專利名稱：：多不飽和脂肪酸及含有其的脂質(zhì)的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及多不飽和脂肪酸(PUFA)及含有其的脂質(zhì)的制造方法、含有PUFA的微生物菌體及其利用。本發(fā)明特別涉及二高-Y-亞麻酸(DGLA)、花生四烯酸(ARA)的含量高的脂質(zhì)及含有該脂質(zhì)的微生物菌體的制造方法、以及其代表性的利用。
背景技術(shù)：
：多不飽和脂肪酸(以下稱為PUFA)具有各種有用的生理功能。在此，PUFA是指碳原子數(shù)為20以上的具有2個(gè)以上雙鍵的脂肪酸。在PUFA中、特別是在二高-Y-亞麻酸(以下稱為DGLA)、花生四烯酸(以下稱為ARA)中，近年來發(fā)現(xiàn)了各種有用性(非專利文獻(xiàn)l)。例如在DGLA中發(fā)現(xiàn)了特應(yīng)性皮炎抑制效果、抗變應(yīng)性作用等，在ARA中發(fā)現(xiàn)了以腦功能改善作用、嬰兒營(yíng)養(yǎng)效果為代表的多種有用性。此外，在成人病患者、其亞健康人群、嬰兒、高齡者、寵物(特別是貓科動(dòng)物)中DGLA、ARA的不足引人擔(dān)心。在這種情況下，對(duì)PUFA、特別是DGLA、ARA的供給方法進(jìn)行了各種探討，作為實(shí)用的制造方法，探討了通過培養(yǎng)具有上述脂肪酸的生產(chǎn)能力的微生物而制造的方法。在對(duì)培養(yǎng)方法進(jìn)行各種探討的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了可工業(yè)生產(chǎn)的方法(非專利文獻(xiàn)1)。在PUFA中、特別是對(duì)于DGLA，發(fā)現(xiàn)了通過大規(guī)模培養(yǎng)，每lkg干燥菌體中的DGLA量最高達(dá)到167g的培養(yǎng)方法(專利文獻(xiàn)l、非專利文獻(xiàn)2)。但是在這些方法中，在培養(yǎng)初期葡萄糖的消耗量多，另一方面為了避免由高葡萄糖濃度引起的增殖阻礙所導(dǎo)致的生產(chǎn)率降低的障礙，需要從培養(yǎng)初期開始最少在數(shù)天內(nèi)分期頻繁地添加葡萄糖。另一方面，對(duì)于特定的物質(zhì)，也探討了用于使其產(chǎn)量提高的微生物的培養(yǎng)方法。專利文獻(xiàn)2公開了在含有乳清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)Khm'eY鼎yceshmis發(fā)酵生產(chǎn)腦苷脂時(shí)，在培養(yǎng)基中添加各種鈉源的方法、控制培養(yǎng)基pH的方法。此外，對(duì)于被孢霉屬絲狀菌的培養(yǎng)方法，非專利文獻(xiàn)3公開了將朋40H兼作氮源并控制pH的方法，專利文獻(xiàn)3公開了在培養(yǎng)的后半期控制pH為77.5的方法。非專利文獻(xiàn)4公開了通過在培養(yǎng)基中添加KH2P04和0.05%CaCl2'2H2O、O.05%MgCl2*6H20、0.l%Na2S04，菌形態(tài)變?yōu)樽钸m形態(tài)，且PUFA生產(chǎn)性提高。專利文獻(xiàn)l日本專利第3354581號(hào)專利文獻(xiàn)2日本特開2006-55070專利文獻(xiàn)3US5，658，767非專利文獻(xiàn)l河島洋、FoodsFoodIngredientsJJpn，210,106-114(2005)非專利文獻(xiàn)2HKawashimaetal.，JAmOilChemSoc，77,1135-1138(2000)非專利文獻(xiàn)3Byung-HaeHwangetal.，BiotechnolLett,27，73卜5(2005)非專利文獻(xiàn)4藤川茂昭等、生物科學(xué)與工業(yè)、57、818-821(1999)
發(fā)明內(nèi)容如上所述，對(duì)于通過培養(yǎng)具有脂肪酸生產(chǎn)能力的微生物來制造PUFA、特別是DGLA、ARA的方法進(jìn)行了各種探討。但是，利用上述以往技術(shù)得到的微生物菌體存在微生物菌體中的PUFA含量低的問題。含有PUFA的微生物菌體，雖然可將干燥后的干燥菌體直接配合在飲食品、營(yíng)養(yǎng)組合物、飼料、寵物食品等中，但在微生物菌體中PUFA占有的含量低時(shí)，為了充分發(fā)揮PUFA的效果，需要配合大量的微生物菌體，因此其他成分的配合量受到顯著限制。此外，含有PUFA的微生物菌體也可作為用于提取含有PUFA的脂質(zhì)的原料使用，但是微生物菌體中的PUFA含量低時(shí)，必須處理大量的微生物菌體，因此需要大規(guī)模的提取裝置、大量的提取溶劑。因?yàn)檫@會(huì)引起成本大幅上漲，而且處理時(shí)需要的能量也大，所以對(duì)地球環(huán)境的負(fù)荷加大。此外，在以往技術(shù)中也嘗試了對(duì)微生物菌體進(jìn)行的各種培養(yǎng)控制，但是因?yàn)榕囵B(yǎng)操作變得復(fù)雜化時(shí)，會(huì)引起雜菌污染、操作失誤的危險(xiǎn)及成本上漲，所以包括在培養(yǎng)基中添加添加物的操作，采用盡量少的操作進(jìn)行高效培養(yǎng)非常重要。本發(fā)明是鑒于上述課題而進(jìn)行的發(fā)明，其目的在于提供PUFA或含有其的脂質(zhì)的低成本、操作簡(jiǎn)便、適合大量生產(chǎn)的制造方法、以及PUFA或含有其的脂質(zhì)的含量高的微生物菌體及其利用方法。到目前為止，對(duì)于使被孢霉屬絲狀菌的PUFA生產(chǎn)提高的培養(yǎng)方法，已探討了在基本培養(yǎng)基中添加油脂、鹽類的方法，但是對(duì)于有機(jī)酸的添加，即使有在其他微生物中添加的例子，但也還未有使PUFA含量增加的見解。此外，對(duì)于培養(yǎng)過程中的pH控制，也未有關(guān)于最適pH的控制的詳細(xì)分析報(bào)告。而且，通過添加有機(jī)酸當(dāng)然可以降低pH，但是未著眼于對(duì)于有機(jī)酸添加和pH控制的組合對(duì)PUFA生產(chǎn)所產(chǎn)生的影響。對(duì)于培養(yǎng)基中的微量金屬鹽的量，例如非專利文獻(xiàn)4中雖著眼于使用CaCl2和MgCl2、主要是Ca2+和Mg2+的效果，但未考慮與金屬離子成對(duì)的陰離子的影響，未著眼于與金屬離子成對(duì)的陰離子對(duì)微生物的PUFA生產(chǎn)率所產(chǎn)生的影響。關(guān)于在基本培養(yǎng)基中添加添加物的操作，對(duì)培養(yǎng)前的培養(yǎng)基通常進(jìn)行加熱滅菌，但因?yàn)閷⑵咸烟呛推渌衔锘旌线M(jìn)行滅菌誘發(fā)化學(xué)反應(yīng)的可能性高，所以通常不這樣進(jìn)行。因此，在培養(yǎng)初期在培養(yǎng)基中添加葡萄糖以外的添加物會(huì)使操作變得煩雜、困難。從避免將葡萄糖和其他化合物(容易發(fā)生化學(xué)反應(yīng))同時(shí)進(jìn)行滅菌的方面出發(fā)，必須盡量減少上述添加操作。本發(fā)明者為了解決上述課題進(jìn)行精心研究的結(jié)果，首次發(fā)現(xiàn)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)高山被孢霉的同時(shí)制造PUFA及含有其的脂質(zhì)的方法中，通過(a)在培養(yǎng)基中添加有機(jī)酸及/或有機(jī)酸鹽進(jìn)行培養(yǎng)；(b)在培養(yǎng)開始后，在規(guī)定時(shí)期提高培養(yǎng)基的pH并控制在一定范圍內(nèi)；(c)在培養(yǎng)基中添加金屬離子的硫酸鹽；及將所述操作組合，微生物菌體內(nèi)生產(chǎn)的脂質(zhì)、以及該脂質(zhì)中的PUFA、特別是DGLA、ARA的量飛躍提高。并且對(duì)于能夠同時(shí)進(jìn)行(a)有機(jī)酸等的添加和(b)培養(yǎng)基pH的控制等進(jìn)行上述(a)(c)的時(shí)期進(jìn)行了進(jìn)一步的探討，完成了本發(fā)明。艮P:本發(fā)明提供PUFA、優(yōu)選ARA及/或DGLA、更優(yōu)選DGLA或含有其的脂質(zhì)、優(yōu)選甘油三酯的制造方法，其為將具有花生四烯酸(ARA)及/或二高-y_亞麻酸(DGLA)生產(chǎn)能力的微生物、優(yōu)選屬于被孢霉屬的微生物、更優(yōu)選高山被孢霉進(jìn)行培養(yǎng)，優(yōu)選在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)的同時(shí)制造多不飽和脂肪酸(PUFA)及含有其的脂質(zhì)的方法，包括以下(a)(C)工序中的1種以上(a)在主培養(yǎng)開始后，優(yōu)選在脂肪酸積累期、更優(yōu)選在主培養(yǎng)開始后24小時(shí)之后、進(jìn)一步優(yōu)選在主培養(yǎng)開始后第3天之后、特別優(yōu)選在主培養(yǎng)開始后第4天之后，在培養(yǎng)基中添加有機(jī)酸、優(yōu)選選自糖酵解途徑和其分支途徑、或TCA循環(huán)中含有的有機(jī)酸中的1種以上的有機(jī)酸、更優(yōu)選選自琥珀酸、富馬酸、丙酮酸、乳酸及蘋果酸中的1種以上的有機(jī)酸、進(jìn)一步優(yōu)選琥珀酸0.015w/v。/。、優(yōu)選0.25w/v%、更優(yōu)選0.225w/v°/。、進(jìn)一步優(yōu)選0.35w/v%、特別優(yōu)選0.445w/v。/。的工序；(b)在主培養(yǎng)開始后，優(yōu)選在脂肪酸積累期、更優(yōu)選在主培養(yǎng)開始后24小時(shí)后、進(jìn)一步優(yōu)選在主培養(yǎng)開始后第3天之后、特別優(yōu)選在主培養(yǎng)開始后第4天之后，控制培養(yǎng)基的pH使其在培養(yǎng)有效范圍內(nèi)、優(yōu)選在pH68范圍內(nèi)、更優(yōu)選在pH6.37.5范圍內(nèi)、進(jìn)一步優(yōu)選在pH6.67.5范圍內(nèi)、特別優(yōu)選在pH6.97.2范圍內(nèi)提高的工序；及(c)在主培養(yǎng)培養(yǎng)基中，添加金屬離子的硫酸鹽、優(yōu)選選自MgSO,、CaS04、Na2S(X、K2S04、FeS0h及MnS(V等中的1個(gè)以上、更優(yōu)選MgSO,及/或CaS040.01.5w/V/。