專利名稱：含有其pKa值有利于RNA遞送的脂質(zhì)的脂質(zhì)體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于免疫的RNA非病毒遞送領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
用于免疫動(dòng)物的核酸遞送已成為數(shù)年來(lái)的目標(biāo)。人們已經(jīng)測(cè)試了許多方法，包括使用DNA或RNA，使用病毒或非病毒遞送載劑(或者甚至無(wú)遞送載劑，以“裸”疫苗形式)，使用復(fù)制型或非復(fù)制型載體，或者使用病毒或非病毒載體。核酸疫苗仍需改進(jìn)和改良。

發(fā)明內(nèi)容
如本發(fā)明所述，以脂質(zhì)體遞送編碼免疫原的RNA用來(lái)免疫。所述脂質(zhì)體包含pKa在5.0 7.6范圍內(nèi)的脂質(zhì)。pKa在該范圍內(nèi)的脂質(zhì)理想上具有叔胺；此類脂質(zhì)和具有季胺基團(tuán)的脂質(zhì)(如DOTAP或DC-Chol)性質(zhì)不同。在生理pH下，pKa在5.0 7.6范圍內(nèi)的胺具有中性或減少的表面電荷，而脂質(zhì)如DOTAP則是強(qiáng)陽(yáng)離子脂質(zhì)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，由季胺脂質(zhì)(如D0TAP)形成的脂質(zhì)體不如由叔胺脂質(zhì)(如DLinDMA)形成的脂質(zhì)體適合遞送編碼免疫原的RNA。因此，本發(fā)明提供具有包封水性核心的脂質(zhì)雙分子層的脂質(zhì)體，其中:(i)所述脂質(zhì)雙分子層包含PKa在5.0 7.6范圍內(nèi)的脂質(zhì)，優(yōu)選所述脂質(zhì)具有叔胺；以及(ii)所述水性核心包括編碼免疫原的RNA。這些脂質(zhì)體適用于體內(nèi)遞送RNA至脊椎動(dòng)物細(xì)胞，從而它們可用作藥物組合物中的成分用來(lái)免疫對(duì)象抵抗各種疾病。本發(fā)明也提供了一種制備包含RNA的脂質(zhì)體的方法，所述方法包括以下步驟:(a)在低于脂質(zhì)的PKa但高于4.5的pH下，混合RNA和所述脂質(zhì)以形成包封所述RNA的脂質(zhì)體；以及(b)提高所得包含脂質(zhì)體的混合物的pH，使其高于所述脂質(zhì)的pKa。脂質(zhì)體本發(fā)明應(yīng)用其中包封有編碼免疫原的RNA的脂質(zhì)體。因而，使RNA (如天然病毒內(nèi)一樣)由脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙分子層與任何外部介質(zhì)分隔，而且發(fā)現(xiàn)以該途徑進(jìn)行包封可保護(hù)RNA不被RNA酶消化。所述脂質(zhì)體可包括一些處在外部RNA(如在脂質(zhì)體的表面上)，但是至少一半的RNA(理想上為全部)被包封在所述脂質(zhì)體的核心中。脂質(zhì)體內(nèi)的包封不同于例如參考文獻(xiàn)I中公開(kāi)的脂質(zhì)/RNA復(fù)合物。在水性環(huán)境中，各種兩親性脂質(zhì)能形成雙分子層以包封含RNA的水性核心，形成脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)可具有陰離子、陽(yáng)離子或兩性離子親水性頭部基團(tuán)。本發(fā)明的脂質(zhì)體包含pKa在5.0 7.6范圍內(nèi)的脂質(zhì)，并優(yōu)選pKa在該范圍內(nèi)的脂質(zhì)具有叔胺。例如，其可包含1，2~ 二亞油基氧基_N, N- 二甲基_3-氣基丙燒(DLinDMA ；pKa5.8)和/或1，2- 二亞麻基氧基_N, N-二甲基-3-氨基丙燒(DLenDMA)。另一種合適的具有叔胺的脂質(zhì)是1，2-二油烯基氧基-N，N 二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)。參見(jiàn)圖3和參考文獻(xiàn)2。也可使用參考文獻(xiàn)3中的某些氨基酸脂質(zhì)，也可使用參考文獻(xiàn)4的某些氨基脂質(zhì)。參考文獻(xiàn)5公開(kāi)了在其頭部基團(tuán)內(nèi)具有叔胺的其它可用脂質(zhì)，其完整內(nèi)容通過(guò)引用納入本文中。本發(fā)明的脂質(zhì)體可由單一脂質(zhì)或脂質(zhì)混合物形成，條件是所述脂質(zhì)中的至少一種的pKa在5.0 7.6范圍內(nèi)(并且優(yōu)選具有叔胺)。在該pKa范圍內(nèi)，優(yōu)選脂質(zhì)的pKa是5.5 6.7，例如在5.6和6.8之間，在5.6和6.3之間，在5.6和6.0之間，在5.5和6.2之間，或在5.7和5.9之間。所述pKa是50%的脂質(zhì)帶電時(shí)的pH，位于脂質(zhì)完全帶電的點(diǎn)和脂質(zhì)完全不帶電的點(diǎn)的中間。可以用各種方法測(cè)量所述pKa，但優(yōu)選使用下述在標(biāo)題為“pKa測(cè)量”部分中公開(kāi)的方法測(cè)量。通常應(yīng)測(cè)量單一脂質(zhì)的pKa，而不是測(cè)量還包括其它脂質(zhì)的混合物中的脂質(zhì)的PKa (例如，不像參考文獻(xiàn)6中實(shí)施的那樣，該方法評(píng)判SNALP的pKa而不是單一脂質(zhì)的pKa)。當(dāng)本發(fā)明的脂質(zhì)體由脂質(zhì)混合物形成時(shí)，優(yōu)選pKa在所需范圍內(nèi)的那些脂質(zhì)的比例是脂質(zhì)總量的20 80%,例如，在30 70%之間，或在40 60%之間。舉例來(lái)說(shuō)，在如下所示的可用脂質(zhì)體中，總 脂質(zhì)的40%或60%是pKa在所需范圍內(nèi)的脂質(zhì)。剩余部分可由例如膽固醇(例如35 50%膽固醇)和/或DMG (可選PEG化修飾的DMG)和/或DSPC構(gòu)成。此類混合物用于下文。這些％值是摩爾百分比。脂質(zhì)體可包含兩親性脂質(zhì)，其親水部分是被PEG化修飾的(即，通過(guò)與聚乙二醇共價(jià)連接來(lái)修飾的)。該修飾可增加所述脂質(zhì)體的穩(wěn)定性并防止所述脂質(zhì)體的非特異性吸附。舉例來(lái)說(shuō)，使用諸如參考文獻(xiàn)6和7公開(kāi)的那些技術(shù)來(lái)使脂質(zhì)結(jié)合PEG。PEG為脂質(zhì)體提供外層，所述外層可賦予有利的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性。RNA (特別是自復(fù)制RNA)的有效包封、pKa在5.0 7.6范圍內(nèi)的陽(yáng)離子脂質(zhì)、以及PEG化修飾的表面，這三者的結(jié)合可實(shí)現(xiàn)對(duì)于多種細(xì)胞類型的有效遞送(包括免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞)，從而與使用未PEG化修飾的季胺相比，引起更強(qiáng)且更好的免疫應(yīng)答。可使用不同長(zhǎng)度的PEG，例如，在0.5 SkDa之間。用于本發(fā)明的脂質(zhì)可以是飽和的或不飽和的脂質(zhì)。優(yōu)選使用至少一種不飽和脂質(zhì)來(lái)制備脂質(zhì)體。圖3顯不二種可用的不飽和脂質(zhì)。若不飽和脂質(zhì)有兩條尾，則兩條尾都可以是不飽和尾，或者可以有一條飽和尾和一條不飽和尾。實(shí)例中使用DSPC、DLinDMA, PEG-DMG和膽固醇的混合物。本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立方面是含DSPC、DLinDMA、PEG-DMG和膽固醇的脂質(zhì)體。該脂質(zhì)體優(yōu)選包封RNA，如自復(fù)制RNA，例如編碼免疫原的自復(fù)制RNA。脂質(zhì)體顆粒通常分為3組:多層囊泡(MLV);小單層囊泡(SUV);和大單層囊泡(LUV)。MLV的各囊泡中具有多個(gè)雙分子層，形成若干分離的水性隔室。SUV和LUV具有包封水性核心的單一雙分子層；通常SUV的直徑彡50nm，LUV的直徑>50nm。本發(fā)明的脂質(zhì)體顆粒理想上是直徑在50 220nm范圍內(nèi)的LUV。對(duì)于包含不同直徑LUV的群體的組合物:(i)在數(shù)量上至少80%應(yīng)具有20 220nm范圍內(nèi)的直徑，(ii)所述群體的平均直徑(Zav，由強(qiáng)度表示)理想上在40 200nm范圍內(nèi)，和/或(iii)所述直徑的多分散性指數(shù)應(yīng)〈0.2。希望參考文獻(xiàn)I的脂質(zhì)體/RNA復(fù)合物的直徑在600 800nm范圍內(nèi)，且具有高多分散性。所述脂質(zhì)體大體上可以是球形的。用于制備合適的脂質(zhì)體的技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的，例如參見(jiàn)參考文獻(xiàn)8 10。參考文獻(xiàn)11描述了一種可用的方法，該方法涉及混合α)脂質(zhì)的乙醇溶液(ii)核酸的水性溶液和(iii)緩沖液，然后進(jìn)行混合、平衡、稀釋和純化。優(yōu)選本發(fā)明的脂質(zhì)體可通過(guò)該混合工藝獲得。混合工藝如上所述，本發(fā)明提供用于制備包含RNA的脂質(zhì)體的工藝，所述工藝包括以下步驟:(a)在低于脂質(zhì)的pKa但高于4.5的pH下混合RNA和所述脂質(zhì)；然后(b)提高pH，使其聞?dòng)谒鲋|(zhì)的pKa。因此，陽(yáng)離子脂質(zhì)在步驟(a)的脂質(zhì)體形成過(guò)程中帶正電，但之后的pH變化意味著所述正電基團(tuán)的大多數(shù)(或全部)變?yōu)橹行?。該工藝有利于制備本發(fā)明的脂質(zhì)體，并且通過(guò)在步驟(a)過(guò)程中避免pH低于4.5，提高了被包封RNA的穩(wěn)定性。步驟(a)中的pH高于4.5，理想上高于4.8。采用在5.0 6.0范圍內(nèi)，或在5.0 5.5范圍內(nèi)的pH，能夠提供合適的脂質(zhì)體。在步驟(b)中提高pH，使其高于所述脂質(zhì)的pKa。理想上提高所述pH至低于9，優(yōu)選低于8。取決于所述脂質(zhì)的pKa，步驟(b)中的所述pH由此可提高到6 8的范圍內(nèi)，例如提高至pH6.5±0.3。可通過(guò)將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移到合適的緩沖液來(lái)實(shí)現(xiàn)步驟(b)的pH提高，例如，轉(zhuǎn)移到磷酸鹽緩沖鹽水中。理想上在脂質(zhì)體形成發(fā)生后實(shí)行步驟(b)的pH提高。步驟(a)中所用的RNA可在水性溶液中，用于與脂質(zhì)的有機(jī)溶液混合(例如，乙醇溶液，如參考文獻(xiàn)11所述)。然后可稀釋所述混合物來(lái)形成脂質(zhì)體，這之后可在步驟(b)中提聞pH。RNA本發(fā)明可用 于體內(nèi)遞送編碼免疫原的RNA。所述RNA由位于遞送部位的非免疫細(xì)胞翻譯，引起所述免疫原的表達(dá)，并且還會(huì)引起免疫細(xì)胞分泌產(chǎn)生局部佐劑效應(yīng)的促炎細(xì)胞因子和/或I型干擾素。非免疫細(xì)胞響應(yīng)所述RNA時(shí)也能分泌I型干擾素和/或促炎細(xì)胞因子。