專利名稱：軟骨細(xì)胞仿生培養(yǎng)模型及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及軟骨細(xì)胞仿生培養(yǎng)領(lǐng)域，特別是，涉及一種軟骨細(xì)胞仿生培養(yǎng)模型。
背景技術(shù)：
對于關(guān)節(jié)軟骨損傷，目前臨床手術(shù)干預(yù)主要包括骨髓刺激方法(鉆孔和微骨折)， 自體軟骨細(xì)胞移植，自體骨軟骨移植，骨膜或軟骨膜移植，以及多種形式生物材料的輔助應(yīng)用。盡管上述方法都取得了一定程度的成功，但無論單獨使用還是組合使用都不足以完全恢復(fù)具有多層解剖結(jié)構(gòu)的骨軟骨解剖功能，主要表現(xiàn)為新生軟骨的力學(xué)性能不足，生化組成不良，與周圍組織結(jié)合不良，直接導(dǎo)致了中遠(yuǎn)期臨床治療效果下降(see Hunziker EB.Osteoarthritis Cartilage2002 ； 10(6) :432-63 ；Wang DA, et al. Nat Mater 2007 ； 6(5) :385-92)。目前軟骨損傷的基礎(chǔ)研究主要包括體外實驗和動物實驗兩部分。體外研究方法包括平面培養(yǎng)，小球培養(yǎng)(pellet culture)和三維支架材料培養(yǎng)。其中平面培養(yǎng)能夠大量增殖軟骨細(xì)胞(可達(dá)1，000倍)，但同時軟骨細(xì)胞會發(fā)生嚴(yán)重的退分化現(xiàn)象 (dedifferentiation) (seeGoldring MB. Methods Mol Med 2004;100:37-52)。雖然退分化的軟骨細(xì)胞有可能在軟骨環(huán)境中再次分化成軟骨細(xì)胞，但這還取決于退分化程度和體內(nèi)局部微環(huán)境等諸多因素，增加了實驗結(jié)果的不穩(wěn)定性(seeHwang NS, et al. Tissue Eng 2006 ； 12 (9) :2695-706)。小球培養(yǎng)(pellet culture)模仿了軟骨形成早期的高細(xì)胞密度，低氧以及細(xì)胞與細(xì)胞之間緊密聯(lián)結(jié)的環(huán)境(see Toh WS, et al. StemCells 2007 ；25 (4) :950-60)，是最為廣泛使用的體外模型。除了欠缺標(biāo)準(zhǔn)化操作外，兩個主要缺陷限制了上述兩種模型的廣泛使用1)不能評價新生軟骨與宿主軟骨的結(jié)合；2)不能評價周圍軟骨組織對新植入的軟骨細(xì)胞和再生的軟骨的調(diào)控作用。三維支架材料輔助軟骨再生取得了很大進(jìn)步，但支架的結(jié)構(gòu)和材料的物理化學(xué)性能多樣性阻礙了它作為標(biāo)準(zhǔn)模型的使用(see Cao Τ, etal. Cloning Stem Cells 2008 ； 10(1) :1-10)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個新的體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)模型，不僅模仿微環(huán)境所面臨的體內(nèi)軟骨再生環(huán)境，還可以評價軟骨和骨的形成，以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。本發(fā)明提供一種軟骨細(xì)胞仿生培養(yǎng)模型，其通過下述方法制備而成1)制取中心帶有鉆孔的表層軟骨骨塊模型，用PBS清洗，用Y射線消毒；2)將1. 1-1. 3% (g/dl，下同)海藻酸鈉加至細(xì)胞培養(yǎng)板，然后將步驟1得到的骨塊模型放入細(xì)胞培養(yǎng)板各孔；3)向孔中和骨塊模型周圍加入0. 1-0. 15MCaCl2溶液，使其凝固；
