專利名稱：分子印跡技術(shù)應(yīng)用于地高辛及青霉素的快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物檢測試劑的制備和應(yīng)用方法，特別涉及一種分子印跡技術(shù)應(yīng)用于地高辛及青霉素的快速檢測方法。
背景技術(shù)：
很多不同的技術(shù)被用來檢測標(biāo)本中地高辛或青霉素濃度，其中包括放射性免疫測定(RIA)、酶擴大免疫測定技術(shù)(EMIT)、熒光極化免疫測定(FPIA)和液相層析質(zhì)譜等。然而，這些方法多需要昂貴的儀器，操作復(fù)雜，時間長，有的還有放射性危害。因此，需要1種快速簡便，高靈敏度，價格不貴的檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種分子印跡技術(shù)應(yīng)用于地高辛及青霉素的快速檢測方法。制作簡便、成本低、檢測快速、特異性高、穩(wěn)定性好。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種分子印跡技術(shù)應(yīng)用于地高辛及青霉素的快速檢測方法，其特征在于印跡聚合物顆粒的制備使用熱聚合的方法制備印跡聚合物顆粒取0.2X10_3mM地高辛或青霉素溶液 390μ 1，加入0. 2mM功能單體MAA 780 μ 1，再加入溶劑甲醇3000 μ 1放置在搖床上120rpm、
預(yù)作用6h，使模板分子與功能單體充分作用形成復(fù)合物；然后加入ImM交聯(lián)劑EDMA 2000 μ 1,0. Ig致孔劑ΑΙΒΝ，混勻后轉(zhuǎn)入15ml試管中，通N2脫氧lOmin，真空下密封后放入恒溫水浴槽中，60°C反應(yīng)24h形成棒狀聚合物；用同樣條件，制備無模板分子的空白聚合物 (NIP)；然后將聚合物用研缽粉碎研磨后過60目篩，得到粒徑均一的印跡聚合物顆粒；MIPs顆粒使用體積比9 1的甲醇-乙酸的溶液進行超聲洗滌，直到洗脫液用紫外分光光度計檢測不到模板分子地高辛的殘留；之后用甲醇洗去多余的乙酸，再用蒸餾水反復(fù)多次洗去多余甲醇，最后將顆粒放入真空干燥器干燥至恒重；涂膜量的優(yōu)化2μ 1制膜溶液不足以覆蓋電極表面，取3μ 1、5μ 1、8μ 1、10μ 1這4個量制備傳感
器，用其對地高辛或青霉素分別進行電化學(xué)檢測，分析涂膜量對試驗結(jié)果的影響，每個試驗要重復(fù)3次；印跡聚合膜的制備取20mg印跡顆粒加入到Iml 0. 8%的瓊脂糖溶液中，制成20mg/ml的印跡顆粒溶液備用。將直徑為3mm的玻碳電極打磨拋光后，依次用乙酸、乙醇、丙酮超聲清洗3min，再用蒸餾水超聲清洗2遍，每遍;3min。洗好的電極放入PH6. O的PBS溶液中，在-0. 8 2. OV電位下進行活化，直到得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安響應(yīng)；處理好的電極待表面干燥后，取3μ 1印跡聚合物顆粒均勻涂于電極表面，水分蒸發(fā)后既在電極表面形成一層印跡聚合物顆粒膜；非印跡聚合膜使用同樣的方法制備，只是用非印跡聚合物顆粒替換印跡聚合物顆粒即可。
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所述的分子印跡技術(shù)應(yīng)用于地高辛及青霉素的快速檢測方法，其特征在于電化學(xué)檢測及標(biāo)準曲線的繪制用ImM的鐵氰化鉀溶液來表征電極表面電流的變化；用制備好的印跡聚合膜對地高辛模板進行吸附來檢測印跡聚合膜的性能，取地高辛或青霉素濃度為1. 28nM,6. 4nM、 12. 8nM、19. 2nM、25. 6nM、38. 4nM、64nM、102nM、128nM、256nM、384nM、512nM、640nM 這 13 個濃度作為檢測濃度，每個濃度的穩(wěn)定時間為5min，檢測玻碳電極表面電流的變化，每個試驗重復(fù)3次，繪制標(biāo)準曲線，即物質(zhì)濃度與相關(guān)電流的曲線。