所述RNA是正鏈RNA，因此可被非免疫細(xì)胞翻譯，而不需要介入任何復(fù)制步驟(例如反轉(zhuǎn)錄)。所述RNA還能結(jié)合由免疫細(xì)胞表達(dá)的TLR7受體，從而引發(fā)佐劑效應(yīng)。優(yōu)選正鏈RNA是自復(fù)制RNA。自復(fù)制RNA分子(復(fù)制子)在被遞送到脊椎動(dòng)物細(xì)胞(甚至無(wú)任何蛋白質(zhì))時(shí)，能通過(guò)從其自身轉(zhuǎn)錄(通過(guò)從其自身產(chǎn)生自身的反義拷貝)引起多條子代RNA的產(chǎn)生。因此，自復(fù)制RNA分子通常是正鏈分子，其可在遞送到細(xì)胞后被直接翻譯，而該翻譯提供RNA依賴性RNA聚合酶，之后，該RNA聚合酶從所述遞送的RNA生成反義和正義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。因此，遞送的RNA引起多條子代RNA的產(chǎn)生。這些子代RNA和亞基因組共線性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都能翻譯其自身來(lái)提供所編碼免疫原的原位表達(dá)，或者可經(jīng)轉(zhuǎn)錄來(lái)提供與遞送的RNA同義的其它轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，該同義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)過(guò)翻譯來(lái)提供所述免疫原的原位表達(dá)。該順序轉(zhuǎn)錄的總體結(jié)果是所引入的復(fù)制子RNA在數(shù)量上的巨大擴(kuò)增，并且其編碼的免疫原成為所述細(xì)胞的主要多肽產(chǎn)物。如下所示，RNA不需具有自復(fù)制活性來(lái)提供佐劑效應(yīng)，即便這樣可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞因子分泌。所述自復(fù)制活性特別有利于非免疫細(xì)胞實(shí)現(xiàn)所述免疫原的高水平表達(dá)。而它也會(huì)促進(jìn)所述非免疫細(xì)胞的凋亡。實(shí)現(xiàn)自復(fù)制的一種合適的系統(tǒng)是使用基于α病毒的RNA復(fù)制子。這些正鏈復(fù)制子在遞送到細(xì)胞后經(jīng)翻譯以產(chǎn)生復(fù)制酶(或復(fù)制酶-轉(zhuǎn)錄酶)。所述復(fù)制酶作為多蛋白被翻譯，其自切割以提供復(fù)制復(fù)合物，所述復(fù)制復(fù)合物產(chǎn)生所述遞送的正鏈RNA的基因組負(fù)鏈拷貝。這些負(fù)鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以轉(zhuǎn)錄其自身來(lái)進(jìn)一步產(chǎn)生所述正鏈親本RNA的拷貝，而且還產(chǎn)生編碼所述免疫原的亞基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。因此，所述亞基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯使得所述受感染細(xì)胞原位表達(dá)所述免疫原。合適的α病毒復(fù)制子可以使用來(lái)自以下病毒的復(fù)制酶:辛德畢斯病毒(sindbis virus)、塞姆利基森林病毒(semliki forest virus)、東部馬腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒等?？墒褂猛蛔兓蛞吧筒《拘蛄?，例如，在復(fù)制子中已使用VEEV的減毒TC83突變體[12]。因此，優(yōu)選的自復(fù)制RNA分子編碼⑴可從所述自復(fù)制RNA分子轉(zhuǎn)錄RNA的RNA依賴性RNA聚合酶和(ii)免疫原。所述聚合酶可以是α病毒復(fù)制酶，例如包含一種或多種α病毒蛋白nsPl、nsP2、nsP3和nsP4的α病毒復(fù)制酶。盡管除了所述非結(jié)構(gòu)復(fù)制酶多蛋白，天然α病毒基因組還編碼結(jié)構(gòu)病毒體蛋白，但優(yōu)選本發(fā)明的自復(fù)制RNA分子不編碼α病毒結(jié)構(gòu)蛋白。因此，優(yōu)選自復(fù)制RNA可在細(xì)胞中導(dǎo)致產(chǎn)生其本身的基因組RNA拷貝，但不會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生含有RNA的病毒體。無(wú)法產(chǎn)生這些病毒體是指不像野生型α病毒，所述自復(fù)制RNA分子自身不能以感染形式永存。本發(fā)明的自復(fù)制RNA缺失野生型病毒永存所必需的α病毒結(jié)構(gòu)蛋白，并且由編碼所需免疫原的基因代替了它們的位置，因此，所述亞基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物編碼所述免疫原，而不是編碼所述α病毒病毒體結(jié)構(gòu)蛋白。因此，本發(fā)明所用的自復(fù)制RNA分子可具有兩個(gè)開(kāi)放閱讀框。第一個(gè)(5’)開(kāi)放閱讀框編碼復(fù)制酶；第二個(gè)(3’)開(kāi)放閱讀框編碼免疫原。在一些實(shí)施方式中，所述RNA可具有額外的(例如下游)開(kāi)放閱讀框，比如用來(lái)編碼其它免疫原(參見(jiàn)下文)或者編碼輔助多肽。

自復(fù)制RNA分子可具有與所述編碼的復(fù)制酶相容的5’序列。自復(fù)制RNA分子可具有不同長(zhǎng)度，但其長(zhǎng)度通常是5000 25000個(gè)核苷酸，例如8000 15000個(gè)核苷酸，或者9000 12000個(gè)核苷酸。因此，所述RNA比siRNA遞送中所見(jiàn)的長(zhǎng)。本發(fā)明所用的RNA可具有5’帽子(例如，7-甲基鳥(niǎo)苷)。該帽子結(jié)構(gòu)能增強(qiáng)RNA的體內(nèi)翻譯。本發(fā)明所用的RNA分子的5’核苷酸可具有5’三磷酸基團(tuán)。在有帽RNA中，其可通過(guò)5’-5’橋與7-甲基鳥(niǎo)苷連接。5’三磷酸能增強(qiáng)RIG-1的結(jié)合，從而增強(qiáng)佐劑效應(yīng)。RNA分子可具有3’多聚腺苷尾。該RNA分子還可在靠近其3’端處包含多腺苷聚合酶識(shí)別序列(例如AAUAAA)。本發(fā)明所用的RNA分子通常是單鏈的。單鏈RNA通常能通過(guò)與TLR7、TLR8、RNA解旋酶和/或PKR結(jié)合而引發(fā)佐劑效應(yīng)。以雙鏈形式遞送的RNA(dsRNA)能結(jié)合TLR3，而且該受體還能被dsRNA觸發(fā)，該dsRNA在單鏈RNA復(fù)制過(guò)程中或在單鏈RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)中形成。本發(fā)明所用的RNA分子能通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄(IVT)方便地制備。IVT可使用(cDNA)模板生成，并在細(xì)菌內(nèi)以質(zhì)粒形式增殖，或通過(guò)合成生成(例如通過(guò)基因合成和/或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)工程化方法)。例如，DNA依賴性RNA聚合酶(例如噬菌體T7、T3或SP6RNA聚合酶)可用于從DNA模板轉(zhuǎn)錄RNA?？砂葱枨笫褂煤线m的加帽和加多聚腺苷反應(yīng)(盡管復(fù)制子的多聚腺苷通常在DNA模板內(nèi)編碼)。這些RNA聚合酶對(duì)轉(zhuǎn)錄的5’核苷酸有著嚴(yán)格的要求，在某些實(shí)施方式中，這些要求須與所編碼復(fù)制子的要求相符，以確保IVT轉(zhuǎn)錄的RNA作為其自編碼復(fù)制酶的底物能有效地發(fā)揮功能。 如參考文獻(xiàn)13中討論的，自復(fù)制RNA可包括(除任何5’帽子結(jié)構(gòu)之外)一個(gè)或多個(gè)具有修飾核堿基的核苷酸。因此，所述RNA可包括m5C(5-甲基胞苷)、m5U(5_甲基尿苷)、m6A(N6-甲基腺苷)、s2U(2-硫代尿苷)、Um(2’-0-甲基尿苷)、mlA(l_甲基腺苷)、m2A(2-甲基腺苷)、Am(2’-O-甲基腺苷)、ms2m6A(2-甲硫基-N6-甲基腺苷)、i6A(N6-異戊烯基腺苷)、ms2i6A(2-甲硫基-N6異戊烯基腺苷)、io6A (N6-(順羥異戊烯基)腺苷)、ms2io6A(2-甲硫基_N6_(順羥異戊烯基)腺苷)、g6A(N6-甘氨?；奔柞；佘?、t6A (N6-蘇氨酰基氨甲?；佘?、ms2t6A (2-甲硫基-N6-蘇氨?；奔柞；佘?、m6t6A (N6-甲基-N6-蘇氨酰基氨甲?；佘?、hn6A (N6-羥基正纈氨?；奔柞；佘?、ms2hn6A(2-甲硫基-N6-羥基正纈氨酰基氨甲?；佘?、Ar (p) (2’ -O-核糖基腺苷(磷酸))、I (次黃嘌呤核苷)、mil (1-甲基次黃嘌呤核苷)、m’ Im(l, 2’ _0_ 二甲基次黃嘌呤核苷)、m3C(3-甲基胞苷)、Cm(2T-0-甲基胞苷)、s2C(2_硫代胞苷)、ac4C(N4_乙?；?、f5C(5_ 甲酸基胞苷，5-fonnylcytidine)、m5Cm(5, 2-0- 二甲基胞苷)、ac4Cm(N4 乙?；?T0甲基胞苷)、k2C(賴胞苷)、mlGd-甲基鳥(niǎo)苷)、m2G(N2-甲基鳥(niǎo)苷)、m7G(7-甲基鳥(niǎo)苷)、Gm(2’-0-甲基鳥(niǎo)苷)、m22G(N2，N2-二甲基鳥(niǎo)苷)、m2Gm(N2, 2’-O-二甲基鳥(niǎo)苷)、m22Gm(N2, N2, 2’ -O-三甲基鳥(niǎo)苷)、Gr (p) (2’ -O-核糖基鳥(niǎo)苷(磷酸))、yW(懷丁苷)、o2yff(過(guò)氧化懷丁苷)、OHyW(羥基懷丁苷)、OHyW*(欠修飾的羥基懷丁苷)、imG(丫苷)、mimG(甲基鳥(niǎo)苷)、Q (queuosine,辮苷)、oQ (環(huán)氧辮苷)、galQ(半乳糖-辮苷)、manQ (甘露糖-辮苷)>preQo (7-氰基-7-去氮鳥(niǎo)苷)、preQi (7-氨甲基-7-去氮鳥(niǎo)苷)、G (古嘌苷)、D (二氫尿苷)、m5Um(5，2’ _0_ 二甲基尿苷)、s4U(4_硫代尿苷)、m5s2U(5-甲基_2_硫代尿苷)、s2Um (2-硫代-2 ’ -O-甲基尿苷)、acp3U (3- (3-氨基_3_羧丙基)尿苷)、ho5U (5-羥基尿苷)、mo5U (5-甲氧基尿苷)、cmo5U (尿苷5-輕乙酸)、mcmo5U (尿苷5-輕乙酸甲基酯)、chm5U (5-(羧輕甲基)尿苷))、mchm5U (5-(羧輕甲基)尿苷甲基酯)、mcm5U (5-甲氧羰基甲基尿苷)、mcm5Um (S-甲氧基羰甲基-2-0-甲基尿苷)、mcm5s2U (5-甲氧基羰甲基_2_硫代尿苷)、nm5s2U (5-氨甲基-2-硫代尿苷)、mnm5U (5-甲基氨甲基尿苷)、mnm5s2U (5-甲基氨甲基-2-硫代尿苷)、mnm5se2U (5-甲基氨甲基_2_硒尿苷)、ncm5U (5-氨基甲酰甲基尿苷)、ncm5Um(5-氨基甲酰甲基_2’ -O-甲基尿苷)、cmnm5U(5-羧甲基氨甲基尿苷)、cnmm5Um(5-羧甲基氨甲基-2-L-0甲基尿苷)、cmnm5s2U(5-羧甲基氨甲基_2_硫代尿苷)、m62A(N6，N6-二甲基腺苷)、Tm(2’-0-甲基次黃嘌呤核苷)、m4C(N4-甲基胞苷)、m4Cm (N4, 2-0- 二甲基胞苷)、hm5C (5-羥甲基胞苷)、m3U (3-甲基尿苷)、cm5U (5-羧甲基尿苷)、m6Am(N6, T-O- 二甲基腺苷)、rn62Am(N6, N6, 0_2_ 三甲基腺苷)、m2，7G (N2, 7- 二甲基鳥(niǎo)苷)、m2’ 2’ 7G(N2, N2, 7-三甲基鳥(niǎo)苷)、m3Um(3，2T-0- 二甲基尿苷),m5D(5-甲基二氫尿苷)、f5Cm(5-甲?