4)吸出步驟3加入的CaCl2溶液，用細(xì)胞培養(yǎng)液潤洗。其中，所述步驟1中，表層軟骨取自于比較大型的動物，如牛、豬馬或羊等。所述步驟2中，將1. 2%海藻酸鈉加至細(xì)胞培養(yǎng)板。所述步驟3中，向孔中和骨塊模型周圍加入0. IMCaCl2溶液。所述步驟3中，凝固后，在4°C冰箱放置池。步驟4中，所述的細(xì)胞培養(yǎng)液通過下述步驟制成向滅菌后的培養(yǎng)瓶中加入ISOmL DMEM原液，20mL融化的FBS，再加入1000X的PS 200 μ L，整個過程保持無菌環(huán)境。所述PS 是雙抗，其組成為 Penicillin 和 Sti^ptomycin本發(fā)明還提供制備上述軟骨細(xì)胞仿生培養(yǎng)模型的方法，包括下述步驟1)制取中心帶有鉆孔的表層軟骨骨塊模型，用PBS清洗，用γ射線消毒；2)將1. -1. 3%海藻酸鈉加至細(xì)胞培養(yǎng)板，然后將步驟1得到的骨塊模型放入細(xì)胞培養(yǎng)板各孔；3)向孔中和骨塊模型周圍加入0. 1-0. 15MCaCl2溶液，使其凝固；4)吸出步驟3加入的CaCl2溶液，用細(xì)胞培養(yǎng)液潤洗。其中，步驟1中，鉆透骨塊的目的在于利用海藻酸鈉溶液與氯化鈣的凝固作用使骨塊固定，海藻酸鈉凝膠為透明狀，封底可以利用顯微鏡觀察細(xì)胞在模型中的生長狀況。步驟2中，加海藻酸鈉溶液至細(xì)胞培養(yǎng)板中，海藻酸鈉溶液不沒過模型，主要是為了固定骨塊模型。步驟3中，CaCl2溶液鈣離子會使海藻酸鈉溶液凝固，從而固定骨塊模型，而殘余的 CaCl2溶液在下一步驟中吸出。本發(fā)明還提供上述的仿生培養(yǎng)模型在培養(yǎng)軟骨細(xì)胞中的應(yīng)用。所述應(yīng)用包括下述步驟1)向培養(yǎng)模型中各孔加入P I代原代軟骨細(xì)胞；2)在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Ih使細(xì)胞貼壁；3)待細(xì)胞貼壁后，向細(xì)胞培養(yǎng)板的各孔中加入上述的細(xì)胞培養(yǎng)液，使其沒過培養(yǎng)模型上層軟骨，培養(yǎng)。在制備本發(fā)明的仿生培養(yǎng)模型中，還需要注意如下幾點1)切割脛骨平臺時不易太薄，否則電鋸產(chǎn)生熱量會燒焦表面；2)制作模型時按照標(biāo)準(zhǔn)化模式，模型大小基本保持一致；3)制作好的模型在-20°C條件下保存，以免軟骨降解；4)培養(yǎng)細(xì)胞時細(xì)胞培養(yǎng)液要沒過模型表面。本發(fā)明方法具有以下有益效果1)由于它的標(biāo)準(zhǔn)化，可以避免批次的變化；2)能模擬體內(nèi)微環(huán)境培養(yǎng)細(xì)胞；3)可以用來解決移植修復(fù)軟骨缺損面臨的瓶頸問題缺乏體外研究細(xì)胞模型。


圖1為模具實驗；圖2為實驗步驟示意圖3為對照組與實施例1模型組的細(xì)胞增殖曲線圖；圖4為對照組與實施例1模型組的細(xì)胞增殖柱狀圖。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例11、試劑及器材1)試劑=Alginate, CaCl2, NaCl、KCl、Na2HPO4, KH2PO4,無水乙醇、DMEM、FBS、 Penicillin、Streptomycin、II M月交HCBI、Trypsin、EDTA。2)器材帶鋸、打孔機(jī)、電鉆、游標(biāo)卡尺、超凈工作臺、通風(fēng)櫥、電子天平、加樣器、 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、高速冷凍離心機(jī)、倒置顯微鏡。2、溶液配制1)1. 2%海藻酸鈉溶液稱取1. 2g海藻酸鈉溶于IOOmL去離子水中，高溫高壓滅菌后備用?；?·15MCaCl2 溶液稱取1. 665g無水氯化鈣，用IOOmL去離子水溶解。高溫高壓蒸汽滅菌后常溫保存。3) PBSNaCl 4. 0g, KCl 0. lg, Na2HPO4O. 575g，KH2PO4O. Ig,加去離子水 400mL 完全溶解，用 IM HCl調(diào)節(jié)pH至7. 20，配成0. OlM PBS緩沖溶液。靜置4°C冰箱保存。4)細(xì)胞培養(yǎng)液用加樣器向滅菌后的培養(yǎng)瓶中加入180mL DMEM原液，20mL融化的FBS，再加入 1000X的PS 200 μ L0整個過程均在滅菌后的超凈工作臺里操作，并保持無菌環(huán)境。5)軟骨消化液軟骨消化液含0. 1 % II型膠原酶的DMEM原液。具體方法向15mL離心管中加入 15mL DMEM原液，再加入0.015g II型膠原酶。37°C條件下使酶充分溶解。6)傳代消化液稱Trypsin 0. 25g, EDTA 0. 02g，溶解至IOOmL PBS緩沖液中，用無菌注射器吸取并通過過濾器過濾至無菌的IOOmL瓶中，靜置4°C冰箱保存。3、模具制作制作圖1模具，可以切割出7mmX7mmX Φ_(Φ < 2cm)的立方體模塊。4、仿生模型制作(見圖2)a)取牛的脛骨平臺，用電鋸將軟骨層連同軟骨下骨切割l-2cm ；b)用電鉆在切取的骨上鉆孔(直徑3. 5mm)，鉆透；c)以鉆孔為中心，用模具切割出立方體塊狀結(jié)構(gòu)；d)用游標(biāo)卡尺從表層軟骨量取骨塊5mm，其余部分用切去；e)制作好的模型用PBS清洗，放入IOcm細(xì)胞培養(yǎng)皿中；f)用γ射線消毒(劑量1-2K)，_20°C冰箱保存。5、仿生培養(yǎng)模型建立a)將骨塊模型從-20°C冰箱取出，解凍；