本發(fā)明特點和效果是本發(fā)明是應(yīng)用分子印跡的方法制備了對地高辛及青霉素有特異性吸附性能的印跡聚合物顆粒，再將顆粒與瓊脂糖混合并固定于玻碳電極上制備成地高辛或青霉素分子印跡聚合膜傳感器，該傳感器可以特異性的結(jié)合模板分子-地高辛或青霉素且其電化學(xué)信號與模板濃度相關(guān)，再用它來檢測標(biāo)本中地高辛或青霉素的含量。該分子印跡傳感器是非標(biāo)記性的，制作簡便、成本低、檢測快速、特異性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，其檢測下限為1^8nM，結(jié)果檢測時間為5min。分子印跡生物傳感器，將分子印跡顆粒與瓊脂糖混合后固定到電極上制備成為1 個電化學(xué)傳感器，不僅制作簡單，檢測也相當(dāng)方便，并且靈敏度高，價格便宜。


圖1是地高辛印跡聚合膜傳感器對不同濃度地高辛的吸附曲線中a 地高辛印跡膜傳感器對模板分子地高辛的甲醇溶液吸附；b 地高辛非印跡膜傳感器對模板分子地高辛的吸附；c 地高辛印跡膜傳感器對模板分子地高辛的血清溶液的吸附。(濃度范圍1.觀 640nM，檢測環(huán)境ImM鐵氰化鉀)
具體實施例方式本分子印跡技術(shù)應(yīng)用于地高辛及青霉素的快速檢測方法，包括印跡聚合物顆粒的制備、涂膜量的優(yōu)化、印跡聚合膜的制備和電化學(xué)檢測及標(biāo)準曲線的繪制。1、印跡聚合物顆粒的制備使用熱聚合的方法制備印跡聚合物顆粒取0.2X 10_3mM地高辛或青霉素溶液 390μ 1，加入0. 2mM功能單體MAA 780 μ 1，再加入溶劑甲醇3000 μ 1放置在搖床上120rpm、
預(yù)作用6h，使模板分子與功能單體充分作用形成復(fù)合物。然后加入ImM交聯(lián)劑EDMA 2000 μ 1,0. Ig致孔劑ΑΙΒΝ，混勻后轉(zhuǎn)入15ml試管中，通N2脫氧lOmin，真空下密封后放入恒溫水浴槽中，60°C反應(yīng)24h形成棒狀聚合物。用同樣條件，制備無模板分子的空白聚合物 (NIP)。然后將聚合物用研缽粉碎研磨后過60目篩，得到粒徑均一的印跡聚合物顆粒。MII^顆粒使用甲醇-乙酸(體積比9 1)的溶液進行超聲洗滌，直到洗脫液用紫外分光光度計檢測不到模板分子地高辛的殘留。之后用甲醇洗去多余的乙酸，再用蒸餾水反復(fù)多次洗去多余甲醇，最后將顆粒放入真空干燥器干燥至恒重。2、涂膜量的優(yōu)化涂膜量對試驗有一定的影響。2μ 1制膜溶液不足以覆蓋電極表面，取3 μ 1、5 μ 1、 8 μ 1、10 μ 1這4個量制備傳感器，用其對地高辛分別進行電化學(xué)檢測(見1. 2. 4)，分析涂膜量對試驗結(jié)果的影響(每個試驗重復(fù)3次)。3、印跡聚合膜的制備取20mg印跡顆粒加入到Iml 0. 8%的瓊脂糖溶液中，制成20mg/ml的印跡顆粒溶液備用。將直徑為3mm的玻碳電極打磨拋光后，依次用乙酸、乙醇、丙酮超聲清洗3min，再用蒸餾水超聲清洗2遍，每遍;3min。洗好的電極放入PH6. 0的PBS溶液中，在-0. 8 2. OV電位下進行活化，直到得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安響應(yīng)。處理好的電極待表面干燥后，取3μ 1印跡聚合物顆粒均勻涂于電極表面，水分蒸發(fā)后既在電極表面形成一層印跡聚合物顆粒膜。非印跡聚合膜使用同樣的方法制備，只是用非印跡聚合物顆粒替換印跡聚合物顆粒即可。2、電化學(xué)檢測及標(biāo)準曲線的繪制用ImM的鐵氰化鉀溶液來表征電極表面電流的變化。用制備好的印跡聚合膜對地高辛模板進行吸附來檢測印跡聚合膜的性能，取地高辛或青霉素濃度為1. 28ηΜ,6. 4ηΜ、 12. 8ηΜ、19. 2ηΜ、25. 6ηΜ、38. 4ηΜ、64ηΜ、102ηΜ、128ηΜ、256ηΜ、384ηΜ、512ηΜ、640ηΜ 這 13 個濃度作為檢測濃度，每個濃度的穩(wěn)定時間為5min，檢測玻碳電極表面電流的變化(每個試驗重復(fù)3次)。結(jié)果與討論 電化學(xué)檢測及標(biāo)準曲線的繪制制備好的印跡聚合膜依次檢測13個濃度，記錄電極表面電流值，對其進行分析。 試驗結(jié)果表明地高辛印跡聚合膜對模板分子有較好的吸附效果，非印跡聚合膜對模板分子的吸附很少，可以忽略不計，見圖1是地高辛印跡聚合膜傳感器對不同濃度地高辛的吸附曲線。其中a 地高辛印跡膜傳感器對模板分子地高辛的甲醇溶液吸附；b 地高辛非印跡膜傳感器對模板分子地高辛的吸附；C:地高辛印跡膜傳感器對模板分子地高辛的血清溶液的吸附。(濃度范圍 1. 28 ~ 640nM,檢測環(huán)境ImM鐵氰化鉀)