；?2’ -O-甲基胞苷)、mlGm(l, 2’ -O-二甲基鳥(niǎo)苷)、m’Am(l, 2_0_ 二甲基腺苷)益立諾甲基尿苷(irinomethyluridine))、tm5s2U(S-氨基乙磺?；谆?2-硫代尿苷))、imG-14(4-去甲基鳥(niǎo)苷)、imG2(異鳥(niǎo)苷)、或ac6A(N6-乙?；佘?、次黃嘌呤、次黃嘌呤核苷、8-氧代-腺嘌呤，及其7-取代衍生物、二氫尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5- (C1-C6)-烷基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5- (C2-C6)-烯基尿嘧啶、5- (C2-C6)-炔基尿嘧啶、5-(羥甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥基胞嘧啶、5- (C1-C6)-烷基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5- (C2-C6)-烯基胞嘧啶、5- (C2-C6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N2- 二甲基鳥(niǎo)嘌呤、7-去氮鳥(niǎo)嘌呤、8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤、7-去氮-7-取代鳥(niǎo)嘌呤、7-去氮-7-(C2-C6)炔基鳥(niǎo)嘌呤、7-去氮-8-取代鳥(niǎo)嘌呤、8-羥基鳥(niǎo)嘌呤、6-硫代鳥(niǎo)嘌呤、8-氧代鳥(niǎo)嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，4-二氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、8-氮雜嘌呤、取代的7-去氮嘌呤、7-去氮-7-取代嘌呤、7-去氮-8-取代嘌呤、或者脫堿基核苷酸。例如，自復(fù)制RNA可包含一個(gè)或多個(gè)修飾的嘧啶核堿基，比如假尿苷和/或5-甲基胞嘧啶殘基。然而，在一些實(shí)施方式中，RNA不包含修飾的核堿基，并且可以不包含修飾的核苷酸，即，RNA中的所有核苷酸都是標(biāo)準(zhǔn)的A、C、G和U核糖核苷酸(除可含有7'甲基鳥(niǎo)苷的任何5’帽子結(jié)構(gòu)外)。在其它實(shí)施方式中，RNA可包含含有7’ -甲基鳥(niǎo)苷的5’帽子，且最前的1、2或3個(gè)5’端核糖核苷酸可在核糖的2’位點(diǎn)被甲基化。本發(fā)明所用的RNA理想上在核苷之間僅包含磷酸二酯鍵，但在某些實(shí)施方式中，其可包含氨基磷酸酯鍵、硫代磷酸酯鍵和/或甲基磷酸酯鍵。理想上，脂質(zhì)體包含少于10個(gè)不同的RNA種類，例如5、4、3或2個(gè)不同種類；最優(yōu)選脂質(zhì)體包含單個(gè)RNA·種類，即，脂質(zhì)體中的所有RNA分子具有相同的序列和相同的長(zhǎng)度。每個(gè)脂質(zhì)體的RNA含量可以不同。每個(gè)脂質(zhì)體的自復(fù)制RNA分子個(gè)體的數(shù)量通常(50個(gè)，例如每個(gè)脂質(zhì)體〈20個(gè)、〈10個(gè)、〈5個(gè)或者I 4個(gè)。免疫原本發(fā)明所用的RNA分子編碼多肽免疫原。在脂質(zhì)體給藥后，所述RNA在體內(nèi)翻譯，所述免疫原可在受者內(nèi)引起免疫應(yīng)答。所述免疫原可引起免疫應(yīng)答來(lái)對(duì)抗細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲(chóng)(或者，在一些實(shí)施方式中，對(duì)抗過(guò)敏原；在其它實(shí)施方式中，對(duì)抗腫瘤抗原)。所述免疫應(yīng)答可包括抗體應(yīng)答(通常包含IgG)和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。所述多肽免疫原通常會(huì)引起識(shí)別對(duì)應(yīng)細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲(chóng)(或過(guò)敏原或腫瘤)多肽的免疫應(yīng)答，但在一些實(shí)施方式中，所述多肽可作為模擬表位(mimotope)來(lái)引起識(shí)別細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲(chóng)糖類的免疫應(yīng)答。所述免疫原通常會(huì)是表面多肽，例如:粘附素、血細(xì)胞凝集素、包膜糖蛋白、刺突糖蛋白等。自復(fù)制RNA分子能編碼單一多肽免疫原或多種多肽。多種免疫原可以單一的多肽免疫原(融合多肽)或以分開(kāi)的多種多肽形式存在。若表達(dá)的免疫原是分開(kāi)的多種多肽，則這些多肽中的一個(gè)或多個(gè)可與上游IRES或其它病毒啟動(dòng)子元件一起提供?；蛘?，多種免疫原可由多蛋白表達(dá)，所述多蛋白編碼融合于短自催化蛋白酶(例如足口病病毒2A蛋白)的單一免疫原或作為內(nèi)含肽。與參考文獻(xiàn)I和14不同,所述RNA編碼免疫原。為避免疑慮,本發(fā)明不包含編碼螢火蟲(chóng)熒光素酶的RNA或編碼大腸桿菌(E.coli) β-半乳糖苷酶融合蛋白的RNA或者編碼綠色熒光蛋白(GFP)的RNA。并且，所述RNA不是小鼠胸腺總RNA。在一些實(shí)施方式中，所述免疫原引起的免疫應(yīng)答對(duì)抗以下這些細(xì)菌中的一種:腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis):可用免疫原包括但不限于,膜蛋白如粘附素、自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、毒素、獲鐵蛋白和因子H結(jié)合蛋白。參考文獻(xiàn)15中公開(kāi)了三種可用多肽的組合。
肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae):參考文獻(xiàn)16中公開(kāi)了可用的多肽免疫原。這些多肽免疫原包括但不限于RrgB菌毛亞基、β-N-乙?；?己糖胺酶前體(spr0057)、spr0096、全身應(yīng)激蛋白GSP-781 (spr2021，SP2216)、絲氨酸/蘇氨酸激酶StkP(SP1732)和肺炎球菌表面粘附素PsaA。產(chǎn)膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes):可用免疫原包括但不限于參考文獻(xiàn)17和18中公開(kāi)的多肽。粘膜炎莫拉菌(Moraxellacatarrhal is) 百日咳博德特菌(Bordetella pertussis):可用的百日咳免疫原包括但不限于百日咳毒素或類毒素(PT)、絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)、百日咳桿菌粘附素、凝集原2和3。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus):可用的免疫原包括但不限于參考文獻(xiàn)19中公開(kāi)的多肽，例如溶血素、esxA、esxB、鐵色素結(jié)合蛋白(sta006)和/或staOll脂蛋白。破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani):典型的免疫原是破傷風(fēng)類毒素。白喉?xiàng)U菌(Cornynebacterium diphtheriae):典型的免疫原是白喉類毒素。流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae):可用免疫原包括但不限于參考文獻(xiàn)20和21中公開(kāi)的多肽。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)無(wú)乳鏈球 菌(Streptococcus agalactiae):可用免疫原包括但不限于參考文獻(xiàn)17中公開(kāi)的多肽。沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis):可用免疫原包括但不限于PepA、LcrE、ArtJ、DnaK, CT398、OmpH 樣蛋白(OmpH-1ike)、L7/L12、OmcA, AtoS、CT547、Eno, HtrA 和MurG(例如，如參考文獻(xiàn)22中公開(kāi)的多肽)。LcrE[23]和HtrA[24]是兩種優(yōu)選的免疫原。肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae):可用的免疫原包括但不限于參考文獻(xiàn)25中公開(kāi)的多肽。幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori):可用的免疫原包括但不限于CagA、VacA、NAP、和/或尿素酶[26]。大腸桿菌(Escherichia coli):可用的免疫原包括但不限于源自以下大腸桿菌的免疫原:腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)、腸聚集性大腸桿菌(EAggEC)、彌散粘附性大腸桿菌(DAEC)、腸致病性大腸桿菌(EPEC)、腸外致病性大腸桿菌(ExPEC)和/或腸出血性大腸桿菌(EHEC)。ExPEC菌株包括尿致病性大腸桿菌(UPEC)和腦膜炎/膿毒癥相關(guān)的大腸桿菌(MNEC)。參考文獻(xiàn)27和28公開(kāi)了可用的UPEC多肽免疫原。參考文獻(xiàn)29中公開(kāi)了所用的MNEC免疫原。一種可用于若干大腸桿菌類型的免疫原是AcfD [30].
炭疽桿菌(Bacillusanthracis)鼠疫桿菌(Yersinia pestis):可用的免疫原包括但不限于參考文獻(xiàn)31和32中公開(kāi)的那些免疫原。表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermis):產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)或肉毒桿菌(Clostridiumbotulinums)嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)
貝氏柯克斯體(Coxiellaburnetti)布魯氏菌(Brucella)，例如，牛型布魯氏菌(B.abortus)、犬型布魯氏菌(B.canis)、羊型布魯氏菌(B.melitensis)、沙林鼠型布魯氏菌(B.neotomae)、綿羊型布魯氏菌(B.0vis)、豬型布魯氏菌(B.suis)、鰭腳類布魯氏菌(B.pinnipediae).