、優(yōu)選0.010.25w/w。/。、更優(yōu)選0.050.2w/wO/。、特別優(yōu)選0.060.lw/w%的工序，并且最好是代替培養(yǎng)基中的金屬氯化物，添加相應(yīng)的上述硫酸鹽的工序。本發(fā)明還提供上述的制造方法，其包括上述工序(a)及工序(b)，工序(a)及工序(b)優(yōu)選在同日、更優(yōu)選在同時(shí)、且在與向培養(yǎng)基中添加碳源例如葡萄糖不同的時(shí)間、優(yōu)選在不同的日子進(jìn)行。本發(fā)明還提供上述的制造方法，其包括上述工序(c)，工序(c)在主培養(yǎng)開始前進(jìn)行。本發(fā)明還提供上述的制造方法，其中，在上述PUFA或含有其的脂質(zhì)中，上述總脂肪酸中的DGLA為35w/wy。以上、優(yōu)選37w/V/。以上、特別優(yōu)選40w/w。/。以上。本發(fā)明還提供高山被孢霉的干燥菌體，其中，每lg干燥菌體中的DGLA為190mg以上、優(yōu)選195mg以上、更優(yōu)選200mg以上、特別優(yōu)選220mg以上。本發(fā)明還提供上述干燥菌體，其為將利用包括以下(a)(c)工序中的1個(gè)6以上的方法，在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)后的高山被孢霉菌體，進(jìn)一步供給千燥工序所得到的干燥菌體，所述(a)(C)工序?yàn)椋?a)在主培養(yǎng)開始后第3天之后、優(yōu)選在主培養(yǎng)開始后第4天之后，在培養(yǎng)基中添加選自琥珀酸、富馬酸、丙酮酸、乳酸及蘋果酸中的l種以上的有機(jī)酸、優(yōu)選琥珀酸0.25w/v%、優(yōu)選0.225w/v%、更優(yōu)選0.35w/v%、進(jìn)一步優(yōu)選0.445w/v。/。的工序；(b)在主培養(yǎng)開始后第3天之后、優(yōu)選在主培養(yǎng)開始后第4天之后，控制培養(yǎng)基的pH使其在p朋.67.5范圍內(nèi)、優(yōu)選在pH6.97.2范圍內(nèi)提高的工序；及(c)在主培養(yǎng)培養(yǎng)基中，添加選自MgS04、CaS04、Na2S04、K2S04、FeS04、及MnS04等中的1種以上、優(yōu)選MgS。4及/或CaS040.050.2w/w%、優(yōu)選0.060.1w/V/。的工序，并且最好是代替培養(yǎng)基中的金屬氯化物，添加相應(yīng)的上述硫酸鹽的工序。本發(fā)明還提供包含上述干燥菌體或來自上述干燥菌體的ARA及/或DGLA的飲食品，優(yōu)選營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)助品、飲料、動(dòng)物用飼料，更優(yōu)選動(dòng)物用詞料(特別是寵物食品)。進(jìn)而本發(fā)明提供利用上述制造方法獲得的PUFA、優(yōu)選ARA及/或DGLA或含有其的脂質(zhì)、優(yōu)選甘油三酯。進(jìn)而本發(fā)明提供上述制造方法，其中，與不包括工序(a)(c)的制造方法相比，獲得的每lg微生物干燥菌體中的DGLA增加3%以上、優(yōu)選5%以上、更優(yōu)選10%以上。進(jìn)而本發(fā)明提供上述制造方法，其中，與不包括工序(a)(c)的制造方法相比，獲得的每lg微生物干燥菌體中的ARA增加。進(jìn)而本發(fā)明提供上述制造方法，其中，培養(yǎng)結(jié)束后的每lml培養(yǎng)基中的DGLA量為5.5mg以上、優(yōu)選6.5mg以上、更優(yōu)選7.0mg以上、進(jìn)一步優(yōu)選7.5mg以上。進(jìn)而本發(fā)明提供上述制造方法，其中，與不包括工序(a)(c)的制造方法相比，培養(yǎng)結(jié)束后的每lml培養(yǎng)基中的DGLA量增加5%以上、優(yōu)選10%以上、更優(yōu)選15%以上。進(jìn)而本發(fā)明提供上述制造方法，其中，與不包括工序(a)(c)的制造方法相比，培養(yǎng)結(jié)束后的每lml培養(yǎng)基中的ARA量增加。根據(jù)本發(fā)明的制造方法，微生物菌體中的PUFA、含有其的脂質(zhì)的含量飛躍提高，因此，可有效利用含有PUFA的微生物菌體、以及PUFA及含有其的脂質(zhì)。并且在本發(fā)明中，因?yàn)樵谥髋囵B(yǎng)開始前進(jìn)行(c)金屬離子的硫酸鹽的添加，渡過主培養(yǎng)初期的葡萄糖添加的必要時(shí)期之后，進(jìn)行(a)有機(jī)酸的添加、(b)培養(yǎng)基pH的控制即可，所以可以避免在同日進(jìn)行這些操作和葡萄糖的添加操作這一煩雜問題。其結(jié)果，可以提供PUFA或含有其的脂質(zhì)的低成本、操作簡(jiǎn)便的適合大量生產(chǎn)的制造方法、以及PUFA或含有其的脂質(zhì)的含量高的微生物菌體及其利用方法。圖l表示在實(shí)施例4中，從高山被孢霉(Mortierellaalpina)S14株的主培養(yǎng)開始第5天控制pH(pH5.0、5.8、7.2)時(shí)對(duì)DGLA量的影響。圖2表示在實(shí)施例5中，從高山被孢霉nvtortierella由ina)S14株的主培養(yǎng)開始第3天控制pH(pH6.6、6.9、7.2、7.5)時(shí)對(duì)DGLA量的影響。具體實(shí)施例方式作為可在本發(fā)明的制造方法中使用的微生物，可例舉具有ARA及/或DGLA生產(chǎn)能力的微生物，優(yōu)選為被孢霉屬絲狀菌，更優(yōu)選為被孢霉亞屬絲狀菌，進(jìn)而優(yōu)選為高山被孢霉。例如作為具有含有花生四烯酸作為構(gòu)成脂肪酸而形成的脂質(zhì)(甘油三酯)的生產(chǎn)能力的微生物，可例舉屬于被孢霉(Mortierella)、耳霉屬(Conidiobolus)、腐霉屬(Pythium)、疫霉屬(Phytophthora)、青霉屬(Penicillium)、枝f包屬(Cl油sporium)、毛霉屬(Mucor)、,廉刀菌屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillus)、紅酵母屬(Rhodotorula)、蟲霉屬(Entomophthora)、Echinosporamgium屬、7乂霉屬(Saprolegnia)白勺j敦生物。屬于被孢霉(Mortiere—一la)屬被孢霉(Mort.ierel1a)亞屬的微生物，例如可例舉長(zhǎng)孢被包霉(Mortierellaelongatsi)、Mortierellaexigua、Mortierellahygrophila、高山被孢霉(Mortierellaalpina)等。具體可例舉長(zhǎng)孢被孢霉(Mortierellaelongata)IF08570、MortierellaexiguaIF08571、MortierellahygrophilaIF05941、高山被孢霉(Mortierellaalpina)IF08568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等菌株。這些菌株均可從大阪市的財(cái)團(tuán)法人發(fā)酵研究所(IF0)、及美國(guó)菌種保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)以及CentrralBureauvoorSchimmelcultures(CBS)等中無任何限制地獲得。此外也可使用本發(fā)明研究組從土壤中分離的菌株高山被孢霉1S-4株、菌株長(zhǎng)孢被孢霉SAM0219(微工研菌寄第8703號(hào))(微工研條寄第1239號(hào))、采用常法亞硝基胍誘變法從1S-4株中誘導(dǎo)獲得的高山被孢霉S14株、高山被孢霉Iz3株等。此外，作為可在本發(fā)明的制造方法中使用的微生物，還包含上述微生物的突變株。例如可使用對(duì)屬于被孢霉亞屬的微生物進(jìn)行突變操作，使去飽和酶、碳鏈增長(zhǎng)酶的活性降低或缺損或提高的突變株。突變操作可采用同領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行。突變株是否具有所期望的PUFA生產(chǎn)能力，只要是同領(lǐng)域技術(shù)人員即可容易地判斷。[基本培養(yǎng)操作]本發(fā)明提供在培養(yǎng)上述微生物的同時(shí)制造多不飽和脂肪酸(PUFA)及含有其的脂質(zhì)的方法。在上述微生物的培養(yǎng)中向培養(yǎng)基內(nèi)接種菌體的方法，根據(jù)培養(yǎng)方法同領(lǐng)域技術(shù)人員可適當(dāng)選擇。具體為將微生物菌株的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、孢子及/或菌絲、或者經(jīng)預(yù)培養(yǎng)獲得的種子培養(yǎng)液或通過種子培養(yǎng)回收的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、孢子及/或菌絲接種在液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基中并進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明的制造方法使用的培養(yǎng)基中，作為碳源，可以單獨(dú)或組合使用葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、糖蜜、甘油、甘露醇、蔗糖、山梨糖醇、半乳糖、糖化淀粉等，進(jìn)而還可以使用含有上述物質(zhì)的柑橘糖蜜、甜菜糖蜜、甜菜搾汁、甘蔗榨汁等，只要是同領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的碳源，可使用任意的碳源。