專利名稱：歐洲型、美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的間接elisa檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)的動物疾病診斷技術(shù)，以PRRSV JXAl株和LV株的相似的抗原表位Maa 58aa缺失的Nsp7基因表達(dá)蛋白作為抗原，建立了一種鑒別歐、美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的間接ELISA檢測方法。
背景技術(shù)：
按照 2005 年國際病毒分類委員會(The International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)第八次報告，豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Procine reproductive and respiratory syndromevirus, PRRSV)在分類上屬動脈炎病毒禾斗(Arteriviridae)動脈炎病毒屬(Arterivirus)。根據(jù)各分離株的序列分析及血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果將PRRSV分為兩個型分別為歐洲型(代表毒株為LV)和北美洲型(代表毒株為VR2332)，前者主要流行于歐洲地區(qū)，后者主要流行于美洲和亞太地區(qū)。1987年該病首次在美國的衣阿華、北卡羅納等州暴發(fā)，并在全美迅速蔓延，隨后在短短的幾年，迅速遍及全球各養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的國家和地區(qū)。1991年荷蘭中央獸醫(yī)研究所用豬肺泡巨噬細(xì)胞首次分離到病原，并命名為Lelystad病毒(PRRSV歐洲型代表株)；1992年美國研究人員用CU621細(xì)胞也分離到PRRSV(美洲型代表株VR2332)。1996年，哈爾濱獸醫(yī)研究所首次從國內(nèi)疑似PRRS病例中分離到PRRS病毒，從而證實(shí)了本病在我國的存在。豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種高度接觸性傳染病，以母豬繁殖障礙和仔豬的呼吸道疾病為主要特征。該病幾乎在所有的國家流行，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展。我國在2006年春夏交接之際，南方地區(qū)發(fā)生了以高熱、高發(fā)病率和高死亡率為特征的傳染病，而后迅速蔓延至周邊地區(qū)，至2007年已遍及全國絕大部分省份，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失，涉及十幾個省的2000000頭豬發(fā)病，且造成400000頭豬死亡。2007年1 月，農(nóng)業(yè)部最終確定“高熱病”即“高致病性藍(lán)耳病”。同時，歐洲型PRRSV在我國的發(fā)生也已有報道，并從浙江寧波地區(qū)和福建地區(qū)的臨床發(fā)病豬場中檢測到了歐洲型PRRSV，其部分序列在GenBank中的登錄號為EF473138 和EF592535，該序列與疫苗株AMERVAC-PRRS/A3弱毒疫苗株序列的同源性較高。歐洲型 PRRSV弱毒疫苗的使用增加了國內(nèi)PRRSV流行的復(fù)雜性，而且在自然界中還有可能發(fā)生病毒重組，我們實(shí)驗(yàn)室于2009年分別在內(nèi)蒙和北京分離到兩株歐洲株(登錄號⑶047345和 ⑶047344)。兩者與LV株的同源性分別為87. 01 %, 91. 48% 目前，對豬藍(lán)耳病的預(yù)防和控制是世界各國面臨的難題，為了更好的預(yù)防和控制本病的發(fā)生和流行，當(dāng)務(wù)之急是要建立一種可靠的、適于大規(guī)模診斷與檢測PRRS的方法。 PRRS感染常用的分型診斷方法包括建立在免疫學(xué)基礎(chǔ)和基因差異基礎(chǔ)上。在免疫學(xué)基礎(chǔ)上，有文獻(xiàn)記載可以利用針對M蛋白的單抗建立的可鑒別NA-PRRSV和EU-PRRSV的間接免疫熒光技術(shù)，但無商品化的試劑盒；以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的診斷主要依據(jù)PRRSV的0RF5、0RF6、0RF7和3，NCR等在NA-PRRSV和EU-PRRSV之間同源性較低 差異顯著的基因片段建立的基因分型技術(shù)，方法包括常規(guī)RT-PCR、PCR-RFLP、熒光定量RT-PCR等，如由中國動物疫病預(yù)防控制中心研制、北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)的鑒別NA-PRRSV和 EU-PRRSV的熒光定量RT-PCR試劑盒。