弗朗西斯氏菌(Francisella)，例如新殺手弗朗西斯氏菌(F.novicida)、蜃樓弗朗西斯氏菌(F.philomiragia)、土拉熱弗朗西斯氏菌(F.tularensis)。淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)梅毒螺旋菌(Treponemapallidum)杜克氏嗜血桿菌(Haemophilus ducreyi)類腸球菌(Enterococcusfaecalis)或屎腸球菌(Enterococcus faecium)腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)
小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)立克次體(Rickettsia)單核細(xì)胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)霍亂弧菌(Vibriocholerae)傷寒沙門(mén)菌(Salmonellatyphi)包柔氏螺旋體菌(Borreliaburgdorferi)牙銀P卜啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)克雷伯氏菌(Klebsiella)在一些實(shí)施方式中，所述免疫原引起的免疫應(yīng)答對(duì)抗以下這些病毒中的一種:正粘病毒(Orthomyxovirus):可用免疫原可來(lái)自甲型、乙型或丙型流感病毒，例如血細(xì)胞凝集素、神經(jīng)氨酸苷酶或基質(zhì)M2蛋白。當(dāng)所述免疫原是甲型流感病毒血細(xì)胞凝集素時(shí)，其可來(lái)自任何亞型，例如111、!12、!13、!14、!15、!16、!17、!18、!19、!110、!111、!112、!113、!114、H15 或 H16。副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒:病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:肺炎病毒(例如，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)、腮腺炎病毒屬(例如，腮腺炎病毒)、副粘病毒(例如，副流感病毒)、肺炎后病毒和麻疹病毒(例如，麻疹)。痘病毒(Poxviridae):病毒免疫原包括但不限于衍生自正痘病毒(Orthopoxvirus)如天花(Variola vera)的免疫原，包括但不限于重型天花(Variolamajor)和輕型天花(Variola minor)。小核糖核酸病毒(Picornavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:小核糖核酸病毒，如腸道病毒、鼻病毒、嗜肝RNA病毒、心臟病毒和口蹄疫病毒的那些免疫原。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述腸道病毒是脊髓灰質(zhì)炎病毒，例如I型、2型和/或3型脊髓灰質(zhì)炎病毒。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述腸道病毒是EV71腸道病毒。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述腸道病毒是A型或B型柯薩奇(coxsackie)病毒。布尼亞病毒(Bunyavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:正布尼亞病毒(Orthobunyavirus)如加利福尼亞腦炎病毒、白蛉病毒(Phlebovirus)如裂谷熱病毒或內(nèi)羅病毒(Nairovirus)如克里米亞-剛果出血熱病毒。嗜肝RNA病毒(Heparnavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自嗜肝RNA病毒如甲型肝炎病毒(HAV)的免疫原。線狀病毒(Filovirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:線狀病毒，例如埃博拉病毒屬(Ebola virus)(包括扎伊爾(Zaire)埃博拉病毒、象牙海岸(Ivory Coast)埃博拉病毒、雷斯頓(Reston)或蘇丹(Sudan)埃博拉病毒)或者馬爾堡病毒(Marburg virus)。披膜病毒(Togavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:披膜病毒(Togavirus),如風(fēng)疫病毒(Rubivirus)、α病毒(Alphavirus)或動(dòng)脈炎病毒屬(Arterivirus)。該病毒包括風(fēng)疫病毒(rubella virus)。黃病毒(Flavivirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:黃病毒，如蜱傳腦炎(TBE)病毒、登革熱(1、2、3或4型)病毒、黃熱病毒、日本腦炎病毒、開(kāi)薩諾森林病毒、西尼羅河腦炎病毒、圣路易斯腦炎病毒、俄國(guó)春夏腦炎病毒、波瓦生腦炎病毒。瘟病毒(Pestivirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自瘟病毒，如牛病毒性腹瀉(BVDV)、經(jīng)典豬瘟(CSFV)或邊界病(BDV)的那些免疫原。嗜肝DNA病毒(Hepadnavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自嗜肝DNA病毒如乙型肝炎病毒的那些免疫原。組合物可包括乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。其它肝炎病毒:組合物可包括衍生自丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒或庚型肝炎病毒的免疫原。桿狀病毒(R habdovirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自桿狀病毒如狂犬病病毒屬(例如狂犬病毒)和水泡病毒(VSV)的那些免疫原。杯狀病毒(Caliciviridae):病毒免疫原包括但不限于衍生自杯狀病毒,如諾沃克病毒(Norwalk virus)(諾如病毒(Norovirus))和諾沃克樣病毒，如夏威夷病毒(HawaiiVirus)和雪山病毒(Snow Mountain Virus)的那些免疫原。冠狀病毒(Coronavirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自SARS冠狀病毒、禽傳染性支氣管炎(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)和豬傳染性腸胃炎病毒(TGEV)的那些免疫原。所述冠狀病毒免疫原可以是刺突多肽。逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自腫瘤病毒(Oncovirus)、慢病毒(Lentivirus)(例如 HIV-1 或 HIV-2)或者泡沫病毒(Spumavirus)的那些免疫原。呼腸病毒(Reovirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自正呼腸孤病毒屬(Orthoreovirus)、輪狀病毒(rotavirus)、環(huán)狀病毒(Orbivirus)、或科羅拉多壁風(fēng)熱病毒(Coltivirus)的那些免疫原。細(xì)小病毒(Parvovirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自細(xì)小病毒B19的那些免疫原。皰疫病毒(Herpesvirus):病毒免疫原包括但不限于衍生自以下病毒的那些免疫原:人皰疹病毒，如(僅為示例)單純皰疹病毒(HSV)(例如HSVl型和2型)、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、艾伯斯坦-巴爾病毒(EBV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、人皰疹病毒6 (HHV6)、人皰疹病毒7 (HHV7)和人皰疹病毒8 (HHV8)。乳頭狀多瘤空泡病毒(Papovaviruses):病毒免疫原包括但不限于衍生自乳頭狀瘤病毒(Papillomaviruses)和多瘤病毒(Polyomaviruses)的那些免疫原。人乳頭狀瘤病毒可以是血清型 1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63 或 65，例如來(lái)自血清型6、11、16和/或18中的一種或多種。腺病毒(Adenovirus):病毒免疫原包括衍生自腺病毒血清型36 (Ad_36)的那些免疫原。在一些實(shí)施方式中，所述免疫原引起的免疫應(yīng)答對(duì)抗感染魚(yú)的病毒，例如:傳染性鮭魚(yú)貧血病毒(ISAV)、鮭魚(yú)胰腺病病毒(SPDV)、傳染性胰臟壞死病毒(IPNV)、水道貓魚(yú)病毒(CCV)、魚(yú)類淋巴囊腫病病毒(FLDV)、傳染性造血組織壞死病毒(IHNV)、錦鯉皰疹病毒、鮭魚(yú)小核糖核酸樣病毒(也稱作大西洋鮭魚(yú)的小核糖核酸樣病毒)、陸封鮭病毒(landlocked salmon virus，LSV)、大西洋娃魚(yú)輪狀病毒(ASR)、蹲魚(yú)草毒病病毒(TSD)、銀鮭魚(yú)腫瘤病毒(CSTV)或病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)。真菌免疫原可衍生自皮膚真菌(Dermatophytres)，包括:絮狀表皮癬菌(Epidermophyton f 1ccusum)、奧杜安氏小抱子菌(Microsporum audouini)、犬小抱子菌(Microsporum canis)、扭曲小抱子菌(Microsporum distortum)、馬類小抱子菌(Microsporum equinum)、石膏樣小抱子菌(Microsporum gypsum)、矮小小抱子菌(Microsporum nan um)、同心性毛癬菌(Trichophyton concentricum)、馬發(fā)癬菌(Trichophyton equinum)、雞毛癬菌(Trichophyton gallinae)、石膏狀毛癬菌(Trichophyton gypseum)、麥格氏毛癬菌(Trichophyton megnini)、須癬毛癬菌(Trichophyton mentagrophytes)、昆克努發(fā)癬菌(Trichophyton quinckeanum)、紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)、許蘭毛癬菌(Trichophyton schoenleini)、斷發(fā)毛癬菌(Trichophyton tonsurans)、撫狀毛癬菌(Trichophyton verrucosum)、撫狀毛癬菌的白變種(var.album)、盤(pán)狀變種(var.discoides)、赫色變種(var.0chraceum)、紫色毛癬菌(Trichophyton violaceum)和 / 或蜜塊狀發(fā)癬菌(Trichophyton faviforme);或者衍生自煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、聚多曲霉(Aspergillus sydowi)、黃曲霉(Aspergillus flavatus)、灰綠曲霉(Aspergillusglaucus)、頭狀芽裂殖菌(Blastoschizomyces capitatus)、白假絲酵母(Candidaalbicans)、烯醇酶假絲酵母(Candida enolase)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、光滑假絲酵母(Candida glabrata)、克魯斯假絲酵母(Candida krusei)、近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)、類星形假絲酵母(Candida stellatoidea)、克魯斯假絲酵母(Candida kusei)、帕拉克斯假絲酵母(Candida parakwsei)、葡萄牙假絲酵母(Candidalusitaniae)、偽熱帶假絲酵母(Candida pseudotropicalis)、季也蒙假絲酵母(Candidaguilliermondi)、卡氏枝抱霉(Cladosporium carrionii)、粗球抱子菌(Coccidioidesimmitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)、棒地霉(Geotrichum cIavatum)Λ 莢膜組織胞衆(zhòng)菌(Histoplasmacapsulatum)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、微抱子蟲(chóng)(Microsporidia)、腦炎微孢子蟲(chóng)屬(Encephalitozoon spp)、表層角結(jié)膜炎微孢子蟲(chóng)(Septata intestinalis)和腸微孢子蟲(chóng)(Enterocytozoon bieneusi);較不常見(jiàn)的是:短粒蟲(chóng)屬(Brachiola spp.)