作為氮源，可以使用同領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的氮源，例如除蛋白胨、酵9母浸膏、麥芽浸膏、肉浸膏、酪蛋白水解物、玉米漿、大豆蛋白、脫脂大豆、棉籽粕等天然氮源之外，還有尿素等有機(jī)氮源、以及硝酸鈉、硝酸銨等硝酸鹽、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨等銨鹽等無機(jī)氮源。特別是可以使用從大豆中獲得的氮源，具體為大豆、脫脂大豆、大豆片、食用大豆蛋白、豆腐渣、豆奶、熟黃豆面等。例如可單獨(dú)或組合使用對(duì)脫脂大豆實(shí)施熱改性后的產(chǎn)物，更優(yōu)選在約709(TC對(duì)脫脂大豆進(jìn)行熱處理，進(jìn)而除去乙醇可溶性成分后的產(chǎn)物，或者可與上述氮源組合使用。根據(jù)其它需要，可將磷酸離子、鉀離子、鈉離子、鎂離子、鈣離子、鐵、銅、鋅、錳、鎳、鈷等金屬離子、維生素等作為微量營(yíng)養(yǎng)源使用。根據(jù)需要，也可添加ADEKANATE等消泡劑。這些成分在培養(yǎng)基中的濃度，只要不阻礙微生物的生長(zhǎng)發(fā)育，無特別限制。實(shí)際使用中期望碳源的總添加量相對(duì)于培養(yǎng)基為0.l40w/w%、優(yōu)選為l25w/w%，氮源的總添加量相對(duì)于培養(yǎng)基為215w/w%、優(yōu)選為210w/w%。此外，已知在主培養(yǎng)中初始氮源濃度及/或碳源濃度過高時(shí)阻礙微生物的成長(zhǎng)。作為適當(dāng)?shù)姆绞?，使初始碳源添加量為l8w/w%、優(yōu)選l5w/V/。，初始氮源添加量為O.l8w/w%、優(yōu)選l6w/w。/。，在培養(yǎng)過程中添加微生物消耗的碳源及氮源進(jìn)行培養(yǎng)。將葡萄糖和其他化合物混合進(jìn)行滅菌，誘發(fā)化學(xué)反應(yīng)的可能性高，并且因?yàn)橐阎?氮比高時(shí)微生物的脂質(zhì)生產(chǎn)率高，所以作為特別適當(dāng)?shù)姆绞剑瑑H將碳源通過流加等添加在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。此外，為了提高微生物菌體中的含PUFA脂質(zhì)的含量，作為不飽和脂肪酸的前體，例如可將十六烷或十八垸等烴；油酸或亞油酸等脂肪酸或其鹽、或脂肪酸酯(例如乙酯、甘油脂肪酸酯、脫水山梨醇脂肪酸酯等)；或橄欖油、大豆油、菜籽油、棉籽油或椰子油等油脂類單獨(dú)或組合添加在培養(yǎng)基中。這些物質(zhì)的添加量相對(duì)于培養(yǎng)基為0.00110w/w%、優(yōu)選為0.0510w/w%。此外，也可將這些物質(zhì)作為培養(yǎng)基中的唯一碳源進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)可使用以往的培養(yǎng)微生物的方法，具體可使用靜置培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)、通氣攪拌培養(yǎng)等。作為培養(yǎng)操作法，可使用所謂的分批發(fā)酵法、批式流加發(fā)酵法、反復(fù)分批發(fā)酵法及連續(xù)發(fā)酵法等中的任一種。此外，作為攪拌方式，例如可使用葉輪(攪拌葉輪)、氣升發(fā)酵槽、發(fā)酵液的泵驅(qū)動(dòng)循環(huán)、及這些方式的組合等。本發(fā)明的制造方法可利用上述培養(yǎng)方法來實(shí)施，其中，采用在液體培養(yǎng)基中的通氣攪拌培養(yǎng)來進(jìn)行主培養(yǎng)在工業(yè)上有利。作為用于進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)的槽，例如可使用發(fā)酵罐及槽等的攪拌槽，但并不限于這些。在通氣攪拌培養(yǎng)中，例如可通入空氣等含氧氣體、氬及氮等不含氧的氣體中的任一種，這種氣體可由同領(lǐng)域技術(shù)人員結(jié)合培養(yǎng)體系的條件來適當(dāng)選擇。例如在下述實(shí)施例記載的方法(作為本發(fā)明的一種方式的高山被孢霉(Mortierellaalpina)時(shí))中，向培養(yǎng)基中通入空氣等含氧氣體。微生物的培養(yǎng)溫度因使用的微生物不同而不同，通常為54CTC、優(yōu)選203CTC。作為另一方式，在203(TC進(jìn)行培養(yǎng)使菌體增殖后，在52(TC繼續(xù)培養(yǎng)可生產(chǎn)含PUFA的脂質(zhì)。采用這樣的溫度管理，也可提高含PUFA的脂質(zhì)中的PUFA含量。在試管、燒瓶中培養(yǎng)上述微生物時(shí)(預(yù)培養(yǎng)階段)的培養(yǎng)時(shí)間通常為110天、優(yōu)選15天、更優(yōu)選13天。后續(xù)的主培養(yǎng)的培養(yǎng)時(shí)間通常為230天、優(yōu)選520天、更優(yōu)選515天?？蓪⑺谕腜UFA含量、脂肪酸組成作為判斷主培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的基準(zhǔn)。主培養(yǎng)大致可分為微生物的對(duì)數(shù)增殖期、即從微生物的干燥菌體重量中減去菌體內(nèi)總脂肪酸重量后的無脂質(zhì)菌體量增加的時(shí)期、和其后續(xù)的PUFA等的脂肪酸積累期、即無脂質(zhì)菌大量變化小的時(shí)期。非專利文獻(xiàn)4中記載在10kL培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)高山被孢霉(Mortierellaalpina)1S-4時(shí)，具有從培養(yǎng)開始到第2天的增殖期(無脂質(zhì)菌體量增加)、和其后續(xù)的脂肪酸積累期(無脂質(zhì)菌體量幾乎無變化)。對(duì)數(shù)增殖期及脂肪酸積累期的判斷方法，可參照非專利文獻(xiàn)4記載的方法進(jìn)行。此外，在微生物主培養(yǎng)開始時(shí)(添加種子培養(yǎng)液時(shí))，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH為57、優(yōu)選為5.56.5。本發(fā)明提供上述制造方法，其為在培養(yǎng)上述微生物的同時(shí)制造PUFA及含有其的脂質(zhì)的方法，包括(a)在主培養(yǎng)開始后，在培養(yǎng)基中添加有機(jī)酸0.015w/v。/。的工序。向培養(yǎng)基中添加有機(jī)酸，例如可參照下述實(shí)施例進(jìn)行。在該工序(a)中，所述有機(jī)酸包含有機(jī)酸及其鹽、以及其水合物，以下有時(shí)將這些總稱為"有機(jī)酸等"。在本說明書中，有機(jī)酸是指在具有-COOH基的有機(jī)化合物中，在培養(yǎng)基中添加量為0.015w/v。/。時(shí)不阻礙上述微生物增殖的有機(jī)酸，其中特別優(yōu)選糖酵解途徑和其分支途徑、或TCA循環(huán)中包含的有機(jī)酸。糖酵解途徑及TCA循環(huán)是與以葡萄糖為初始物質(zhì)獲取能量、合成脂肪酸相關(guān)的中心途徑，其中大多數(shù)由有機(jī)酸構(gòu)成。這些有機(jī)酸通過糖酵解途徑、TCA循環(huán)、進(jìn)而通過其分支途徑、旁路途徑進(jìn)行相互變化。通常情況下，作為PUFA合成的最初階段的脂肪酸合成，需要上述途徑中生成的乙酰CoA、NADPH，與上述途徑密切相關(guān)。因此，期待通過改變培養(yǎng)基中有機(jī)酸的量、平衡來改變上述微生物的PUFA生產(chǎn)能力。特別優(yōu)選添加在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述微生物時(shí)，每單位重量微生物干燥菌體中的PUFA量增加的有機(jī)酸及/或每單位體積培養(yǎng)基中的PUFA量增加的有機(jī)酸。例如可使用琥珀酸、富馬酸、丙酮酸、乳酸、蘋果酸(這些為碳原子數(shù)為34的單或二羧酸，具有1個(gè)以下-0H基)、所述酸的鹽或其水合物中的至少1種，可優(yōu)選使用琥珀酸、蘋果酸、乳酸、所述酸的鹽或其水合物中的至少1種。作為有機(jī)酸的鹽，可使用鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、銨鹽中的至少1種。是否為添加時(shí)的優(yōu)選有機(jī)酸等，例如可根據(jù)下述實(shí)施例中記載的方法來判斷。在培養(yǎng)基中添加上述有機(jī)酸等，換算為游離有機(jī)酸，可添加0.015w/v%、優(yōu)選0.2w/V/o以上、更優(yōu)選0.22w/V。/。以上、進(jìn)一步優(yōu)選0.3w/V/。以上、特別為0.44w/v。/。以上。為0.01w/v。/。以下時(shí)，無法獲得提高上述微生物中的PUFA或含有其脂質(zhì)的含量的所期望效果，為5w/v。/。以上時(shí)，有可能阻礙上述微生物的增殖。此外，認(rèn)為在一定量以上時(shí)伴隨有機(jī)酸添加量的增加，上述微生物中的PUFA或含有其的脂質(zhì)的含量并不會(huì)增高，所以在該一定量以上的范圍可任意選擇有機(jī)酸添加量。作為優(yōu)選的一種方式，在培養(yǎng)基中可添加琥珀酸二鈉鹽'六水合物lw/v%、即可添加琥珀酸0.44w/v%。上述有機(jī)酸等，例如可作為水溶液添加在培養(yǎng)基中?？蓪⒂袡C(jī)酸水溶液調(diào)節(jié)至與有機(jī)酸添加前的培養(yǎng)基相同程度的PH后添加，也可調(diào)節(jié)為不同的pH可使培養(yǎng)基的pH變化。上述有機(jī)酸等在微生物的主培養(yǎng)中添加，優(yōu)選不是在主培養(yǎng)開始前，而是在主培養(yǎng)開始后添加。因?yàn)榭紤]到有機(jī)酸等的添加效果表現(xiàn)在脂肪酸積累期，所以在上述微生物的主培養(yǎng)開始后、適合在對(duì)數(shù)增殖期結(jié)束轉(zhuǎn)移至脂肪酸積累期后、例如在主培養(yǎng)開始后24小時(shí)之后、優(yōu)選在主培養(yǎng)開始后第3天之后、更優(yōu)選在主培養(yǎng)開始后第4天之后在培養(yǎng)基中添加上述有機(jī)酸。