但是這些診斷方法在應(yīng)用中需要特殊的儀器和設(shè)備、 耗時長、工作量大，已不能滿足當(dāng)前診斷PRRS感染的需要，特別是不適合大規(guī)模的臨床樣品檢測與開展流行病學(xué)調(diào)查。本研究在Nsp7蛋白的基礎(chǔ)上剔除了歐洲型和美洲型PRRSV型間的相似的抗原表位，利用原核表達(dá)的融合蛋白作為抗原，建立一種適用于大規(guī)模檢測PRRSV抗體的鑒別間接ELISA方法，以期為我國PRRSV型間抗體的鑒別提供一種快捷的技術(shù)手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是研制一種能夠區(qū)分歐洲型、美洲型的PRRSV抗體檢測試劑盒，最終為大規(guī)模的臨床樣品的檢測與開展流行病學(xué)調(diào)查提供ELISA檢測方法。本發(fā)明專利是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的(1)抗原表位的計算機(jī)篩選運(yùn)用計算機(jī)軟件(DNAMAN，DNAStar等)對豬繁殖與呼吸綜合征病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp7基因進(jìn)行同源性分析?？乖砦坏暮Y選主要通過 DNAStar (Madison, Wisconsin, USA)和DNAMAN軟件對歐洲型、美洲型PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白 Nsp7進(jìn)行分析分別得到10個和12個多肽，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)美洲型PRRSV Nsp7基因的部分抗原表位(JXA1 :38-GQFIEAAYAKALRIELAQLVQVDKV-62,23-DFKCFVSA-30)與歐洲型 PRRSV 的非結(jié)構(gòu)蛋白 Nsp7 的部分抗原表位(LV 38-GQYIEAAYAKALRQELASLVQID-60, 23-NFKCFVSAS-31) 相似。(2)目的基因的擴(kuò)增及表達(dá)載體的構(gòu)建針對美洲型PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp7蛋白表位1 23及59 259的氨基酸序列的原核重組表達(dá)載體pET-32a-JXAl- Δ Nsp7 ；針對歐洲型PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp7蛋白表位 1 23及59 269的氨基酸序列的原核重組表達(dá)載體pET_32a_LV-Δ Nsp7。(3)目的蛋白的表達(dá)及純化在表達(dá)菌E. coli BL2KDE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。通過使用最佳的誘導(dǎo)表達(dá)的時間、 誘導(dǎo)的溫度和誘導(dǎo)劑的濃度，獲得重組融合蛋白JXAl_ANsp7，LV-ANsp7。采用親和層析的方法對表達(dá)的重組融合蛋白進(jìn)行純化。(4)重組蛋白的免疫反應(yīng)活性分析Western-blotting試驗(yàn)分別用歐、美洲型PRRSV的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清作為一抗，做免疫印跡分析，經(jīng) Western-blotting鑒定重組蛋白的特異性，見圖5 8。(5)歐洲型、美洲型PRRSV抗體檢測間接ELISA方法的建立利用純化的美洲型及歐洲型PRRSV Δ Nsp7分別建立間接ELISA方法，確定美洲型ANsp7蛋白抗原包被濃度為0. 5ug/ml，歐洲型ANsp7蛋白抗原包被濃度為0. 5ug/ml ； 抗原包被條件均為37°C包被Ih加4°C過夜；血清的稀釋度和反應(yīng)時間均為1 80，Ih ；使用5%的脫脂奶粉封閉，封閉時間均為lh，HRP-兔抗豬IgG的使用濃度和反應(yīng)時間均為 1 35000，Ih ；常溫下，底物反應(yīng)時間為lOmin。