、微抱子蟲(chóng)屬(Microsporidium spp.)、抱子蟲(chóng)屬(Nosema spp.)、皮里蟲(chóng)屬(Pleistophoraspp)、氣管普抱蟲(chóng)屬(Trachipleistophora spp.)、條抱蟲(chóng)屬(Vittaforma spp.)、巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)、卡氏月市抱子蟲(chóng)(Pneumocystis carinii)、苜猜腐酶(Pythiumn insidiosum)、卵狀糖疫癬菌(Pityrosporum ovale)、釀酒酵母(Sacharomycescerevisae)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、粟酒酵母(Saccharomyces pombe)、尖端賽多抱子菌(Scedosporium apiosperum)、申克抱子絲菌(Sporothrix schenckii)、白吉利絲孢酵母(Trichosporon beigelii)、弓形蟲(chóng)(Toxoplasma gondii)、馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)、馬拉色菌(Malassezia spp.)、著色真菌屬(Fonsecaea spp.)、王氏霉菌屬(Wangiella spp.)、孢子絲菌屬(Sporothrix spp.)、娃糞霉屬(Basidiobolusspp.)、耳霉屬(Conidiobolus spp.)、根霉屬(Rhizopus spp.)、毛霉屬(Mucor spp.)、犁頭霉屬(Absidia spp.)、被抱霉屬(Mortierella spp.)、小克銀漢霉屬(Cunninghamellaspp.)、瓶霉屬(Saksenaea spp.)、鏈格抱菌屬(Alternaria spp.)、彎抱菌屬(Curvulariaspp.)、長(zhǎng)螺孢菌屬(Helminthosporium spp.)、鐮胞菌屬(Fusarium spp.)、曲霉屬(Aspergillus spp.)、青霉屬(Penicillium spp.)、鏈核霉菌屬(Monolinia spp.)、絲核菌屬(Rhizoctonia spp.)、擬青霉屬(Paecilomyces spp.)、皮司霉屬(Pithomyces spp.)和枝抱霉屬(Cladosporium spp.)。在一些實(shí)施方式中，所述免疫原引起的免疫應(yīng)答對(duì)抗來(lái)自瘧原蟲(chóng)(Plasmodium)屬的寄生蟲(chóng)，例如惡性癥原蟲(chóng)(P.falciparum)、間日癥原蟲(chóng)(P.vivax)、三日癥原蟲(chóng)(P.malariae)或卵形瘧原蟲(chóng)(P.0vale)。因此，本發(fā)明可用于免疫對(duì)抗瘧疾。在一些實(shí)施方式中，所述免疫原引起的免疫應(yīng)答對(duì)抗源自魚(yú)虱科(Caligidae)家族的寄生蟲(chóng)，尤其是那些源自瘡痂魚(yú)虱屬(Lepeophtheiiois)和魚(yú)虱屬(Caligus)例如海虱如鮭瘡痂魚(yú)虱(Lepeophtheirus salmonis)或智利魚(yú)風(fēng)(Caligus rogercresseyi)的寄生蟲(chóng)。在一些實(shí)施方式中，所述免疫原引起的免疫應(yīng)答對(duì)抗以下過(guò)敏原:花粉過(guò)敏原(樹(shù)、草本和青草花粉過(guò)敏原)、昆蟲(chóng)或蜘蛛類動(dòng)物過(guò)敏原(吸入式、唾液和毒液過(guò)敏原，例如螨蟲(chóng)過(guò)敏原、蟑螂和蠓過(guò)敏原、膜翅類毒液過(guò)敏原)、動(dòng)物毛發(fā)和皮屑過(guò)敏原(來(lái)自例如狗、貓、馬、大鼠、小鼠等)；以及食物過(guò)敏原(例如麥醇溶蛋白)。來(lái)自樹(shù)、青草和草本植物的重要花粉過(guò)敏原，例如源于分類學(xué)的以下目:殼斗目(Fagales)、木樨目(Oleales)Iiv桕目(Pinales)以及懸鈴木科(platanaceae)，包括但不限于樺木(樺屬(Betula))、赤楊(棺木屬(Alnus))、榛木(榛屬(Corylus))、鵝耳櫪木(鵝耳櫪屬(Carpinus))和橄欖(齊墩果屬(Olea))、雪松(柳杉屬(Cryptomeria)和檜屬(Juniperus))、懸鈴木(懸鈴木屬(Platanus))，禾本目包括以下屬的青草:黑麥草屬(Lolium)、貓尾草屬(Phleum)、早熟禾(Poa)、狗牙根屬(Cynodon)、鴨茅屬(Dactylis)、域毛草屬(Holcus)、藹草屬(Phalaris)、黑麥屬(Secale)和蜀黍?qū)?Sorghum)，菊目(Asterales)和蕁麻目(Urticales)包括以下屬的非禾本草本植物:豚草屬(Ambrosia)、艾屬(Artemisia)和墻草屬(Parietaria)。其它重要的吸入式過(guò)敏原是來(lái)自以下這些過(guò)敏原:表皮螨屬(Dermatophagoides)和嗜霉螨屬(Euroglyphus)的屋塵螨、儲(chǔ)糧塵螨例如害嗜鱗螨(Lepidoglyphus)、食甜螨屬(Glycyphagus)和食酪螨屬(Tyrophagus)，來(lái)自蟑螂、蠓和跳蚤例如小蠊屬(Blatella)、大爐屬(Periplaneta)、搖蚊屬(Chironomus)和柿頭圣屬(Ctenocephalides)，來(lái)自哺乳動(dòng)物比如貓、狗和馬，毒液過(guò)敏原包括例如源自螫或咬型的昆蟲(chóng)，比如來(lái)自分類學(xué)的膜翅目的那些昆蟲(chóng)，包括蜜蜂(蜜蜂科，Apidae)、黃蜂(胡蜂科，Vespidea)和螞蟻(蟻科，F(xiàn)ormicidae)。在一些實(shí)施方式中，所述免疫原是腫瘤抗原，選自:(a)癌癥-睪丸抗原，如NY-ESO-1、SSX2、SCPl 以及 RAGE、BAGE、GAGE 和 MAGE 家族多肽，如 GAGE-1、GAGE_2、MAGE_1、MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5、MAGE-6和MAGE-12 (例如，可用于針對(duì)黑色素瘤、肺腫瘤、頭頸部腫瘤、NSCLC瘤、乳腺腫瘤、胃腸道腫瘤和膀胱腫瘤)；(b)突變的抗原，例如p53(與各種實(shí)體瘤如結(jié)直腸癌、肺癌、頭頸部癌有關(guān))、p21/Ras (與例如黑色素瘤、胰腺癌和結(jié)直腸癌有關(guān))、CDK4 (與例如黑色素瘤有關(guān))、MUM1 (與例如黑色素瘤有關(guān))、半胱天冬酶-8 (與例如頭頸部癌有關(guān))、CIA0205(與例如膀胱癌有關(guān))、HLA-A2-R1701、β聯(lián)蛋白(與例如黑色素瘤有關(guān))、TCR(與例如T-細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤有關(guān))、BCR-abl (與例如慢性髓細(xì)胞性白血病有關(guān))、磷酸丙糖異構(gòu)酶、KIA0205、⑶C-27和LDLR-FUT ； (c)過(guò)表達(dá)的抗原，例如半乳糖凝集素4 (與例如結(jié)直腸癌有關(guān))、半乳糖凝集素9 (與例如霍奇金病有關(guān))、蛋白酶3 (與例如慢性髓細(xì)胞性白血病有關(guān))、WT1 (與例如各種白血病有關(guān))、碳酸酐酶(與例如腎癌有關(guān))、醛縮酶A (與例如肺癌有關(guān))、PRAME (與例如黑色素瘤有關(guān))、HER-2/neu (與例如乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌和卵巢癌有關(guān))、乳腺球蛋白、甲胎蛋白(與例如肝細(xì)胞癌有關(guān))、KSA(與例如結(jié)直腸癌有關(guān))、胃泌素(與例如胰腺癌和胃癌有關(guān))、端粒酶催化蛋白、MUC-1 (與例如乳腺癌和卵巢癌有關(guān))、G-250 (與例如腎細(xì)胞癌有關(guān))、p53 (與例如乳腺癌和結(jié)腸癌有關(guān))和癌胚抗原(與例如乳腺癌、肺癌和胃腸道癌如結(jié)直腸癌有關(guān))；(d)共有的抗原，例如黑色素瘤-黑素細(xì)胞分化抗原如MART-l/Melan A、gplOO、MClR、黑素細(xì)胞-刺激激素受體、酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1/TRP1和酪氨酸酶相關(guān)蛋白_2/TRP2(與例如黑色素瘤有關(guān))；(e)前列腺相關(guān)抗原，如PAP、PSA、PSMA, PSH-PU PSM-PU PSM-P2,與例如前列腺癌有關(guān)；(f)免疫球蛋白獨(dú)特型(與例如骨髓瘤和B細(xì)胞淋巴瘤有關(guān))。在某些實(shí)施方式中，腫瘤抗原包括但不限于巾15、!10111/]1-40、!1-1^8 424- 虬、!14-1 1\16!1-161(、]^1^-狀1 、艾伯斯坦-巴爾病毒抗原、EBNA、人乳頭瘤病毒(HPV)抗原，包括E6和E7、乙肝和丙肝病毒抗原、人T細(xì)胞嗜淋巴病毒抗原、15-1801856218(-3、。1^111111-23!11、1六6-72-4、0六19-9、0六72-4、CAMl7.UNuMa, K_ras、pl6、TAGE, PSCA, CT7、43_9F、5T4、791Tgp72、β -HCG, BCA225、BTAA,CA125、CA 15-3 (CA27.29\BCAA)、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、C0-029、FGF-5、Ga733 (EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7_Ag、M0V18、NB/70K、NY-CO-1、RCASl、SDCCAG16、TA-90 (Mac-2結(jié)合蛋白\親環(huán)蛋白C相關(guān)蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS及類似物。藥物組合物本發(fā)明的脂質(zhì)體可用作藥物組合物中的組分來(lái)免疫對(duì)象對(duì)抗各種疾病。除脂質(zhì)體之外，這些組合物通常還包括藥學(xué)上可接受的載體。藥學(xué)上可接受的載體的全面討論參見(jiàn)參考文獻(xiàn)33。本發(fā)明的藥物組合物可包括一種或多種小分子免疫增強(qiáng)劑。例如，所述組合物可包括TLR2激動(dòng)劑(例如Pam3CSK4)、TLR4激動(dòng)劑(例如氨烷基氨基葡糖苷磷酸，如E6020)、TLR7激動(dòng)劑(例如咪喹莫特(imiquimod))、TLR8激動(dòng)劑(例如瑞喹莫德(resiquimod))和/或TLR9激動(dòng)劑(例如IC31)。任何所述的激動(dòng)劑理想上具有<2000Da的分子量。包封RNA時(shí),在一些實(shí)施方式中，所述激動(dòng)劑也與RNA —同包封,但在其它實(shí)施方式中，不包封所述激動(dòng)劑。RNA被顆粒吸附時(shí)，在一些實(shí)施方式中，所述激動(dòng)劑也與RNA —同被吸附，但在其它實(shí)施方式中，不吸附所述激動(dòng)劑。