特別是可在主培養(yǎng)開始后第35天之間、例如在主培養(yǎng)開始后第4天添加有機(jī)酸。此外，有機(jī)酸可以1次添加，也可以分為數(shù)次添加，從操作簡(jiǎn)便性的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選1次添加。[pH]本發(fā)明提供上述制造方法，其為在培養(yǎng)上述微生物的同時(shí)，制造PUFA及含有其的脂質(zhì)的方法，包括(b)在主培養(yǎng)開始后，控制培養(yǎng)基的pH使其在培養(yǎng)有效范圍內(nèi)提高的工序。培養(yǎng)基pH的控制，例如可參照下述實(shí)施例進(jìn)行。認(rèn)為培養(yǎng)中的培養(yǎng)基pH對(duì)微生物代謝產(chǎn)生影響，特別會(huì)對(duì)參與電子傳遞系統(tǒng)的脂肪酸合成、去飽和反應(yīng)產(chǎn)生大的影響。培養(yǎng)基的pH的控制，可參照同領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行控制，使其比控制前的培養(yǎng)基的pH高、且為不阻礙微生物增殖的范圍內(nèi)(培養(yǎng)有效范圍內(nèi))。例如在考慮控制前的培養(yǎng)基pH的情況下，可進(jìn)行控制使培養(yǎng)基的pH提高到68的范圍內(nèi)，該范圍優(yōu)選pH6.37.5、更優(yōu)選pH6.67.5、進(jìn)一步優(yōu)選p朋.97.2。pH的控制，優(yōu)選用NaOH、K0H、NaHC03、氨等堿性水溶液進(jìn)行，特別是可使用廉價(jià)、容易獲得且對(duì)上述微生物不良影響小的NaOH水溶液進(jìn)行。已知在上述微生物的主培養(yǎng)開始時(shí)被調(diào)節(jié)至pH57、優(yōu)選pH5.56.5的培養(yǎng)基的pH，通常在微生物的對(duì)數(shù)增殖期降低一次后，再逐漸恢復(fù)到原來的pH，在脂肪酸積累期變化小。培養(yǎng)基的pH控制，在上述微生物的主培養(yǎng)中進(jìn)行，優(yōu)選不在主培養(yǎng)開始前，而是在主培養(yǎng)開始后進(jìn)行。因?yàn)檎J(rèn)為PH控制的效果表現(xiàn)在脂肪酸積累期，所以在上述微生物的主培養(yǎng)開始后、適合在對(duì)數(shù)增殖期結(jié)束轉(zhuǎn)移至脂肪酸積累期后、例如在主培養(yǎng)開始后24小時(shí)之后、優(yōu)選在主培養(yǎng)開始后第3天之后、更優(yōu)選在主培養(yǎng)開始后第4天之后進(jìn)行上述pH的控制。特別是可在主培養(yǎng)開始后第35天之間、例如在主培養(yǎng)開始后第4天進(jìn)行。此外，pH的控制可在控制開始后至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)連續(xù)進(jìn)行，考慮到在脂肪酸積累期的pH變化小及操作簡(jiǎn)便性，可優(yōu)選在脂肪酸積累期進(jìn)行1次。本發(fā)明提供上述制造方法，其為在培養(yǎng)上述微生物的同時(shí)，制造PUFA及含有其的脂質(zhì)的方法，包括(C)在主培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加金屬離子的硫酸鹽0.010.5w/wT。的工序。在培養(yǎng)基中添加金屬離子的硫酸鹽，例如可參照下述實(shí)施例進(jìn)行。作為上述金屬離子的硫酸鹽，例如可單獨(dú)或組合添加MgS04、CaS04、Na2S04、K2S04、FeS04、MnS04等，優(yōu)選MgS04及CaS04。更優(yōu)選代替培養(yǎng)基中的金屬氯化物、例如MgCl2、CaCl2，添加相應(yīng)的上述硫酸鹽、例如MgS04、CaS04。在添加時(shí)可使用這些化合物的水合物。這些金屬離子的硫酸鹽是水合物時(shí)，用除去水分子的重量換算，在培養(yǎng)基中可添加合計(jì)為0.010.5w/w%、優(yōu)選0.010.25w/w%、更優(yōu)選0.050.2w/w°/。、特別優(yōu)選0.060.lw/w%。添加MgS04及/或CaS04時(shí)，可同時(shí)添加Na2S04，但優(yōu)選Na2S04相對(duì)于培養(yǎng)基為O.lw/V/c)以下，更優(yōu)選不添加Na2S04。此外，作為金屬離子的硫酸鹽使用MgS04及CaS04時(shí)，例如相對(duì)于培養(yǎng)基，可以為0.05w/w%MgS04'7H20+0,05w/w%CaS042H20、0.06w/w%MgS04*7H20+0.06w/w%CaS04'2H20等的添加量。上述金屬離子的硫酸鹽可在主培養(yǎng)開始前添加到培養(yǎng)基中，也可在主培養(yǎng)過程中添加。與有機(jī)酸等不同，在對(duì)培養(yǎng)基滅菌時(shí)可與葡萄糖等碳源進(jìn)行反應(yīng)的可能性低，而且從操作簡(jiǎn)便性的觀點(diǎn)來考慮，優(yōu)選在主培養(yǎng)開始前的培養(yǎng)基中1次添加上述金屬離子的硫酸鹽。上述工序(a)(c)可分別進(jìn)行，也可多數(shù)組合進(jìn)行。例如使工序(a)及(b)組合進(jìn)行時(shí)，通過工序(a)也可引起pH變化，并且從操作簡(jiǎn)便性的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選所述工序在同日、更優(yōu)選在同時(shí)進(jìn)行。從更進(jìn)一歩的操作簡(jiǎn)便性的觀點(diǎn)來看，使所述工序避開碳源、例如葡萄糖的添加時(shí)機(jī)，優(yōu)選在與添加碳源不同的日子進(jìn)行。進(jìn)而例如可使工序(a)及(c)、工序(b)及(c)、工序(a)、(b)及(c)組合進(jìn)行，此時(shí)從操作簡(jiǎn)便性的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選使工序(c)在主培養(yǎng)開始前進(jìn)行，使工序(a)及/或(b)在主培養(yǎng)開始后、與碳源添加不同的日子進(jìn)行。從本發(fā)明的目的在于提供PUFA或含有其的脂質(zhì)的含量高的微生物菌體的觀點(diǎn)來看，特別優(yōu)選使上述工序(a)、(b)及(c)全部組合進(jìn)行。通過上述培養(yǎng)，在微生物菌體內(nèi)生產(chǎn)并積累含有PUFA的脂質(zhì)。在此，作為本發(fā)明的制造方法中使用的微生物菌體中含有的脂質(zhì)，可例舉甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯、磷脂質(zhì)、溶血磷脂質(zhì)、糖脂質(zhì)、游離脂肪酸，特別是上述微生物菌體生產(chǎn)甘油三酯作為主要的脂質(zhì)。作為構(gòu)成上述脂質(zhì)的脂肪酸可例舉PUFA。作為PUFA，只要是上述微生物菌體內(nèi)含有、生產(chǎn)，蓄積的脂肪酸，無特別限制，例如可例舉二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、二高-Y-亞麻酸(DGLA)、Mead酸、二十碳四烯酸、花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳三烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十四碳二烯酸、二十四碳三烯酸、二十四碳四烯酸、二十四碳五烯酸、及二十四碳六烯酸等。在本發(fā)明的制造方法中，因?yàn)槭褂锰貏e是具有ARA、DGLA生產(chǎn)能力的微生物，所以PUFA中特別優(yōu)選ARA及DGLA，最優(yōu)選DGLA。通過對(duì)作為上述微生物的一例的被孢霉屬微生物的培養(yǎng)進(jìn)行研究鉆研，可生產(chǎn)的DGLA、Mead酸、ARA、二十碳五烯酸也是優(yōu)選的PUFA(參照非專利文獻(xiàn)1)。本發(fā)明的課題之一是提供PUFA或含有其的脂質(zhì)的含量高的微生物菌體，從這一觀點(diǎn)來看，期望構(gòu)成上述微生物菌體中含有的脂質(zhì)的PUFA的含量高。該P(yáng)UFA為DGLA時(shí)，在培養(yǎng)基中不添加DGLA的情況下培養(yǎng)上述微生物后，DGLA或DGLA殘基以游離脂肪酸換算，例如用下述實(shí)施例記載的方法測(cè)定時(shí)每lg干燥菌體中大于164mg，例如為190mg以上、優(yōu)選195mg以上、更優(yōu)選200mg以上、進(jìn)一步優(yōu)選220mg以上。此外，在一種方式中，與以往的方法(不包括工序(a)(c))相比較，根據(jù)本發(fā)明的方法得到的每lg干燥菌體中的DGLA增加，以游離脂肪酸換算，例如增加3%以上、優(yōu)選5%以上、更優(yōu)選10%以上。此外，在一種方式中，與以往的方法(不包括工序(a)(c))相比較，根據(jù)本發(fā)明的方法得到的每lg干燥菌體中的ARA增加。同樣，期望構(gòu)成上述微生物菌體中含有的脂質(zhì)的PUFA在每單位培養(yǎng)基中的收量高。該P(yáng)UFA為DGLA時(shí)，在培養(yǎng)基中不添加DGLA的情況下培養(yǎng)上述微生物后，每lml培養(yǎng)基中的DGLA或DGLA殘基的收量以游離脂肪酸換算，例如用下述實(shí)施例記載的方法測(cè)定時(shí)為5.5mg以上、優(yōu)選6.5mg以上、更優(yōu)選7.Omg以上、進(jìn)一步優(yōu)選7.5mg以上。此外，在一種方式中，與以往的方法(不包括工序(a)(c))相比較，在本發(fā)明的制造方法中培養(yǎng)結(jié)束后的每lml培養(yǎng)基中的15DGLA量增加，例如增加5%以上、優(yōu)選10%以上、更優(yōu)選15%以上。