針對美洲型PRRSV ANsp7蛋白的樣本的陰陽性臨界值為0. 35，即當(dāng)樣本OD45tl彡0. 35，判定為陽性；當(dāng)樣本OD45tl < 0. 35，判定為陰性；針對歐洲型PRRSV ANsp7蛋白的樣本的陰陽性臨界值為0. 4，即當(dāng)樣本OD45tl ^ 0. 4，判定為陽性；當(dāng)樣本OD450 < 0. 4，判定為陰性；在驗(yàn)證該ELISA方法的特異性發(fā)現(xiàn)兩者皆不與 CSFV、PRV、JEV、PPV陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)和阻斷試驗(yàn)結(jié)果顯示隨血清稀釋倍數(shù)的增加，經(jīng)阻斷的陽性血清與陰性血清OD45tl值逐漸接近，當(dāng)血清稀釋到640 1280倍時，達(dá)到完全阻斷，表明建立的間接ELISA方法是特異的，且重復(fù)性很好；美洲株血清樣品檢測時，與法國 LSI試劑盒進(jìn)行比較，其敏感性和特異性分別是90%和94. 2 %，說明兩種檢測方法無顯著性差異。


圖 IPRRSV-JXA1-Nsp7 和 PRRSV_LV_Nsp7 上、下游基因片段的擴(kuò)增1 4 分另Ij 為 JXA1-PRRSV-Nsp7 上游(103bp) ；LV_PRRSV_Nsp7 上游(103bp)； JXA1-PRRSV-Nsp7 上游(636bp) ；LV_PRRSV_Nsp7 上游(668bp)。圖 2PRRSV-JXAl_ANsp7 禾口 PRRSV-LV_ANsp7 基因片段構(gòu)建1: JXAI-PRRSV- ΔNsp7(672bp) ；2 =LV-PRRSV- ΔNsp7(702bp)。圖 3 表達(dá)載體 pET-3h-JXAl_ANsp7 和 pET_32a_LV-Δ Nsp7 的鑒定1 4 : PCR 擴(kuò)增 JXAl-PRRSV-ANsp7 ；表達(dá)載體 pET_3h_JXAl-Δ Nsp7 的雙酶切；PCR 擴(kuò)增 LV-PRRSV- Δ Nsp7 ；表達(dá)載體 pET_3h_LV- Δ Nsp7 的雙酶切。圖4重組融合蛋白JXAl- Δ Nsp7和LV- Δ Nsp7的誘導(dǎo)表達(dá)SDS_PAGE鑒定1 2 重組融合蛋白LV_ANsp7 ；重組融合蛋白JXAl_ANsp7。圖5 重組融合蛋白JXAl-Δ Nsp7的免疫反應(yīng)活性分析-Western-blotting鑒定 (一抗為美洲株標(biāo)準(zhǔn)血清)1 4:融合蛋白JXAl-ANsp7上樣量分別為20ul、15ul、10ul、 5ul ο圖6 :重組融合蛋白LV_ANsp7的免疫反應(yīng)活性分析-Western-blotting鑒定(一抗為美洲株標(biāo)準(zhǔn)血清)1 4 融合蛋白LV-ANsp7上樣量分別為20ul、15ul、10ul、5ul。圖7 重組融合蛋白LV_ANsp7的免疫反應(yīng)活性分析-Western-blotting鑒定(一抗為歐洲株標(biāo)準(zhǔn)血清)1 4 融合蛋白LV-ANsp7上樣量分別為:20ul、15ul、10ul、5ul。圖8 重組融合蛋白JXAl-Δ Nsp7的免疫反應(yīng)活性分析-Western-blotting鑒定 (一抗為歐洲株標(biāo)準(zhǔn)血清)1 4 融合蛋白JXAl-ΔNsp7上樣量分別為:20ul、15ul、10ul、 5ul ο
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例中的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，參見Sambrook等編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版(北京科學(xué)出版社，2002)，儀器的使用參照儀器操作說明書。本發(fā)明首先參考已發(fā)表的關(guān)于PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp7免疫反應(yīng)的相關(guān)研究報道， 利用計算機(jī)軟件對歐洲型與美洲型PRRSV的抗原表位進(jìn)行分析，分別設(shè)計兩對引物，利用 PCR方法克隆了 PRRSV JXAl株(EF112445)和LV株(AY588319)的非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp7基因中歐洲型、美洲型毒株的相似抗原表位Maa 58aa缺失的部分，利用限制性內(nèi)切酶將目的片段和原核表達(dá)載體pET-3h進(jìn)行酶切，T4連接酶連接，獲得構(gòu)建原核表達(dá)載體，分別命名為pET-32a-JXAl-ANsp7，pET_32a_LV-Δ Nsp7。