本發(fā)明的藥物組合物可包括處于普通水(例如w.f.1)或緩沖液中的脂質(zhì)體，所述緩沖液為例如:磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、硼酸鹽緩沖液、琥珀酸鹽緩沖液、組氨酸緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液。緩沖鹽濃度一般在5 20mM范圍內(nèi)。本發(fā)明的藥物組合物的pH可在5.0和9.5之間，如在6.0和8.0之間。本發(fā)明的組合物可含有鈉鹽(如氯化鈉)以產(chǎn)生張力。NaCl的濃度通常是IO 土 2mg/mL,例如約 9mg/mL。本發(fā)明的組合物可包含金屬離子螯合劑。這些金屬離子螯合劑可通過(guò)清除能加速磷酸二酯水解的離子來(lái)延長(zhǎng)RNA的穩(wěn)定性。因此，組合物可包含EDTA、EGTA、BAPTA、噴替酸等中的一種或多種。所述螯合劑的濃度通常在10 500 μ M之間，例如0.1mM。檸檬酸鹽，例如檸檬酸鈉，既可作為螯合劑，又提供有利的緩沖活性。本發(fā)明的藥物組合物的重量摩爾滲透壓濃度可在200m0sm/kg和400m0sm/kg之間，如在240 360m0sm/kg之間或在290 310m0sm/kg之間。本發(fā)明的藥物組合物可包含一種或多種防腐劑，例如硫柳汞或2-苯氧乙醇。優(yōu)選不含汞的組合物，且可制備不含防腐劑的疫苗。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選是無(wú)菌的組合物。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選無(wú)熱源，如含有〈1EU (內(nèi)毒素單位，標(biāo)準(zhǔn)量度)/劑量，并優(yōu)選〈0.1EU/劑量。`本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選不含谷蛋白。本發(fā)明的藥物組合物可以以單位劑量形式制備。在一些實(shí)施方式中，單位劑量的體積可在0.1 1.0mL之間，例如約0.5mL?？蓪⑺鼋M合物制備為溶液或懸浮液形式的注射劑。所述組合物可制備來(lái)用于肺部給藥，例如用細(xì)噴霧形式通過(guò)吸入器給藥。所述組合物可以制備用于鼻部、耳部或眼部給藥，例如以噴霧或滴劑形式給藥。一般將可注射形式用于肌肉內(nèi)給藥。組合物包含免疫有效量的脂質(zhì)體，以及任何其它所需的組分。本文中的術(shù)語(yǔ)“免疫有效量”是指在一次劑量或一系列劑量的一部分中給予個(gè)體的量對(duì)治療或預(yù)防有效。該量的變化取決于如下因素:待治療個(gè)體的健康和身體狀況、年齡、待治療個(gè)體的分類群(例如，非人的靈長(zhǎng)動(dòng)物、靈長(zhǎng)動(dòng)物等)、個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護(hù)程度、疫苗配方、治療醫(yī)生對(duì)醫(yī)學(xué)情況的評(píng)估和其它相關(guān)因素。預(yù)計(jì)所述量將落入可通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)測(cè)定的相對(duì)較寬范圍內(nèi)。本發(fā)明的組合物的脂質(zhì)體和RNA含量一般按每劑量RNA的量來(lái)表示。優(yōu)選劑量具有彡100 μ g的RNA(例如10 100 μ g，如約10 μ g、25 μ g、50 μ g、75 μ g或100 μ g)，但可見(jiàn)表達(dá)的水平低很多，例如< ^/劑量、< IOOng/劑量、< IOng/劑量、(Ing/劑量等。本發(fā)明還提供一種遞送裝置(例如注射器、噴霧器、噴灑器、吸入器、透皮貼片等)，所述遞送裝置包含本發(fā)明的藥物組合物。該裝置可用于對(duì)脊椎動(dòng)物對(duì)象給予所述的組合物。本發(fā)明的脂質(zhì)體不包括核糖體。治療及醫(yī)學(xué)應(yīng)用方法
對(duì)比參考文獻(xiàn)14中公開(kāi)的粒子，本發(fā)明的脂質(zhì)體和藥物組合物用于體內(nèi)使用來(lái)引起對(duì)抗感興趣的免疫原的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明提供了用于在脊椎動(dòng)物內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予有效量的本發(fā)明的脂質(zhì)體或藥物組合物的步驟。所述免疫應(yīng)答優(yōu)選為保護(hù)性的免疫應(yīng)答，并優(yōu)選涉及抗體和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。所述方法可產(chǎn)生加強(qiáng)應(yīng)答。本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述的脂質(zhì)體或藥物組合物，所述脂質(zhì)體或藥物組合物用于在脊椎動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法中。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的脂質(zhì)體在制造用于在脊椎動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。通過(guò)利用這些應(yīng)用和方法在脊椎動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，可保護(hù)所述脊椎動(dòng)物對(duì)抗各種疾病和/或感染，例如，對(duì)抗如上討論的細(xì)菌和/或病毒性疾病。所述脂質(zhì)體和組合物是免疫原性的，更優(yōu)選為疫苗組合物。如本發(fā)明所述的疫苗可以是預(yù)防性(即，用來(lái)預(yù)防感染)或治療性(即，用來(lái)治療感染)疫苗，但一般是預(yù)防性疫苗。所述脊椎動(dòng)物優(yōu)選哺乳動(dòng)物，如人或大型獸類哺乳動(dòng)物(例如，馬、牛、鹿、山羊、豬)。當(dāng)預(yù)防性使用所述疫苗時(shí)，人優(yōu)選是兒童(如幼童或嬰兒)或青少年；當(dāng)所述疫苗用于治療用途時(shí)，人優(yōu)選是青少年或成人。計(jì)劃給予兒童的疫苗也可給予成年人，例如，用以評(píng)估其安全性、劑量、免疫原性等。按本發(fā)明所述制備的疫苗可用于治療兒童和成年人。因此，人患者可小于I歲、小于5歲、I 5歲、5 15歲、15 55歲或至少55歲。接受疫苗的患者優(yōu)選老年人(如≥50歲，≥60歲并優(yōu)選≥65歲)、幼兒(如≤5歲)、住院病人、保健護(hù)理人員、武裝人員和軍人、孕婦、慢性病人或免疫缺陷病人。不過(guò)，所述疫苗不僅適用于這些人群，還可用于更廣泛的群體。通常將本發(fā)明的組合物直接給予患者。可通過(guò)腸胃外注射實(shí)現(xiàn)直接遞送(例如皮下注射、腹腔注射、靜脈注射、肌內(nèi)注射、皮內(nèi)注射或注射入組織間隙；不同于參考文獻(xiàn)1，本發(fā)明一般不使用舌內(nèi)注射)。可選擇的遞送途徑包括直腸、口服(例如片劑、噴霧)、口腔、舌下、陰道、局部、透皮或經(jīng)皮、鼻內(nèi)、眼部、耳部、肺部或其它黏膜給藥方式。皮內(nèi)和肌內(nèi)給藥是兩種優(yōu)選的途徑。注射可以通過(guò)針頭(例如皮下針頭)進(jìn)行，但也可以選擇使用無(wú)針注射。肌內(nèi)劑量一般為0.5mL。本發(fā)明可用于引起全身和/或黏膜免疫，優(yōu)選引起增強(qiáng)的全身和/或黏膜免疫?？梢酝ㄟ^(guò)單劑量方案或多劑量方案給藥。多劑量可以用于初次免疫方案和/或加強(qiáng)免疫方案。在多劑量方案中，可通過(guò)相同或不同的途徑如胃腸道外初始和黏膜加強(qiáng)，黏膜初始和胃腸道外加強(qiáng)等給予多劑量。一般間隔至少I(mǎi)周(例如約2周、約3周、約4周、約6周、約8周、約10周、約12周、約16周等)給予多劑量。在一個(gè)實(shí)施方式中，可在出生后約6周、10周和14周給予多劑量,例如按世界衛(wèi)生組織的擴(kuò)大免疫規(guī)劃(Expanded Programon Immunisation, “EPI”)中常用的在6周齡、10周齡和14周齡時(shí)給藥。在一個(gè)可選實(shí)施方式中，間隔約兩個(gè)月(例如間隔約7、8或9周)給予兩個(gè)主要?jiǎng)┝?，然后在第二次主要?jiǎng)┝亢蠹s6個(gè)月 I年(例如在第二次主要?jiǎng)┝亢蠹s6、8、10或12個(gè)月)給予一個(gè)或多個(gè)加強(qiáng)劑量。在另一個(gè)實(shí)施方式中，間隔約兩個(gè)月(例如間隔約7、8或9周)給予三個(gè)主要?jiǎng)┝?，然后在第三次主要?jiǎng)┝亢蠹s6個(gè)月 I年(例如，在第三次主要?jiǎng)┝亢蠹s6、8、10或12個(gè)月)給予一個(gè)或多個(gè)加強(qiáng)劑量。概述除非另有說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施將采用化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)和藥理學(xué)的常規(guī)方法，這些常規(guī)方法在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中已有充分描述。參見(jiàn)例如，參考文獻(xiàn)34 40等。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“包含”涵蓋“包括”以及“由…組成”，例如，“包含”X的組合物可以僅由X組成或可包括其它物質(zhì)，例如X+Y。與數(shù)值X相關(guān)的 術(shù)語(yǔ)“約”是可選的并表示，例如，x±10%。本文所用術(shù)語(yǔ)“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含” Y的組合物可完全不含Y。如有需要，“基本上”一詞可以從本發(fā)明的定義中省略。提及電荷、陽(yáng)離子、陰離子、兩性離子等時(shí)都是指pH7情況下。TLR3是Toll樣受體3。它是一種單次跨膜受體，其在先天免疫系統(tǒng)中起重要作用。已知的TLR3激動(dòng)劑包括聚(1:C)?！癟LR3”是編碼該受體的基因的受認(rèn)可HGNC名稱，并且其專有 HGNC ID 是 HGNC:11849。人 TLR3 基因的 RefSeq 序列是 G1:2459625。TLR7是Toll樣受體7。它是一種單次跨膜受體，其在先天免疫系統(tǒng)中起重要作用。已知的TLR7激動(dòng)劑包括例如咪喹莫特?！癟LR7”是編碼該受體的基因的受認(rèn)可HGNC名稱，并且其專有HGNC ID是HGNC:15631。人TLR7基因的RefSeq序列是G1:67944638。TLR8是Toll樣受體8。它是一種單次跨膜受體，其在先天免疫系統(tǒng)中起重要作用。已知的TLR8的激動(dòng)劑包括例如瑞喹莫德(resiquimod)。“TLR8”是編碼該受體的基因的受認(rèn)可HGNC名稱，并且其專有HGNC ID是HGNC: 15632。人TLR8基因的RefSeq序列是GI:20302165oRIG-1樣受體(“RLR”)家族包括多種RNA解旋酶，其在先天免疫系統(tǒng)中起重要作用[41]。RLR-1 (也被稱作RIG-1或維甲酸誘導(dǎo)基因I)在靠近其N-末端有兩個(gè)半胱天冬酶(caspase)募集結(jié)構(gòu)域。經(jīng)認(rèn)可的編碼該RLR-1解旋酶的基因的HGNC名稱是“DDX58”(針對(duì)DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp)盒多妝 58 (DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide58)),并且其專有 HGNC ID 是 HGNC:19102。人 RLR-1 基因的 RefSeq 序列是 G1:77732514。RLR2 (也被稱作MDA5或黑色素瘤分化相關(guān)基因5)在靠近其N-末端也具有兩個(gè)半胱天冬酶(caspase)募集結(jié)構(gòu)域。編碼該RLR-2解旋酶的基因的受認(rèn)可HGNC名稱是“IFIHl” (針對(duì)由解旋酶C域 I 誘導(dǎo)的干擾素(interferon induced with helicase C domainl)),并且其專有 HGNCID 是 HGNC:18873。人 RLR-2 基因的 RefSeq 序列是 G1:27886567。RLR-3 (也被稱作 LGP2或遺傳學(xué)和生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室蛋白2 (laboratory of genetics and physiology2))沒(méi)有半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域。編碼該RLR-3解旋酶的基因的受認(rèn)可HGNC名稱是“DHX58” (針對(duì)DEXH(Asp-Glu-X-His)盒多肽 58 (DEXH(Asp-Glu-X-His) box polyp印tide58))，并且其專有HGNC ID 是 HGNC:29517。人 RLR-3 基因的 RefSeq 序列是 G1: 149408121。PKR是雙鏈RNA依賴性蛋白激酶。其在先天免疫系統(tǒng)中起重要作用。“EIF2AK2”(針對(duì)真核生物翻譯起始因子 2-α 激酶2 (eukaryotic translation initiationfactor2-alpha kinase2))是編碼該酶的基因的受認(rèn)可HGNC名稱，并且其專有HGNCID是HGNC:9437o 人 PKR 基因的 RefSeq 序列是 G1:208431825。