此外，在一種方式中，與以往的方法(不包括工序(a)(c))相比較，在本發(fā)明的制造方法中培養(yǎng)結(jié)束后的每lml培養(yǎng)基中的ARA量增加。在一種方式中，優(yōu)選用本發(fā)明的制造方法得到的PUFA或含有其的脂質(zhì)中的上述總脂肪酸中的DGLA多，以游離脂肪酸換算，例如用下述實(shí)施例中記載的方法測(cè)定時(shí)，例如為35w/V/。以上、優(yōu)選37w/W/。以上、特別優(yōu)選40w/w9&以上。培養(yǎng)結(jié)束后，采用同領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法例如日本特開2000-69987、或參照下述實(shí)施例中記載的方法，可從培養(yǎng)基中獲得PUFA、含有PUFA的脂質(zhì)、含有所述物質(zhì)的微生物菌體。對(duì)于獲得的PUFA、含有PUFA的脂質(zhì)，已在上述例舉。根據(jù)需要對(duì)菌體殺菌后，優(yōu)選進(jìn)行干燥。用于獲得微生物干燥菌體的干燥工序，可通過烤箱加熱、冷凍干燥、熱風(fēng)干燥等進(jìn)行。從培養(yǎng)結(jié)束后的培養(yǎng)基中獲得的微生物菌體，期望每單位培養(yǎng)基中的干燥菌體的重量多，例如優(yōu)選每lml培養(yǎng)基中的干燥菌體重量約為34mg以上。使用同領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法，可以從干燥菌體或濕菌體中獲得含有PUFA的脂質(zhì)。例如用己烷等有機(jī)溶劑對(duì)干燥菌體提取處理后，通過在減壓條件下從提取物中蒸餾除去有機(jī)溶劑，獲得以甘油三酯為主的高濃度的含有PUFA的脂質(zhì)。并且通過對(duì)得到的以甘油三酯為主的脂質(zhì)進(jìn)行脫膠、脫酸、脫色、脫臭等通常對(duì)食用油脂實(shí)施的精制處理，可獲得高純度的精制食用油脂(甘油三酯)。脂質(zhì)中的PUFA可直接分離，但通過形成低級(jí)醇酯例如甲酯，可容易地從其它脂質(zhì)成分中分離出來。此外，可容易地僅將所需的PUFA從其它PUFA中分離出來。這種分離方法是同領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。本發(fā)明的微生物菌體，可直接或使其干燥利用。此外，用本發(fā)明的制造方法獲得的PUFA及含有其的脂質(zhì)，也可用各種方法利用。可使用同領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法，例如如下述實(shí)施例所記載，將上述物質(zhì)配合到例如包括營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)助品、營(yíng)養(yǎng)組合物、動(dòng)物用飼料(特別是寵物食品)、魚貝類養(yǎng)殖用飼料、奶粉等的飲食品中進(jìn)行利用。關(guān)于PUFA、特別是ARA、DGLA的優(yōu)選攝取量，例如可參照非專利文獻(xiàn)l的記載。這樣，通過使用本發(fā)明涉及的微生物菌體，即使微生物菌體的配合量少，也可簡(jiǎn)便地獲得PUFA、特別是DGLA含量高的上述飲食品，例如配合微生物干燥菌體0.5w/w%，可獲得100g中含有DGLA約lOOmg以上的寵物食品。此外，從上述微生物菌體中提取、精制的甘油三酯，在總脂肪酸中占有的DGLA非常高，適合作為食用油脂。對(duì)于上述微生物(干燥)菌體、PUFA或含有其的脂質(zhì)、或配合了這些物質(zhì)的飲食品，可將其具體用途(例如用于營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)助、成長(zhǎng)促進(jìn)、體質(zhì)改善、供給特定的脂肪酸(例如DGLA、ARA)、腦功能改善等)及/或其具體使用方法(例如用量、次數(shù)、時(shí)間等)表示出來。實(shí)施例以下根據(jù)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。此外，在實(shí)施例中高山被孢霉(Mortierellaalpina)1S-4株產(chǎn)生含ARA脂質(zhì)。高山被孢霉(Mortierellaalpina)S14株是本發(fā)明者從高山被孢霉(Mortierellaalpina)1S-4株中獲得的突變株，是幾乎完全喪失了使作為ARA的直接前體的DGLA轉(zhuǎn)化為ARA的△5去飽和酶的活性的菌株。即幾乎不產(chǎn)生ARA，而產(chǎn)生含有顯著量的DGLA的脂質(zhì)(參照非專利文獻(xiàn)1)。高山被孢霉(Mortierellaal。ina)Iz3株與S14株同樣幾乎不產(chǎn)生ARA，而產(chǎn)生顯著量的含有DGLA的脂質(zhì)。在已裝入試管內(nèi)的10ml大豆粉液體培養(yǎng)基(3w/w%葡萄糖、1.5W/w%大豆粉、0.3w/w%K2HP04、0.lw/w%Na2S04、0.05w/w%MgCl2'6H20、0.05w/w%CaCl"2H20、pH6.3)中，接種約1白金耳的高山被孢霉(Mortierellaalpina)S14株，在28。C振蕩培養(yǎng)3天。在培養(yǎng)開始第4天，將滅菌后的50w/V/。葡萄糖溶液添加到.6ml培養(yǎng)基中，同時(shí)添加用NaOH調(diào)節(jié)pH為6.0的5w/v。/。濃度的各種有機(jī)酸水溶液0.6ml，進(jìn)一步繼續(xù)培養(yǎng)(振蕩培養(yǎng))。有機(jī)酸相對(duì)于全體培養(yǎng)基的濃度相當(dāng)于0.3w/W。在此，作為有機(jī)酸，使用琥珀酸、富馬酸、丙酮酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸及乙酸。此外，作為對(duì)照，除不添加有機(jī)酸水溶液之外，進(jìn)行同樣培養(yǎng)。在接種第10天結(jié)束培養(yǎng)，用日本特開2000—69987號(hào)記載的方法進(jìn)行干燥菌體的甲酯化，將獲得的脂肪酸甲酯乙酯用氣相色譜法分析。g卩在培養(yǎng)結(jié)束后，通過過濾從培養(yǎng)液中獲得培養(yǎng)菌體，將其充分洗滌后，用烤箱加熱(100°C)進(jìn)行干燥，獲得干燥菌體。將獲得的干燥菌體加入螺口試管(16.5mmcl))內(nèi)，加入二氯甲垸lml、無水甲醇一鹽酸(10%)2ml，通過在50。C處理3小時(shí)，使菌體內(nèi)的脂肪酸殘基甲酯化，加入正己烷4ml、水lml，提取2次，提取液的溶劑用離心蒸發(fā)器(4CTC、1小時(shí))蒸發(fā)除去獲得脂肪酸甲酯。用毛細(xì)管氣相色譜法分析獲得的脂肪酸甲酯，求出DGLA的量。結(jié)果如表l所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>添加琥珀酸、富馬酸、丙酮酸或乳酸時(shí)，每單位培養(yǎng)基中的干燥菌體重量、每單位重量干燥菌體中的DGLA量、每單位體積培養(yǎng)基中的DGLA量均增加，但添加擰檬酸、酒石酸、乙酸時(shí)未觀察到這樣的效果。[實(shí)施例2燒瓶培養(yǎng)中有機(jī)酸的添加效果]在已裝入燒瓶?jī)?nèi)的100ml的含有酵母浸膏的液體培養(yǎng)基(8w/w"/。葡萄糖、1.5雙/\￥%酵母浸膏、0.3w/w%K2HP04、0.lw/V/。Na2S04、0.05w/w%MgCl2'6H20、0.05w/w%CaCl2*2H20、pH6.3)中，接種約1白金耳高山被孢霉(Mortierellaalpina)S14株，在2『C振蕩培養(yǎng)5天。在培養(yǎng)開始第6天，添加2ml的用NaOH調(diào)節(jié)pH為6.0的10w/v%乳酸水溶液，進(jìn)一歩繼續(xù)培養(yǎng)(振蕩培養(yǎng))。乳酸相對(duì)于全體培養(yǎng)基的濃度相當(dāng)于0.2w/v%。在接種第IO天結(jié)束培養(yǎng)，采用與實(shí)施例l同樣的方法，獲得干燥菌體，求出DGLA量。結(jié)果如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>通過添加乳酸，每單位培養(yǎng)基中的干燥菌體重量、每單位重量干燥菌體中的DGLA量、每單位體積培養(yǎng)基中的DGLA量均增加。并且，獲得的脂質(zhì)中含有的總脂肪酸中的DGLA比例也增加。將1白金耳高山被孢霉(Mortierellaalpina)S14株接種于種子培養(yǎng)基100ml(2w/w。/。葡萄糖、lw/w%酵母浸膏、pH6.3)中，在往復(fù)振蕩100rpm、28。C的條件下進(jìn)行3天預(yù)培養(yǎng)，制備種子培養(yǎng)液。接著在容積10L的通氣攪拌培養(yǎng)槽中加入5L主培養(yǎng)基(2w/w。/。葡萄糖、1.5w,/w%大豆粉、0.lw/w°/。甘油、0.2w/Vo/0大豆油、0.3w/w%K2HP04、0.lw/w%Na2S04、0.05w/w%MgCl2*6H20、0.05w/w%CaCl22H20、pH6.3)并進(jìn)行滅菌，將上述種子培養(yǎng)液全部添加到其中。然后在26。C、通氣量lvvm(空氣、以下實(shí)施例中也相同)、攪拌轉(zhuǎn)速300rpm的條件下，通氣攪拌培養(yǎng)(主培養(yǎng))7天。根據(jù)葡萄糖的消耗適當(dāng)流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完?？紤]經(jīng)過對(duì)數(shù)增殖期進(jìn)入脂肪酸積累期的時(shí)間，在主培養(yǎng)開始第4天，添加用NaOH調(diào)節(jié)至pH6.3的有機(jī)酸水溶液(琥珀酸、富馬酸、乳酸)，使其終濃度為0.3w/v。/。，然后進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)。在主培養(yǎng)開始第7天，采用與實(shí)施例l同樣的方法，獲得干燥菌體，求出DGLA量。