用pET-32a_JXAl- Δ Nsp7, pET_32a_LV- Δ Nsp7 分別轉(zhuǎn)化受體菌 BL21 (DE3)，獲得單個菌落，用誘導(dǎo)劑IPTG以不同濃度進(jìn)行誘導(dǎo)，并在不同時間收集樣品。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析證實(shí)ANsp7基因的表達(dá)，并確定IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度及誘導(dǎo)時間分別為ImM和3. 5小時。將SDS-PAGE后的蛋白帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上進(jìn)行Western-blotting試驗(yàn)，證實(shí)了所表達(dá)的重組蛋白大小相符具有免疫反應(yīng)活性，且無交叉反應(yīng)。通過對其特異性、敏感性及工作條件的優(yōu)化試驗(yàn)，建立了鑒別歐洲型、美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的間接ELISA 檢測方法。 實(shí)施例1抗原表位的計算機(jī)篩選利用計算機(jī)軟件(DNAMAN，DNAStar等)對豬繁殖與呼吸綜合征病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp7基因進(jìn)行核苷酸和氨基酸水平的同源性分析。美洲株JXAl (EFl 12445)和 VR2332(AY150564)在氨基酸和核苷酸方面的同源性分別為89. 8%,90. 0%;歐洲株之間在氨基酸和核苷酸方面的同源性均在90%以上；美洲株和歐洲株在氨基酸和核苷酸方面的同源性分別為50. 3%，47%。表1豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp7基因在核苷酸水平的同源性比較
權(quán)利要求
1.一種鑒別歐洲型、美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的間接ELISA檢測方法，其特征在于步驟如下1)目的蛋白的表達(dá)及純化針對Genbank登錄號為EF11M45的美洲型PRRSV JXAl株的非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp7基因中歐洲型、美洲型毒株的相似抗原表位，構(gòu)建Nsp7的Maa 58aa缺失的原核表達(dá)載體 pET-32a-JXAl-ANsp7 ；針對Genbank登錄號為AY588319的歐洲型LV株的非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp7 基因中歐洲型、美洲型毒株的相似抗原表位，構(gòu)建Nsp7的Maa 58aa缺失的原核表達(dá)載體pET-32a-LV- Δ Nsp7，表達(dá)純化蛋白制備美洲型Δ Nsp7蛋白抗原和歐洲型Δ Nsp7蛋白抗原。2)間接ELISA檢測利用純化的美洲型及歐洲型PRRSV Δ Nsp7分別建立間接ELISA方法，確定美洲型 ANsp7蛋白抗原包被濃度為0. 5ug/ml，歐洲型ANsp7蛋白抗原包被濃度為0. 5ug/ml ；抗原包被條件均為37°C包被Ih加4°C過夜；血清的稀釋度和反應(yīng)時間均為1 80，Ih ；使用5%的脫脂奶粉封閉，封閉時間均為lh，HRP-兔抗豬IgG的使用濃度和反應(yīng)時間均為 1 35000，Ih ；常溫下，底物反應(yīng)時間為lOmin。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別歐洲型、美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的間接 ELISA檢測方法，其特征在于，針對美洲型PRRSV Δ Nsp7蛋白的樣本的陰陽性臨界值為 0. 35，即當(dāng)樣本0D450彡0. 35，判定為陽性；當(dāng)樣本0D450 < 0. 