圖1顯示RNA染色凝膠。泳道表示如下:(I)標(biāo)記物(markers)⑵裸復(fù)制子(3)RNA酶處理后的復(fù)制子(4)包封在脂質(zhì)體內(nèi)的復(fù)制子(5) RNA酶處理后的脂質(zhì)體(6)經(jīng)RNA酶處理后又經(jīng)苯酚/氯仿提取的脂質(zhì)體。圖2是脂質(zhì)體的電子顯微照片。圖 3 顯示 DLinDMA、DLenDMA 和 DODMA 的結(jié)構(gòu)。圖4顯示RNA染色凝膠。泳道表示如下:(I)標(biāo)記物(markers)⑵裸復(fù)制子(3)包封在脂質(zhì)體內(nèi)的復(fù)制子(4)經(jīng)RNA酶處理后又經(jīng)苯酚/氯仿提取的脂質(zhì)體。圖5顯示RNA遞送后第1、3和6天的蛋白質(zhì)表達(dá)，其中，RNA以病毒體包裝的復(fù)制子形式遞送(方形)、以裸露RNA形式遞送(菱形)或在脂質(zhì)體內(nèi)遞送(+=0.1 μ g，X=I μ g)。圖6顯示四種不同劑量的脂質(zhì)體包封RNA遞送后第1、3和6天的蛋白質(zhì)表達(dá)。圖7顯示接受病毒體包裝的復(fù)制子(VRP或VSRP)、I μ g裸露RNA和I μ g脂質(zhì)體包封的RNA的動(dòng)物體內(nèi)抗F IgG滴度。圖8顯示接受VRP、I μ g裸露RNA和0.1g或I μ g脂質(zhì)體包封的RNA的動(dòng)物體內(nèi)抗F IgG滴度。圖9顯示接受VRP、0.1g或I μ g脂質(zhì)體包封的RNA的動(dòng)物體內(nèi)中和抗體滴度。圖10顯示復(fù)制子以裸露RNA (圓形)、脂質(zhì)體包封的RNA (三角形和方形)或脂復(fù)合體(lipoplex)(倒三 角形)形式遞送后的表達(dá)水平。圖11顯示復(fù)制子以裸露RNA (0.01 lyg)、脂質(zhì)體包封的RNA (0.01 IOyg)或包裝成病毒體(VRP，IO6感染單位或IU)形式遞送后的F-特異性IgG滴度(第二劑量后2周)。圖12顯示復(fù)制子以裸露RNA(1 μ g)、脂質(zhì)體包封的RNA (0.1或I μ g)或包裝成病毒體(VRP，IO6IU)的形式遞送后的F-特異性IgG滴度(圓形)和PRNT滴度(方形)。也顯示了未處理(na'i ve)小鼠的滴度。實(shí)線表示幾何平均數(shù)。圖13顯示在第二劑量后4周，用代表F蛋白內(nèi)主要抗原表位的合成肽再刺激后的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的產(chǎn)量。I軸表示⑶8+⑶4-的細(xì)胞因子+百分比。圖14顯示小牛免疫后超過(guò)63天(圖14A)和210天(圖14B)的F-特異性IgG滴度(平均1gltl滴度土標(biāo)準(zhǔn)偏差)。在第63天時(shí)，三條線可由底至頂?shù)乇惠p易區(qū)分:PBS陰性對(duì)照、脂質(zhì)體遞送的RNA以及所述“三角4”產(chǎn)物。圖15顯示相對(duì)于脂質(zhì)體中所用脂質(zhì)的pKa的第六天的SEAP表達(dá)(相對(duì)密度)圖像。圓形表示含DSPC的脂質(zhì)體的水平，方形表示不含DSPC的脂質(zhì)體的水平，有時(shí)方形和圓形會(huì)重合，只剩下可見(jiàn)的方形用于表示給定的PKa。圖16顯不在編碼F蛋白的復(fù)制子的第一劑量后兩周的抗F滴度表達(dá)(相對(duì)于RVO1,100%)。以與圖15中同樣的方式繪制對(duì)應(yīng)于pKa的滴度圖像。星形表示RV02，其使用了 pKa高于其它脂質(zhì)的陽(yáng)離子脂質(zhì)。三角形表示缺乏DSPC的脂質(zhì)體的數(shù)據(jù)；圓形表示包含DSPC的脂質(zhì)體的數(shù)據(jù)。圖17顯示復(fù)制子以脂質(zhì)體遞送后的總IgG滴度，其中從左向右所用脂質(zhì)體為RV01、RV16、RV17、RV18或RV19。橫線表示均值。每例中，較高的橫線是2wp2 (即第二劑量后2周)，而較低的橫線是2wpl。
圖18顯示13組小鼠體內(nèi)的IgG滴度。每個(gè)圓形是一只小鼠個(gè)體，實(shí)線表示幾何平均值。其中，點(diǎn)狀水平線是本測(cè)試的檢測(cè)限。所述13組從左至右為如下文所述的A M。圖19顯示pDC釋放的(A) IL-6和(B) IFN a (pg/mL)。從左至右的4對(duì)條形是:對(duì)照；用RNA+D0TAP免疫；用RNA+脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine)脂質(zhì)體免疫；以及用脂質(zhì)體內(nèi)的RNA免疫。在每一對(duì)中，黑色條形是野生型小鼠，灰色條形是rsql突變體。
具體實(shí)施例方式RNA復(fù)制子下文使用了多種復(fù)制子。一般而言，這些復(fù)制子基于雜交α病毒基因組，其具有來(lái)自委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)的非結(jié)構(gòu)蛋白，來(lái)自辛德畢斯病毒的包裝信號(hào)以及來(lái)自辛德畢斯病毒或VEEV突變種的3’端UTR。該復(fù)制子長(zhǎng)約IOkb，且具有聚腺苷酸尾。將編碼α病毒復(fù)制子的質(zhì)粒DNA (名為:pT7-mVEEV_FL.RSVF或A317、pT7-mVEEV-SEAP或A306、pSP6_VCR-GFP或A50)作為用于體外合成RNA的模板。所述復(fù)制子含有RNA復(fù)制所需的α病毒遺傳元件，但缺失了編碼顆粒組裝所必需的基因產(chǎn)物的那些遺傳元件；所述結(jié)構(gòu)蛋白由所需的蛋白質(zhì)(報(bào)告子(如SEAP或GFP)或者免疫原(如全長(zhǎng)RSV F蛋白))所替換，這樣所述復(fù)制子便無(wú)法誘導(dǎo)產(chǎn)生傳染顆粒。所述α病毒cDNA上游的噬菌體(T7或SP6)啟動(dòng)子促進(jìn)所述復(fù)制子RNA的體外合成，并且緊鄰聚(A)尾下游的丁型肝炎病毒(HDV)核酶通過(guò)其自切割活性產(chǎn)生正確的3’末端。用合適的限制性內(nèi)切核酸酶線性化所述HDV核酶下游的質(zhì)粒DNA后，用T7或SP6曬菌體衍生的DNA依賴性RNA聚 合酶體外合成失控轉(zhuǎn)錄物(run-off transcript)。按照生產(chǎn)商(安碧公司(Ambion))提供的說(shuō)明，在7.5mM(T7RNA聚合酶)或5mM(SP6RNA聚合酶)存在下，讓各三磷酸核苷(ATP、CTP、GTP和UTP)在37° C轉(zhuǎn)錄2小時(shí)。轉(zhuǎn)錄后，用TURBO DNA酶(安碧公司(Ambion))消化模板DNA。用LiCl沉淀復(fù)制子RNA，并將其復(fù)溶于無(wú)核酸酶的水中。通過(guò)ScriptCap m7G加帽系統(tǒng)(埃皮森特生物技術(shù)公司(EpicentreBiotechnologies)),按照使用手冊(cè)的描述,用牛痘加帽酶(VCE)對(duì)未加帽的RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后加帽；以該方式加帽的復(fù)制子標(biāo)有前綴“V”，例如，vA317是通過(guò)VCE加帽的A317復(fù)制子。用LiCl沉淀轉(zhuǎn)錄后加帽的RNA，并將其復(fù)溶于無(wú)核酸酶的水中。RNA樣品的濃度通過(guò)檢測(cè)OD260nm測(cè)定。體外轉(zhuǎn)錄物的完整性通過(guò)變性瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)。脂質(zhì)體包封將RNA包封在按參考文獻(xiàn)11和42制備的脂質(zhì)體內(nèi)。所述脂質(zhì)體由10%DSPC (兩性離子型)、40%DLinDMA(陽(yáng)離子型)、48%膽固醇和2%連接PEG的DMG(2kDa PEG)組成。這些比例指的是占整個(gè)脂質(zhì)體中的摩爾％。按參考文獻(xiàn)6的方法合成DLinDMA(l，2_ 二亞油基氧基-N，N- 二甲基_3_氨基丙烷)。DSPC (1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿)購(gòu)自基酶公司(Genzyme)。膽固醇獲自西格瑪-奧德里奇公司(Sigma-Aldrich)。連接PEG的DMG (1，2- 二肉豆蘧?；鵢sn_丙三基-3-磷酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)，銨鹽)、D0TAP(1，2-二油?；?3-三甲基銨基丙燒，氯鹽)和DC-chol (鹽酸3 β - [N- (N’, N’ - 二甲氨基乙燒)-氨基甲酸基]膽固醇)，來(lái)自阿凡提極性脂公司(Avanti Polar Lipids)。簡(jiǎn)要來(lái)說(shuō)，將脂質(zhì)溶解于乙醇(2mL)中，將RNA復(fù)制子溶解于緩沖液(2mL，IOOmM檸檬酸鈉，pH6)中，用2mL緩沖液混合這些物質(zhì)，然后平衡I小時(shí)。用6mL緩沖液稀釋所述混合物，然后過(guò)濾。所得產(chǎn)物包含脂質(zhì)體，具有約95%的包封率。例如，在一個(gè)具體的方法中，在乙醇中配制新鮮的脂質(zhì)儲(chǔ)液。稱量37mg DLinDMA、
11.8mg DSPC、27.8mg 膽固醇和 8.07mg PEG-DMG，并在 7.55mL 乙醇中溶解。在 37。C 溫和搖動(dòng)新鮮配制的脂質(zhì)儲(chǔ)液約15分鐘以形成均質(zhì)混合物。然后，將755μ L所述儲(chǔ)液加入