結(jié)果如表3所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>添加琥珀酸、富馬酸、乳酸時(shí)，每單位重量干燥菌體中的DGLA量、每單位體積培養(yǎng)基中的DGLA量均增加。并且獲得的脂質(zhì)中含有的總脂肪酸中的DGLA的比例也增加。特別是使用琥珀酸及富馬酸時(shí)，增加更加顯著。[實(shí)施例4接種后的pH控制的影響1]將約1白金耳高山被孢霉(Mortierellaalpina)S14株接種于種子培養(yǎng)基100ml(2。/。葡萄糖、1%酵母浸膏、p朋.3)中，在往復(fù)振蕩100rpm、28。C的條件下進(jìn)行3天預(yù)培養(yǎng)，制備種子培養(yǎng)液。接著，在容積10L的通氣攪拌培養(yǎng)槽中加入5L主培養(yǎng)基(2w/w0/。葡萄糖、1.5w/w%大豆粉、0.02w/w%甘油、0.2w/w%大豆油、0.3w/w%K2HP04、0.lw/w%Na2S04、0.05w/w%MgCl2*6H20、0.05w/w%CaCl22H20、pH6.3)并進(jìn)行滅菌，將上述種子培養(yǎng)液全部添加到其中。然后，在26。C、通氣量lvvm、攪拌轉(zhuǎn)速300卬m的條件下，進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)13天(主培養(yǎng))。根據(jù)葡萄糖的消耗適當(dāng)流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完。考慮經(jīng)過對(duì)數(shù)增殖期進(jìn)入脂肪酸積累期的時(shí)間，在主培養(yǎng)開始第5天到結(jié)束培養(yǎng)為止，使用經(jīng)過滅菌的NaOH溶液或硫酸，調(diào)節(jié)pH為5.0、5.8、7.2。此外，未調(diào)節(jié)的對(duì)照組在主培養(yǎng)開始第5天的pH約為6.3。在主培養(yǎng)開始第13天，采用與實(shí)施例1同樣的方法獲得干燥菌體，求出DGLA量。結(jié)果如圖1A1C所示。圖中橫軸表示培養(yǎng)第5天的pH值。從第5天開始控制pH低(低于對(duì)照p朋.3的pH)時(shí)的微生物的DGLA生產(chǎn)能力低，但控制pH高(高于對(duì)照p朋.3的pH)時(shí)的微生物的DGLA生產(chǎn)能力提高。采用與實(shí)施例4同樣的方法，培養(yǎng)高山被孢霉(Mortierellaalpina)S14株(預(yù)培養(yǎng):3天、主培養(yǎng)ll天)。根據(jù)葡萄糖的消耗適當(dāng)流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完?？紤]經(jīng)過對(duì)數(shù)增殖期進(jìn)入脂肪酸積累期的時(shí)間，從主培養(yǎng)開始第3天至培養(yǎng)結(jié)束，使用經(jīng)過滅菌的NaOH溶液或硫酸，調(diào)節(jié)pH為6.6、6.9、7.2、7.5。在主培養(yǎng)開始第11天，采用與實(shí)施例1同樣的方法，獲得干燥菌體，求出DGLA量。結(jié)果如圖2A2C所示。圖中橫軸表示培養(yǎng)第3天的pH值。從第3天開始控制pH，與控制pH為6.6、7.5時(shí)相比，控制pH為6.9或7.2時(shí)微生物的DGLA生產(chǎn)能力提高。此外，在主培養(yǎng)開始后第5天及第3天控制pH，發(fā)現(xiàn)DGLA生產(chǎn)能力均提高，所以認(rèn)為可在主培養(yǎng)開始后的該前后的時(shí)期、在適合培養(yǎng)操作的時(shí)期進(jìn)行PH控制。20采用與實(shí)施例4同樣的方法，培養(yǎng)高山被孢霉(MortierellaalDina)1S-4株(預(yù)培養(yǎng):3天、主培養(yǎng):7天)。根據(jù)葡萄糖的消耗適當(dāng)流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完。在主培養(yǎng)開始第4天，在pH為6.6的培養(yǎng)基中加入經(jīng)過滅菌的NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH為6.8。然后未進(jìn)行特別的pH調(diào)節(jié)。在主培養(yǎng)開始第7天，采用與實(shí)施例1同樣的方法，獲得干燥菌體，求出ARA的量。結(jié)果如表4所示。表4pH調(diào)節(jié)無6.6—6,8千燥菌體重量(mg/ml培養(yǎng)基)40.034.3每單位重量千燥菌體中的ARA量(mg/g千燥菌體)M0206每單位體積培養(yǎng)基中的ARA量(mg/ml培養(yǎng)基)5.307.07總脂肪酸中的ARA的比例(9031.137.9從第4天開始調(diào)節(jié)pH，但與無調(diào)節(jié)時(shí)相比，微生物的ARA生產(chǎn)能力提高。[實(shí)施例7有機(jī)酸的添加方法]采用與實(shí)施例4同樣的方法，培養(yǎng)高山被孢霉(M。rtierellaalpina)S14株(預(yù)培養(yǎng):3天、主培養(yǎng)10天)。根據(jù)葡萄糖的消耗適當(dāng)流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完。僅在主培養(yǎng)開始第4天、或在第4天和第7天添加琥珀酸或乳酸的鈉鹽水溶液，使最終濃度為農(nóng)1所示量的琥珀酸或乳酸。此外，表4的AE中的任一種均是在第4天使用NaOH水溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH為約6.9。在主培養(yǎng)開始第10天，采用與實(shí)施例1同樣的方法，獲得干燥菌體，求出DGLA量。結(jié)果如表5所示。表5有機(jī)酸添加量(相對(duì)于培養(yǎng)基w/vx)對(duì)照A已CD琥珀酸第4天00.220.220.220.44第7天000.2200乳酸第7天0000，220千燥菌體重量(mg/ml培養(yǎng)基)34.636.836.636.939.1每單位重量千燥菌體中的DGLA量220227243228241(ing/g千燥菌體)每單位體積培養(yǎng)基中的DGLA量7.608.338.908.409.41(mg/ml培養(yǎng)基)總脂肪酸中的DGLA的比例(SO40.940.843.041.242.2此外，在第4天或第7天添加琥珀酸或乳酸，使其濃度為0.22w/v呢或0.44w/V/。時(shí)，均具有增加每單位重量干燥菌體中的DGLA量、每單位體積培養(yǎng)基中的DGLA量等的效果。此外，將琥珀酸和乳酸組合添加也有效。將約1白金耳高山被孢霉(Mortierellaal。ina)S14株接種于種子培養(yǎng)基100ml(2w/w%葡萄糖、lw/w%酵母浸膏、pH6.3)中，在往復(fù)振蕩100rpm、28°C的條件下進(jìn)行3天預(yù)培養(yǎng)，制備種子培養(yǎng)液。接著在容積10L的通氣攪拌培養(yǎng)槽中加入5L主培養(yǎng)基(2w/wT。葡萄糖、1.5w/w%大豆粉、0.02w/w%甘油、0.lw/w%大豆油、0.3w/w%K2HP04、0.lw/w%Na2S04、0.05w/w%MgCl2*6H20、0.05w/w%CaCl22H20、pH6.3)并進(jìn)行滅菌，將上述種子培養(yǎng)液全部加入其中。然后在26。C、通氣量lvvm、攪拌轉(zhuǎn)速300rpm的條件下，通氣攪拌培養(yǎng)11天(主培養(yǎng))。根據(jù)葡萄糖的消耗適當(dāng)流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完。在主培養(yǎng)開始第4天，添加琥珀酸鈉鹽水溶液使琥珀酸水溶液的最終濃度為0.44、0.87、1.3w/v%。此外，任一種均是在主培養(yǎng)開始第4天使用NaOH水溶液將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至約為6.9。在主培養(yǎng)開始第ll天，采用與實(shí)施例1同樣的方法，獲得干燥菌體，求出DGLA量。結(jié)果如表6所示。表6琥珀酸添加量0.44w/v%0.87wM1.3w/v%千燥菌體重量(mg/邁l培養(yǎng)基)37.337.637.2每單位重量千燥菌體中的DGLA量(mg/g千燥菌體)2252282"每單位體積培養(yǎng)基中的DGLA量(mg/ml培養(yǎng)基)8.398.577.87總脂肪酸中的DGLA的比例(％)40.040.439.2以各種濃度添加琥珀酸時(shí)，發(fā)現(xiàn)添加0.87w/v。/。或1.3w/V/。時(shí)可獲得與添加0.44wV石時(shí)幾乎同等的生產(chǎn)能力。由此認(rèn)為，在一定量以上，伴隨有機(jī)酸的添加量的增加，DGLA量并不會(huì)增加，因此可選擇一定量以上的任意的有機(jī)酸添加采用與實(shí)施例8同樣的方法，培養(yǎng)高山被孢霉(Mortierellaalpina)S14株(預(yù)培養(yǎng)3天、主培養(yǎng):S天)。根據(jù)葡萄糖的消耗適當(dāng)流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完。在主培養(yǎng)開始第4天，添加蘋果酸鈉鹽水溶液使蘋果酸水溶22液的最終濃度為0.71w/v%。此外，任一種均是在主培養(yǎng)開始第4天使用NaOH水溶液將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至約為6.9。在主培養(yǎng)開始第8天，采用與實(shí)施例1同樣的方法，獲得干燥菌體，求出DGLA量。結(jié)果如表7所示。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>通過添加蘋果酸，可獲得DGLA含量高的菌體。