權(quán)利要求
1.一種分子印跡技術(shù)應(yīng)用于地高辛及青霉素的快速檢測方法，其特征在于印跡聚合物顆粒的制備使用熱聚合的方法制備印跡聚合物顆粒取0. 2乂10_3!111地高辛或青霉素溶液39(^1， 加入0. 2mM功能單體MAA 780 μ 1，再加入溶劑甲醇3000 μ 1放置在搖床上120rpmJ9°C預(yù)作用他，使模板分子與功能單體充分作用形成復(fù)合物；然后加入ImM交聯(lián)劑EDMA 2000 μ 1, 0. Ig致孔劑ΑΙΒΝ，混勻后轉(zhuǎn)入15ml試管中，通N2脫氧lOmin，真空下密封后放入恒溫水浴槽中，60°C反應(yīng)24h形成棒狀聚合物；用同樣條件，制備無模板分子的空白聚合物(NIP)；然后將聚合物用研缽粉碎研磨后過60目篩，得到粒徑均一的印跡聚合物顆粒；MII^顆粒使用體積比9 1的甲醇-乙酸的溶液進行超聲洗滌，直到洗脫液用紫外分光光度計檢測不到模板分子地高辛的殘留；之后用甲醇洗去多余的乙酸，再用蒸餾水反復(fù)多次洗去多余甲醇，最后將顆粒放入真空干燥器干燥至恒重；涂膜量的優(yōu)化2μ 1制膜溶液不足以覆蓋電極表面，取3μ 1、5μ 1、8μ 1、10μ 1這4個量制備傳感器，用其對地高辛或青霉素分別進行電化學(xué)檢測，分析涂膜量對試驗結(jié)果的影響，每個試驗要重復(fù)3次；印跡聚合膜的制備取20mg印跡顆粒加入到Iml 0. 8%的瓊脂糖溶液中，制成20mg/ml的印跡顆粒溶液備用。將直徑為3mm的玻碳電極打磨拋光后，依次用乙酸、乙醇、丙酮超聲清洗3min，再用蒸餾水超聲清洗2遍，每遍;3min。洗好的電極放入PH6. O的PBS溶液中，在-0. 8 2. OV電位下進行活化，直到得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安響應(yīng)；處理好的電極待表面干燥后，取3μ 1印跡聚合物顆粒均勻涂于電極表面，水分蒸發(fā)后既在電極表面形成一層印跡聚合物顆粒膜；非印跡聚合膜使用同樣的方法制備，只是用非印跡聚合物顆粒替換印跡聚合物顆粒即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子印跡技術(shù)應(yīng)用于地高辛及青霉素的快速檢測方法，其特征在于電化學(xué)檢測及標(biāo)準曲線的繪制·1.用ImM的鐵氰化鉀溶液來表征電極表面電流的變化；用制備好的印跡聚合膜對地高辛或青霉素進行吸附來檢測印跡聚合膜的性能，取地高辛或青霉素濃度為1. 28ηΜ,6. 4ηΜ、 12. 8ηΜ、19. 2ηΜ、25. 6ηΜ、38. 4ηΜ、64ηΜ、102ηΜ、128ηΜ、256ηΜ、384ηΜ、512ηΜ、640ηΜ 這 13 個濃度作為檢測濃度，每個濃度的穩(wěn)定時間為5min，檢測玻碳電極表面電流的變化，每個試驗重復(fù)3次，繪制物質(zhì)濃度與相關(guān)電流的標(biāo)準曲線。
全文摘要
一種分子印跡技術(shù)應(yīng)用于地高辛及青霉素的快速檢測方法，先制備對地高辛及青霉素有特異性吸附性能的印跡聚合物顆粒，再將顆粒與瓊脂糖混合并固定于玻碳電極上制備成地高辛分子印跡聚合膜傳感器，該傳感器可以特異性的結(jié)合模板分子-地高辛或青霉素且其電化學(xué)信號與模板濃度相關(guān)，再用它來檢測標(biāo)本中地高辛或青霉素的含量。該分子印跡傳感器是非標(biāo)記性的，制作簡便、成本低、檢測快速、特異性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，其檢測下限為1.28nM，結(jié)果檢測時間為5min。
文檔編號G01N27/26GK102175733SQ20101060196
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月23日
發(fā)明者張娟琨 申請人:天津前方科技有限公司