的FPU酶活大于其在搖瓶培養(yǎng)基的90%，則初步斷定該突變子為正突變子；之后重復(fù)（3) 中上述步驟三次，若結(jié)果一致，則確定該突變子為抗分解代謝產(chǎn)物阻遏高效產(chǎn)酶突變子。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選抗分解代謝產(chǎn)物阻遏效應(yīng)的產(chǎn)纖維素酶高效突變子的 方法，其特征是：步驟（2)中所使用的菌為木霉、黑曲霉或斜臥青霉。
【文檔編號(hào)】C12R1/885GK104059904SQ201410269186
【公開日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年6月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月17日
【發(fā)明者】賀建龍, 熊鵬, 周玉珍, 徐寧 申請(qǐng)人:熊鵬