將約l白金耳高山被孢霉(Mortierellaalpina)Iz3株，接種于種子培養(yǎng)基100ml(2w/w%葡萄糖、lw/w%酵母浸膏、pH6.3)中，在往復(fù)振蕩100rpm、28°C的條件下進(jìn)行3天預(yù)培養(yǎng)，制備種子培養(yǎng)液。工z3株與S14株相同，是對(duì)ARA生產(chǎn)菌高山被孢霉(Mortierellaalpina)IS-4株進(jìn)行亞硝基胍的常法誘變處理而獲得的DGLA生產(chǎn)菌。接著，在容積10L的通氣攪拌培養(yǎng)槽內(nèi)加入5L主培養(yǎng)基(2w/w"3/。葡萄糖、1.5w/w%大豆粉、0.02w/w%甘油、0.2w/w%大豆油、0.3w/w%K2HP04、0.lw/w%Na2S04、。.05w/w%MgCl2*6H20、0.05w/w%CaCl2'2H20、pH6.3)并進(jìn)行滅菌，將上述種子培養(yǎng)液全部加入其中。然后在26"、通氣量lvvm、攪拌轉(zhuǎn)速300rpm的條件下，通氣攪拌培養(yǎng)9天(主培養(yǎng))。根據(jù)葡萄糖的消耗適當(dāng)流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完。在主培養(yǎng)開始第4天，添加琥珀酸鈉鹽水溶液以使琥珀酸水溶液的最終濃度為0.44w/v%。此外，任一種均是在主培養(yǎng)開始第4天使用NaOH水溶液將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至約6.9。在主培養(yǎng)開始第9天，采用與實(shí)施例1同樣的方法，獲得干燥菌體，求出DGLA量。結(jié)果如表8所示。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>由此可知，與S14株相同，通過添加琥珀酸，Iz3株的DGLA的生產(chǎn)能力也提高。使用高山被孢霉(Mortierellaalpina)S14株，將約1白金耳的保存菌株接種到酵母浸膏l(xiāng)w/V/。、葡萄糖2w/w%、pH6.3的培養(yǎng)基中，在往復(fù)振蕩100rpm、溫度28。C的條件下開始預(yù)培養(yǎng)(第一階段)，培養(yǎng)3天。接著，在50L容積的培養(yǎng)槽內(nèi)制備30L酵母浸膏l(xiāng)w/w%、葡萄糖2w/V%、大豆油0.lw/w%、p服.3的培養(yǎng)基，在其中接種種子培養(yǎng)液(第一階段)，開始預(yù)培養(yǎng)(第二階段)，培養(yǎng)2天。接著，在主培養(yǎng)培養(yǎng)基(2w/w。/。葡萄糖、3.lw/w%大豆粉、0.02w/w%甘油、0.3w/w%K2HP04、0.lw/w%N&S04、0.05w/w%MgCl2,6H20、0.05w/w%CaCl2*2H20、0.l%w/w%大豆油、0.01w/w%ADEKANATE、p朋.3)中接種種子培養(yǎng)液(第二階段)，配成合計(jì)6000L的初始培養(yǎng)液量(培養(yǎng)槽容積10kL)。在溫度26°C、內(nèi)壓200kPa下開始培養(yǎng)。在培養(yǎng)第15天流加葡萄糖，在不使培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗用完的同時(shí)培養(yǎng)12天。未進(jìn)行主培養(yǎng)中的pH控制時(shí)，發(fā)現(xiàn)pH在6.06.5之間推移，在對(duì)數(shù)增殖期降低一次后，再逐漸恢復(fù)到原來的PH，在脂肪酸積累期變化小的趨勢(shì)。培養(yǎng)結(jié)束后，在121。C、20分鐘的條件下對(duì)培養(yǎng)液7.9kL進(jìn)行殺菌后，利用附帶空氣壓縮結(jié)構(gòu)的臥式壓濾機(jī)回收濕菌體，用iocrc熱風(fēng)干燥，獲得干燥菌體(水分含量2%)。獲得的干燥菌體量為47.2kg/kL培養(yǎng)基、每單位重量干燥菌體中的DGLA量為174g/kg干燥菌體、每單位體積培養(yǎng)基中的DGLA量為8.18kg/kL培養(yǎng)基、總脂肪酸中DGLA的比例為39.1%。此外，在干燥菌體中加入己烷，在室溫下輕輕振蕩的同時(shí)實(shí)施提取。將獲得的己烷溶液用濾紙過濾除去含固體成分后，通過在減壓下加熱至約304(TC來除去己烷，獲得以DGLA為構(gòu)成脂肪酸而形成的甘油三酯。在甘油三酯中的總脂肪酸中DGLA所占比例為38.5%。采用與比較例1同樣的方法，用合計(jì)6000L的初始主培養(yǎng)液量開始高山被孢霉(Mortierellaalpina)S14株的培養(yǎng)。在主培養(yǎng)第13、及第6天流加葡萄糖，在不使培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗用完的同時(shí)培養(yǎng)12天。在主培養(yǎng)第4天添加lw/v。/。琥珀酸二鈉六水合物水溶液(60kg、相當(dāng)于琥珀酸0.44w/V/。)和NaOH(1.26kg)，使pH為6.9。然后直至培養(yǎng)結(jié)束培養(yǎng)基的pH為6.97。培養(yǎng)結(jié)束后，采用與比較例l同樣的方法，獲得干燥菌體及以DGLA為構(gòu)成脂肪酸形成的甘油三酯。獲得的干燥菌體重量為51.8kg/kL培養(yǎng)基、每單位重量干燥菌體中的DGLA量為240g/kg干燥菌體、每單位體積培養(yǎng)基中的DGLA量為12.43kg/kL培養(yǎng)基。此外，獲得的甘油三酯中的總脂肪酸中DGLA所占比例為45.8%。對(duì)于比較例1及實(shí)施例11中獲得的干燥菌體及DGLA的量，結(jié)果如表9所示。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>[實(shí)施例12發(fā)酵罐培養(yǎng)中硫酸鹽的效果]將約1白金耳高山被孢霉(Mortierella由ina)S14株接種于種子培養(yǎng)基100ml(2w/w%葡萄糖、l%w/w%酵母浸膏、p朋.3)中，在往復(fù)振蕩100rpm、28。C的條件下進(jìn)行3天預(yù)培養(yǎng)。接著，在容積10L的通氣攪拌培養(yǎng)槽中加入5L主培養(yǎng)基并進(jìn)行滅菌，將上述種子培養(yǎng)液全部接種于其中，在26°C、通氣量lvvm、攪拌轉(zhuǎn)速300rpm的條件下培養(yǎng)11天。主培養(yǎng)基的組成為以下3種(i)氯鹽+硫酸鈉(對(duì)照)2w/w%葡萄糖、1.5w/w%大豆粉、0.02w/w%甘油、0.2w/w%大豆油、0.3w/w%K2,4、0.lw/w%Na2S04、0.05w/w%MgCl2*6H20、0.05w/w%CaCl2*2H20、pH6.3(ii)硫酸鹽+硫酸鈉2w/w%葡萄糖、1.5w/w%大豆粉、0.02w/w%甘油、0.2w/w%大豆油、0.3w/w%K2HP04、0.lw/w%Na2S04、0.05w/w%MgS04'7H20、0.05w/w%CaS04*2H20、pH6.3(iii)硫酸鹽-硫酸鈉2w/w%葡萄糖、1.5w/w%大豆粉、0.02w/w%甘油、0.2w/w%大豆油、0.3w/w%K2HP04、0.05w/w%MgS04*7H20、0.05w/w%CaS04*2H20、pH6.3根據(jù)葡萄糖的消耗適當(dāng)流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完。在主培養(yǎng)開始第4天，添加琥珀酸鈉鹽水溶液使琥珀酸水溶液的最終濃度為0.44w/v%。此外，任一種均是在主培養(yǎng)開始第4天使用NaOH水溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH為約6.9。在主培養(yǎng)開始第11天，采用與實(shí)施例1同樣的方法，獲得干燥菌體，求出DGLA量。結(jié)果如表IO所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>由此可見，使用"硫酸鹽+硫酸鈉"培養(yǎng)基時(shí)，每單位重量干燥菌體中的DGLA量、每單位體積培養(yǎng)基中的DGLA量均比對(duì)照增加。并且獲得的脂質(zhì)中含有的總脂肪酸中的DGLA的比例也增加。使用"硫酸鹽-硫酸鈉"培養(yǎng)基時(shí)，每一項(xiàng)均提高。除主培養(yǎng)基的組成為2w/w%葡萄糖、1.5w/w%大豆粉、0.02w/w%甘油、0.2w/w%大豆油、0.3w/w%K2HP04、0.01w/w%MgS04'7H20、0.01w/w%CaS04'2H20、pH6.3之外，采用與實(shí)施例12同樣的方法，培養(yǎng)高山被孢霉(Mortierellaal由a)S14株(預(yù)培養(yǎng)3天、主培養(yǎng)ll天)。在主培養(yǎng)開始第11天，采用與實(shí)施例l同樣的方法，獲得干燥菌體，求出DGLA量。獲得的干燥菌體重量為33.7mg/mL培養(yǎng)基、每單位重量干燥菌體中的DGLA量為209mg/g干燥菌體、每單位體積培養(yǎng)基中的DGLA量為7.03g/L培養(yǎng)基。[實(shí)施例14硫酸鹽對(duì)花生四烯酸生產(chǎn)的效果]將約1白金耳高山被孢霉(Mortierellaalpina)1S-4株接種于種子培養(yǎng)基100ml(2w/w%葡萄糖、lw/w%酵母浸膏、pH6.3)中，在往復(fù)振蕩100rpm、28°C的條件下進(jìn)行3天預(yù)培養(yǎng)。接著，在容積50L的通氣攪拌培養(yǎng)槽中加入25L主培養(yǎng)基并進(jìn)行滅菌，將上述種子培養(yǎng)液全部接種于其中，在26°C、通氣量lvvm、攪拌轉(zhuǎn)速300rpm的條件下培養(yǎng)8天。主培養(yǎng)基的組成為以下2種(i)氯鹽(對(duì)照):2w/w%葡萄糖、3.lw/w%大豆粉、0.02w/w%甘油、0.lw/w%大豆油、0,3w/w%K2HP04、0.lw/w%Na2S04、0.05w/w%MgCl2'6H20、0.05w/w%CaCl2'2H20、pH6.3。