b)用PBS清洗骨塊模型，每個洗三次；c)用加樣器吸取1. 2%海藻酸鈉300mL加至M孔細(xì)胞培養(yǎng)板；d)用鑷子夾著骨塊模型放入細(xì)胞培養(yǎng)板各孔，調(diào)整位置和海藻酸鈉凝膠良好接觸；e)向孔中和骨塊模型周圍加入0. IMCaCl2溶液300mL，使其凝固。4°C冰箱放置池；f)吸出CaCl2溶液，用細(xì)胞培養(yǎng)液反復(fù)潤洗三次，備用。6、細(xì)胞培養(yǎng)a)人原代軟骨細(xì)胞取自于醫(yī)院關(guān)節(jié)病人病變軟骨；b)軟骨樣品處理在超凈臺中用PBS將樣品清洗2-3次，直至清洗液清澈為止。用滅菌的手術(shù)刀和鑷子剝離并盡可能切碎軟骨組織。切碎的軟骨組織置于15mL離心管中，按每克組織5ml 0. 1% II型膠原酶溶液的比例加入軟骨消化液，37°C水浴消化20h ；c)收集培養(yǎng)用200目銅網(wǎng)過濾消化液至培養(yǎng)皿中，再轉(zhuǎn)移至15mL離心管中。在高速冷凍離心機(jī)中以ISOOrpm轉(zhuǎn)速離心6mins，收集沉淀，重懸于培養(yǎng)基中，用血球計數(shù)板計數(shù)，記錄。然后以4K/cm2的密度種于IOcm培養(yǎng)皿中(其中，細(xì)胞培養(yǎng)液的制備同上向滅菌后的培養(yǎng)瓶中加入180mL DMEM原液，20mL融化的FBS，再加入1000X的PS 200 μ L，整個過程保持無菌環(huán)境；如非特別說明，下述均同)；d)P0代細(xì)胞培養(yǎng)在細(xì)胞貼壁后第2天用PBS沖去培養(yǎng)皿及孔板底部的碎屑，以利于細(xì)胞生長，并且更換細(xì)胞培養(yǎng)液。第5天在顯微鏡下對培養(yǎng)皿細(xì)胞進(jìn)行照相，并更換細(xì)胞培養(yǎng)液。第8天換液并繼續(xù)培養(yǎng)。第十天對PO代細(xì)胞觀察并記錄；e)傳代至Pl代細(xì)胞在第11天時向PO代細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入3ml傳代消化液， 置于培養(yǎng)箱消化aninutes。在顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞大部分懸浮，向培養(yǎng)皿中加入2倍體積傳代消化液的的細(xì)胞培養(yǎng)液(6ml)，一齊轉(zhuǎn)移至15mL離心管中。在高速冷凍離心機(jī)中以 1500rpm轉(zhuǎn)速離心3. 5minutes，收集沉淀，重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液中，用血球計數(shù)板計數(shù)。在細(xì)胞貼壁后第2天用PBS沖去培養(yǎng)皿及孔板底部的碎屑，以利于細(xì)胞生長，并且更換細(xì)胞培養(yǎng)液。第5天在顯微鏡下對培養(yǎng)皿細(xì)胞進(jìn)行照相，并換液；f)消化軟骨細(xì)胞原代Pl代細(xì)胞，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，向培養(yǎng)模型中各孔加入300 個細(xì)胞；g)在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Ih使細(xì)胞貼壁；h)待細(xì)胞貼壁后，M孔板中加入500mL細(xì)胞培養(yǎng)液，使其沒過培養(yǎng)模型上層軟骨，培養(yǎng)。實驗例軟骨細(xì)胞在仿生培養(yǎng)模型組中培養(yǎng)設(shè)為模型組(實施例1，)；在普通細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)設(shè)為對照1組(培養(yǎng)皿未鋪海藻酸鈉凝膠)；在鋪有海藻酸鈉凝膠的細(xì)胞培養(yǎng)皿設(shè)為對照2組，三組中細(xì)胞培養(yǎng)液成分等均相同，區(qū)別就是在于模型組中使利用了骨塊模型培養(yǎng)細(xì)胞。