35，判定為陰性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的鑒別歐洲型、美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的間接ELISA檢測方法，其特征在于，針對歐洲型PRRSV ANsp7蛋白的樣本的陰陽性臨界值為 0.4，即當(dāng)樣本0D450彡0.4，判定為陽性；當(dāng)樣本0D450 < 0.4，判定為陰性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的鑒別歐洲型、美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的間接 ELISA檢測方法，其特征在于，美洲型PRRSV Δ Nsp7蛋白和歐洲型PRRSV Δ Nsp7蛋白皆不與CSFV、PRV、JEV、PPV陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的鑒別歐洲型、美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的間接 ELISA檢測方法，其特征在于，阻斷試驗(yàn)結(jié)果顯示隨血清稀釋倍數(shù)的增加，經(jīng)阻斷的陽性血清與陰性血清0D450值逐漸接近，當(dāng)血清稀釋到640 1280倍時，達(dá)到完全阻斷。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的鑒別歐洲型、美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的間接 ELISA檢測方法，其特征在于，美洲株血清樣品檢測時，與法國LSI試劑盒進(jìn)行比較，其敏感性和特異性分別是90%和94. 2%，符合率為92. 2%。
7.如權(quán)利要求1所述的間接ELISA檢測方法，其特征在于，制備pET-32a-JXAl-Δ Nsp7 所用的引物對為JXA1-Nsp 7-F1-GCGGATCCTCGCTGACTGGTGCCCTCJXA1-Nsp7-Rl-CCATGGTGCCTCGGACCTTATCAACATCAGTCCATTTCGTAAGGAAATCJXA1-Nsp7-F2-GATTTCCTTACGAAATGGACTGATGTTGATAAGGTCCGAGGCACCATGGJXA1-Nsp7-R2-CCCAAGCTT TTCCCACTGAGCTCTTCTATTC
8.如權(quán)利要求1所述的間接ELISA檢測方法，其特征在于，制備pET-32a-LV-Δ Nsp7所用的引物對為LV-Nsp7-F3-CGGAATTCTCCCTAACGGCTGCTTTAGCTTGLV-Nsp7-R3-GACAAAA CTCCTTTCATTTTGTCAATGTTCGTTAAGCTGGACAAAAAATCA LV-Nsp7-F4-TGATTTTTTGTCCAGCTTAACGAACATTGACAAAATGAAAGGAGTTTTGTC LV-Nsp7-R4-CCCAAGCTTTTTCAAGGCAGTTGTCAGGC
全文摘要
本發(fā)明提供一種鑒別歐洲型、美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的血清學(xué)方法，該方法是針對美洲型PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp7蛋白的1～23和59～259氨基酸序列，建立美洲型PRRSV Nsp7蛋白的原核重組表達(dá)載體pET-32a-JXA1-ΔNsp7；針對歐洲型PRRSV Nsp7蛋白表位1～23和59～269氨基酸序列，建立歐洲型PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp7的原核重組表達(dá)載體pET-32a-LV-ΔNsp7。重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)。利用經(jīng)鎳柱親和純化的美洲型Nsp7蛋白作為包被抗原制備用于美洲型PRRSV抗體檢測的間接ELISA診斷試劑盒；以純化的歐洲型Nsp7蛋白作為包被抗原，優(yōu)化了歐洲型PRRSV抗體檢測間接ELISA方法；兩種試劑盒的發(fā)明可用于PRRSV抗體的分型檢測。
文檔編號G01N33/569GK102175861SQ201010602100
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月23日
發(fā)明者倪建強(qiáng), 曲萍, 田克恭, 翟新驗(yàn), 邱鵬, 陳西釗, 顧小雪 申請人:中國動物疫病預(yù)防控制中心