(ii)硫酸鹽2w/w%葡萄糖、3.lw/w%大豆粉、0.02w/w%甘油、0.lw/w%大豆油、0.3w/w%K2HP04、0.06w/w%MgS04'7H20、0.06w/w%CaS04*2H20、p朋.3。根據(jù)葡萄糖的消耗適當(dāng)流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完，在主培養(yǎng)開始第4天，添加琥珀酸鈉鹽水溶液以使琥珀酸水溶液的最終濃度為0.44w/v%。此外，任一種均是在主培養(yǎng)開始第4天使用NaOH水溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為約6.9。在主培養(yǎng)開始第8天，采用與實(shí)施例1同樣的方法，獲得干燥菌體，求出ARA量。結(jié)果如表ll所示。表11培養(yǎng)基(i)鹽(對(duì)照)(ii)硫酸鹽千燥菌體重量(mg/ml培養(yǎng)基)36,539.3每單位重量千燥菌體中的ARA量(邁g/g千燥菌體)159182每單位體積培養(yǎng)基中的ARA量(mg/nil培養(yǎng)基)5.80in總脂肪酸中的ARA的比例(X)47.045.8除了使用2w/w%葡萄糖、4w/w%大豆粉、0.02w/w%甘油、0.3w/w%K2HP04、0.lw/w%Na2S04、0.05w/w%MgCl"6H20、0.05w/w%CaCl2'2H20、0.lw/w%大豆油、0.01w/w%ADEKANATE、p朋.3作為主培養(yǎng)培養(yǎng)基之外，采用與比較例1同樣的方法，用合計(jì)6000L的初始培養(yǎng)液量開始高山被孢霉(Mortierellaal由a)S14株的培養(yǎng)。在培養(yǎng)第l、2、3、6天流加葡萄糖，在不使培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗用完的同時(shí)培養(yǎng)10天。在主培養(yǎng)第4天添加lw/v%琥珀酸二鈉六水合物水溶液(6。kg、相當(dāng)于琥珀酸0.44w/V/。)和NaOH(1.26kg)，使pH為6.9。在培養(yǎng)結(jié)束后，采用與比較例l同樣的方法，獲得干燥菌體及以DGLA為構(gòu)成脂肪酸而形成的甘油三酯。獲得的干燥菌體重量為57.3kg/kL培養(yǎng)基、每單位重量干燥菌體中的DGLA量為168g/kg干燥菌體、每單位體積培養(yǎng)基中的DGLA量為9.31kg/kL培養(yǎng)基。并且獲得的甘油三酯中的總脂肪酸中DGLA所占比例為41.8%。除了使用2w/w%葡萄糖、4w/w%大豆粉、0.02w/w%甘油、0.3wMK風(fēng)、0.06w/w%MgS04'7H20、0.06w/w%CaS04'2H20、0.lw/w%大豆油、0.01w/w%ADEKANATE、p朋.3作為主培養(yǎng)培養(yǎng)基之外，采用與比較例2同樣的方法，培養(yǎng)高山被孢霉(Mortierellaalpirm)S14株。IO天的主培養(yǎng)結(jié)束后，采用與比較例1同樣的方法，獲得干燥菌體及以DGLA為構(gòu)成脂肪酸而形成的甘油三酯。獲得的干燥菌體重量為60.5kg/kL培養(yǎng)基、每單位重量干燥菌體中的DGLA量為193g/kg干燥菌體、每單位體積培養(yǎng)基中的DGLA量為11.70kg/kL培養(yǎng)基。并且獲得的甘油三酯中的總脂肪酸中DGLA所占比例為42.3%。對(duì)于比較例2及實(shí)施例15中獲得的干燥菌體及DGLA的量，結(jié)果如表12所表12比較例2實(shí)施例15千燥菌體重量(kg/kL培養(yǎng)基)57.360.5每單位重量千燥菌體中的DGLA量(g/kg千燥菌體))168193每單位體積培養(yǎng)基中的DGLA量(kg/kL培養(yǎng)基)9,3111.70總脂肪酸中的DGLA的比例(％)41.842.328利用磨粉機(jī)將實(shí)施例11中獲得的干燥菌體制成粉末，在由肉末、雞肉浸膏、玉米、大米、大豆、植物油脂、維生素混合物組成的原料中，添加制成粉末的干燥菌體O.5°/。重量，制作寵物食品。獲得的寵物食品100g中含有DGLA約120mg，適合使用。使用實(shí)施例15中獲得的干燥菌體，采用與實(shí)施例16-1同樣的方法，制作寵物食品。獲得的寵物食品100g中含有DGLA約97mg，適合使用。[實(shí)施例17幼魚養(yǎng)殖用的微小生物餌料]使用實(shí)施例16-1中得到的制成粉末的干燥菌體，培養(yǎng)用作幼魚養(yǎng)殖時(shí)的佴料的輪蟲、及鹵蟲。培養(yǎng)方法為在300ml水槽內(nèi)加入海水200ml，在通氣條件下，在23。C下放養(yǎng)輪蟲每lml100個(gè)、鹵蟲每lml20個(gè)，分別供給干燥菌體使其生長(zhǎng)發(fā)育，l天lg/106個(gè)輪蟲、l天1g/105個(gè)鹵蟲。輪蟲、鹵蟲均攝取干燥菌體并生長(zhǎng)發(fā)育，成為含有DGLA的餌料。均適合作為養(yǎng)殖用餌料。對(duì)于實(shí)施例11中獲得的干燥菌體，實(shí)施己垸提取、脫膠、脫酸、脫色、脫臭等提取精制處理，制造食用精制甘油三酯。在總脂肪酸中DGLA所占的比例為45.4%。此外，未檢出己垸、重金屬類，適合作為食用油脂。[實(shí)施例18-2食用精制甘油三酯的制造2]使用實(shí)施例15中獲得的干燥菌體，采用與實(shí)施例18-1同樣的方法，制造食用精制甘油三酯。在總脂肪酸中DGLA所占的比例為42.0%。此外，未檢出己烷、重金屬類，適合作為食用油脂。將明膠(新田明膠株式會(huì)社制)和食品添加用甘油(花王株式會(huì)社制)以重量比100:35混合并加入水，在506(TC的溫度范圍溶解，制備粘度2000cp的明膠被膜。接著將實(shí)施例18-1或18-2中獲得的食用精制甘油三酯和維生素E油(衛(wèi)材(&'ssj')株式會(huì)社制)以重量比100:0.05混合，制備內(nèi)容物。使用上述物質(zhì)，根據(jù)常法進(jìn)行膠囊成型及干燥，制造每1粒含有180mg內(nèi)容物的軟膠囊。該軟膠囊均適合口服攝取。將實(shí)施例18-1中獲得的食用精制甘油三酯和大豆卵磷脂(Tsuji制油株式會(huì)社)以重量比9:1混合，在水中均勻分散獲得微脂粒分散液。通過在橙汁、汽水、咖啡飲料、牛奶、豆奶、或濃湯飲料中分別添加1/100容量的該微脂粒分散液，制備(制造)作為本發(fā)明涉及的食品的上述各飲料。這些飲料均適合口服攝取。權(quán)利要求1.多不飽和脂肪酸PUFA或含有其的脂質(zhì)的制造方法，其為在培養(yǎng)具有花生四烯酸ARA及/或二高-γ-亞麻酸DGLA生產(chǎn)能力的微生物的同時(shí)，制造多不飽和脂肪酸PUFA及含有其的脂質(zhì)的方法，包括以下(a)～(c)工序中的1個(gè)以上(a)在主培養(yǎng)開始后，在培養(yǎng)基中添加有機(jī)酸0.01～5w/v％的工序；(b)在主培養(yǎng)開始后，控制培養(yǎng)基的pH使其在培養(yǎng)有效范圍內(nèi)提高的工序；及(c)在主培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加金屬離子的硫酸鹽0.01～0.5w/w％的工序。2.如權(quán)利要求1所述的制造方法，其中包括工序(a)及工序(b)，工序(a)及工序(b)在與向培養(yǎng)基中添加碳源不同的時(shí)間進(jìn)行。3.如權(quán)利要求1或2所述的制造方法，其中包括工序(c)，工序(c)在主培養(yǎng)開始前進(jìn)行。4.如權(quán)利要求13中任一項(xiàng)所述的制造方法，其中，在所述多不飽和脂肪酸PUFA或含有其的脂質(zhì)中所述總脂肪酸中的二高-Y-亞麻酸DGLA為35%以上。5.高山被孢霉的干燥菌體，其中，每lg干燥菌體中的二高-Y-亞麻酸DGLA為190mg以上。6.如權(quán)利要求5所述的干燥菌體，其為將利用包括以下(a)(c)工序中的1個(gè)以上工序的方法，在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)后的高山被孢霉菌體進(jìn)一步供給干燥工序所得到的千燥菌體，所述(a)(c)工序?yàn)?a)在主培養(yǎng)開始后的第3天之后，在培養(yǎng)基中添加選自琥珀酸、富馬酸、丙酮酸、乳酸及蘋果酸中的1種以上的有機(jī)酸0.25w/v。/。的工序；(b)在主培養(yǎng)開始后的第3天之后，控制培養(yǎng)基的pH使其在pH6.67.5的范圍內(nèi)提高的工序；及(c)在主培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，添加0.010.25w/w。/。的選自MgS04、CaS04、Na2S0"K2S04、FeS04、及MnS04等中的1個(gè)以上的工序。7.飲食品，其含有權(quán)利要求5或6中所述的干燥菌體或來自該干燥菌體的花生四烯酸ARA及/或二高-Y-亞麻酸DGLA。全文摘要提供多不飽和脂肪酸(PUFA)及含有其的脂質(zhì)的制造方法、含有PUFA的微生物菌體及所述微生物菌體的利用方法。提供PUFA或含有其的脂質(zhì)的制造方法，其為在培養(yǎng)具有花生四烯酸(ARA)及/或二高-γ-亞麻酸(DGLA)生產(chǎn)能力的微生物的同時(shí)制造多不飽和脂肪酸(PUFA)及含有其的脂質(zhì)的方法，包括以下(a)～(c)工序中的1個(gè)以上，(a)在主培養(yǎng)開始后，在培養(yǎng)基中添加有機(jī)酸0.01～5w/v％的工序；(b)在主培養(yǎng)開始后，控制培養(yǎng)基的pH使其在培養(yǎng)有效范圍內(nèi)提高的工序；及(c)在主培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加金屬離子的硫酸鹽0.01～0.5w/w％的工序。文檔編號(hào)C12P7/64GK101631870SQ200880002270公開日2010年1月20日申請(qǐng)日期2008年1月15日優(yōu)先權(quán)日2007年1月15日發(fā)明者河島洋,片野健治申請(qǐng)人:三得利控股株式會(huì)社