1.245mL乙醇中形成2mL工作脂質(zhì)儲(chǔ)液。將這個(gè)量的脂質(zhì)用于形成含有250 μ g RNA的脂質(zhì)體。還以在IOOmM檸檬酸鹽緩沖液(pH6)中約I μ g/ μ L的濃度由儲(chǔ)液制備2mL RNA工作溶液。在使用三個(gè)20mL的玻璃瓶(有攪拌棒)前，用RNA酶去除液(分子生物產(chǎn)品公司(Molecular BioProducts))沖洗所述玻璃瓶，并用足量MilliQ水清洗，以去除瓶子的RNA酶污染。將所述玻璃瓶中的一個(gè)用于所述RNA工作溶液，其它的瓶用于收集所述脂質(zhì)和RNA混合物(如后文所述)。在37° C加熱所述工作脂質(zhì)和RNA溶液lOmin，然后將其裝入3cc魯爾鎖(Iuer-1ok)注射器。將2mL朽1檬酸鹽緩沖液(pH6)裝入另一個(gè)3cc注射器中。使用FEP管(氟化乙烯-丙烯；所有使用的FEP管都具有2mm的內(nèi)直徑和3mm的外直徑)將裝有RNA和所述脂質(zhì)的注射器連接至T型混流器(ΡΕΕΚ 500 μ m ID連接，藝達(dá)思集團(tuán)健康與科技事業(yè)部(Idex Health Science)) 0所述T型混流器的出口也裝有FEP管。將裝有檸檬酸鹽緩沖液的第三個(gè)注射器連接至一段單獨(dú)的FEP管。然后，用注射泵以7mL/min的流速驅(qū)動(dòng)所有注射器。放置所述管的出口以使所述混合物收集到20mL玻璃瓶中(同時(shí)攪拌)。取出所述攪拌棒，使所述乙醇/水性溶液平衡至室溫lh。將4mL所述混合物裝入連有一段FEP管的5cc注射器，將等量的IOOmM檸檬酸鹽緩沖液(pH6)裝入另一個(gè)連有一段等長(zhǎng)FEP管的5cc注射器。用注射泵以7m L/分鐘的流速驅(qū)動(dòng)所述兩個(gè)注射器，并將最終的混合物收集到20mL玻璃瓶中(同時(shí)攪拌)。之后，使收集自第二混合步驟的混合物(脂質(zhì)體)通過(guò)Mustang Q膜(結(jié)合并移除陰離子分子的陰離子交換支持物，獲自波爾公司(PaliCorporation))。在該膜用于脂質(zhì)體之前，先讓4mLlM NaOH、4mLlM NaCl和IOmLlOOmM朽1樣酸鹽緩沖液(PH6)依次通過(guò)該膜。將脂質(zhì)體在37° C溫育IOmin后通過(guò)所述膜。接著，將脂質(zhì)體濃縮到2mL，使用切向流過(guò)濾(TFF)對(duì)10 15體積I XPBS透析，然后回收終產(chǎn)物。所述TFF系統(tǒng)和中空纖維過(guò)濾膜購(gòu)自斯派實(shí)驗(yàn)室(Spectrum Labs)(多明格斯牧場(chǎng)(RanchoDominguez)),并按照生產(chǎn)商指南使用。使用具有IOOkD孔徑截止值、8cm2表面積的聚砜中空纖維過(guò)濾膜。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)所用的制劑用I XPBS稀釋到所需的RNA濃度。圖2顯示通過(guò)這些方法制備的脂質(zhì)體的示例性的電子顯微照片。這些脂質(zhì)體包含包封的編碼全長(zhǎng)RSV F抗原的RNA。一批脂質(zhì)體的動(dòng)態(tài)光散射顯示其平均直徑是141nm(根據(jù)密度)或78nm (根據(jù)數(shù)量)。RNA的包封百分比和RNA的濃度利用Quant-1T RiboGreen RNA試劑盒(英杰生命科技有限公司(InvitiOgen))按照生產(chǎn)商的說(shuō)明來(lái)測(cè)定。利用所述試劑盒提供的核糖體RNA標(biāo)準(zhǔn)品生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。在添加染料前，在I XTE緩沖液(來(lái)自試劑盒)中將所述脂質(zhì)體稀釋到IOX或IOOX。另外，在添加染料(來(lái)破壞脂質(zhì)體并由此檢測(cè)總RNA)前，在含有0.5%曲通X (Triton X)的I X TE緩沖液中將脂質(zhì)體稀釋到10X或100X。然后，添加等量的染料至各溶液，然后，將約180 μ L添加染料后的各溶液加入(設(shè)雙重復(fù))96孔組織培養(yǎng)板。在酶標(biāo)儀上讀取熒光(激發(fā)波長(zhǎng)485nm，發(fā)射波長(zhǎng)528nm)。所有脂質(zhì)體制劑的體內(nèi)給藥劑量都基于RNA的包封量。
據(jù)顯示包封于脂質(zhì)體內(nèi)保護(hù)了 RNA不被RNA酶消化。實(shí)驗(yàn)使用3.8mAU RNA酶A/微克RNA，在室溫孵育30分鐘。RNA酶用蛋白酶K在55° C滅活10分鐘。然后添加1:1v/V的樣品混合物比25:24:lv/v/v的苯酚:氯仿:異戊醇以從所述脂質(zhì)提取所述RNA進(jìn)入水相。渦旋震蕩數(shù)秒鐘混勻樣品，然后將樣品置于離心機(jī)上以12，000RPM離心15min。移出并使用所述水相(含有所述RNA)來(lái)分析所述RNA。在上樣之前(每孔400ng RNA)，將所有樣品和甲醛上樣染料一起孵育，在65° C變性10分鐘，并冷卻至室溫。使用安碧公司(Ambion)的Millennium標(biāo)記物來(lái)估計(jì)RNA構(gòu)建物的分子量。在90V跑膠。按照生產(chǎn)商指南，在水中使用0.1%SYBR金，通過(guò)在室溫?fù)u晃I小時(shí)對(duì)所述凝膠染色。圖1顯示在無(wú)包封情況下，RNA被RNA酶完全消化(第3泳道)。包封后無(wú)法檢測(cè)到RNA (第4泳道)，即便這些脂質(zhì)體經(jīng)RNA酶處理也未見(jiàn)變化(第4泳道)。脂質(zhì)體經(jīng)RNA酶處理后又經(jīng)苯酚提取，可見(jiàn)未被消化的RNA(第6泳道)。甚至在4° C經(jīng)過(guò)I周后，仍然可見(jiàn)沒(méi)有任何斷裂的RNA(圖4，箭頭)。在4° C經(jīng)過(guò)6周和一個(gè)凍融循環(huán)后，體內(nèi)蛋白表達(dá)不變。因此，脂質(zhì)體包封的RNA是穩(wěn)定的。為評(píng)估所述RNA的體內(nèi)表達(dá)，在所述復(fù)制子內(nèi)編碼了報(bào)告酶(分泌型堿性磷酸酶，SEAP)而不是免疫原。以1:4在IX磷雜-光(Phospha-Light)稀釋緩沖液中稀釋血清，在該稀釋液中使用化學(xué)發(fā)光堿性磷酸鹽底物來(lái)檢測(cè)表達(dá)水平。在第O天，以0.1 μ g或I μ gRNA劑量對(duì)8 10周大的BALB/c小鼠(5只/組)進(jìn)行肌內(nèi)注射(50 μ L/腿)。不含所述脂質(zhì)體的相同載體(溶于無(wú)RNA酶的1XPBS)也以Iyg給藥。還測(cè)試了病毒體包裝的復(fù)制子。本文所用的病毒體包裝的復(fù)制子(稱為“VRPs”)按參考文獻(xiàn)43的方法獲得，其中，所述α病毒復(fù)制子衍生自突變VEEV或者嵌合體，所述嵌合體衍生自VEEV基因組且經(jīng)基因工程操作而含有辛德畢斯病毒3’端UTR和辛德畢斯病毒包裝信號(hào)(PS)，通過(guò)共電穿孔使其與編碼辛德畢斯病毒衣殼和糖蛋白基因的缺損型輔助RNA包裝入BHK細(xì)胞。如圖5所示，就I μ g劑量而言，包封使SEAP水平增加約l/21og，在第6天，0.1yg包封劑量的表達(dá)達(dá)到了 Iyg未包封劑量所見(jiàn)的水平。到第3天時(shí)，表達(dá)水平超過(guò)了那些使用VRP(SB)所達(dá)到的水平。因此，相比裸露RNA對(duì)照，配制在脂質(zhì)體中的RNA的表達(dá)增力口，甚至在較低的劑量(IOX)也是如此。表達(dá)與VRP對(duì)照相比也更高，但表達(dá)動(dòng)力學(xué)非常不同(參見(jiàn)圖5)。相對(duì)于裸露RNA，由電穿孔遞送所述RNA使得表達(dá)增加，但這些水平都低于由脂質(zhì)體遞送的RNA。為評(píng)估所述脂質(zhì)體組顯示的效果是僅僅歸因于脂質(zhì)體組分，還是與包封有聯(lián)系，所述復(fù)制子以包封形式(用兩種不同的純化方法，0.1yg RNA)給藥，或在脂質(zhì)體形成后與其混合(非包封的“脂復(fù)合體”，0.1 μ g RNA)給藥，或者以裸露RNA(1 μ g)給藥。圖10顯示所述脂復(fù)合體顯示了最低表達(dá)水平，顯示包封對(duì)蛋白表達(dá)是必要的。使用脂質(zhì)體遞送的體內(nèi)研究證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)。小鼠接受不同的組合:(i)編碼全長(zhǎng)RSV F蛋白的自復(fù)制RNA復(fù)制子(ii)編碼GFP的自復(fù)制RNA復(fù)制子(iii)編碼GFP的RNA復(fù)制子，其敲除nsP4以排除自復(fù)制(iv)全長(zhǎng)RSV F蛋白。共有13組接受以下組合物:
權(quán)利要求
1.一種具有包封水性核心的脂質(zhì)雙分子層的脂質(zhì)體，其特征在于:(i)所述脂質(zhì)雙分子層包含PKa在5.0 7.6范圍內(nèi)的脂質(zhì)；以及(ii)所述水性核心包括編碼免疫原的RNA。
2.如權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述pKa在5.0 7.6范圍內(nèi)的脂質(zhì)具有叔胺。
3.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述在5.0 7.6范圍內(nèi)的pKa在5.7 5.9之間。
4.如權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述pKa在5.0 7.6范圍內(nèi)的脂質(zhì)具有如本文中的式 RVOl、RV02、RV03、RV04、RV05、RV06、RV07、RV08、RV09、RVl1、RV12、RV16 或RV17所示。
5.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其直徑在20 220nm范圍內(nèi)。
6.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述RNA分子編碼(i)能從所述RNA分子轉(zhuǎn)錄RNA的RNA依賴性RNA聚合酶，以及(ii)免疫原。
7.如權(quán)利要求5所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述RNA分子有兩個(gè)開(kāi)放閱讀框，所述開(kāi)放閱讀框中的第一個(gè)開(kāi)放閱讀框編碼α病毒復(fù)制酶，而第二個(gè)開(kāi)放閱讀框編碼所述免疫原。
8.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述RNA分子的長(zhǎng)度是9000 12000個(gè)核苷酸。
9.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述免疫原能引起體內(nèi)免疫應(yīng)答以對(duì)抗細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲(chóng)。
10.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其特征在于，所述免疫原能引起體內(nèi)免疫應(yīng)答以對(duì)抗呼吸道合胞病毒糖蛋白F。
11.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體。
12.一種用于在脊椎動(dòng)物體內(nèi)引起保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予所述脊椎動(dòng)物有效量的如權(quán)利要求1 10所述的脂質(zhì)體或者如權(quán)利要求11所述的藥物組合物的步驟。
13.一種用于制備包含RNA的脂質(zhì)體的方法，所述方法包括脂質(zhì)體形成過(guò)程中的如下步驟:(a)在低于脂質(zhì)的pKa但聞?dòng)?.5的pH下混合RNA和所述脂質(zhì)；然后(b)提聞pH,使其聞?dòng)谒鲋|(zhì)的pKa。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于:步驟(a)中所用的RNA在水性溶液中，以與所述脂質(zhì)的有機(jī)溶液混合來(lái)獲得混合物，然后稀釋所述混合物以形成脂質(zhì)體；以及在步驟(b)中，在脂質(zhì)體形成后提高所述pH。
全文摘要
在脂質(zhì)體內(nèi)遞送編碼免疫原的RNA以用于免疫目的。所述脂質(zhì)體包含pKa在5.0～7.6范圍內(nèi)的脂質(zhì)，優(yōu)選所述脂質(zhì)具有叔胺。在生理pH下，這些脂質(zhì)體的表面電荷基本呈中性，并且所述脂質(zhì)體對(duì)免疫有效。
文檔編號(hào)C12N15/86GK103153284SQ201180042459
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2011年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月6日
發(fā)明者A·吉爾 申請(qǐng)人:諾華有限公司