對照1組和對照2組中。分別在3、6、9、12、15天五個時間點利用Hoechst33258 能夠和細(xì)胞DNA結(jié)合的并發(fā)出熒光的特點，檢測熒光OD值，來獲得相對細(xì)胞數(shù)。實驗結(jié)果表明在任意階段，利用模型組培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)目都大于對照1組和對照2組的細(xì)胞數(shù)。利用統(tǒng)計學(xué)對同一時間點的模型組、對照1組和對照2組分析，結(jié)果表明，在任意時間點，在模型組(實施例1)培養(yǎng)的相對細(xì)胞數(shù)分別大于對照1組和對照2組，并存在顯著性差異。(圖3、4) 利用模型培養(yǎng)效果由于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，可能的原因在于骨塊能夠為細(xì)胞提供仿生的三維生長環(huán)境，細(xì)胞直接與骨塊結(jié)合可能產(chǎn)生一定的作用；此外可能由于骨塊中有細(xì)胞體內(nèi)生長需要的生長因子，促使細(xì)胞生長較為良好。
權(quán)利要求
1.一種軟骨細(xì)胞仿生培養(yǎng)模型，其特征在于，通過下述方法制備而成1)制取中心帶有鉆孔的表層軟骨骨塊模型，用PBS清洗，用γ射線消毒；2)將1.-1. 3%海藻酸鈉加至細(xì)胞培養(yǎng)板各孔，然后將步驟1得到的骨塊模型放入細(xì)胞培養(yǎng)板各孔；3)向孔中和骨塊模型周圍加入0.1-0. 15MCaCl2溶液，使海藻酸鈉溶液凝固；4)吸出步驟3加入的CaCl2溶液，用細(xì)胞培養(yǎng)液潤洗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的仿生培養(yǎng)模型，其特征在于，所述步驟1中，表層軟骨取自于牛、豬馬或羊。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的仿生培養(yǎng)模型，其特征在于，所述步驟2中，將1.2%海藻酸鈉加至細(xì)胞培養(yǎng)板。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的仿生培養(yǎng)模型，其特征在于，所述步驟3中，向孔中和骨塊模型周圍加入0. IMCaCl2溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的仿生培養(yǎng)模型，其特征在于，所述步驟3中，凝固后，在4°C冰箱放置2h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的仿生培養(yǎng)模型，其特征在于，步驟4中，所述的細(xì)胞培養(yǎng)液通過下述步驟制成向滅菌后的培養(yǎng)瓶中加入180mL DMEM原液，20mL融化的FBS，再加入 1000X的PS 200 μ L，整個過程保持無菌環(huán)境。
7.制備權(quán)利要求1-6任一項所述軟骨細(xì)胞仿生培養(yǎng)模型的方法，包括下述步驟1)制取中心帶有鉆孔的表層軟骨骨塊模型，用PBS清洗，用γ射線消毒；2)將1.1-1. 3%海藻酸鈉加至細(xì)胞培養(yǎng)板，然后將步驟1得到的骨塊模型放入細(xì)胞培養(yǎng)板各孔；3)向孔中和骨塊模型周圍加入0.1-0. 15MCaCl2溶液，使其凝固；4)吸出步驟3加入的CaCl2溶液，用細(xì)胞培養(yǎng)液潤洗。
8.權(quán)利要求1-6任一項所述的仿生培養(yǎng)模型在培養(yǎng)軟骨細(xì)胞中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，包括下述步驟1)向培養(yǎng)模型中各孔加入原代PI代軟骨細(xì)胞；2)在37°C，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Ih使細(xì)胞貼壁；3)待細(xì)胞貼壁后，向細(xì)胞培養(yǎng)板的各孔中加入權(quán)利要求6所述的細(xì)胞培養(yǎng)液，使其沒過培養(yǎng)模型上層軟骨，培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種軟骨細(xì)胞仿生培養(yǎng)模型，其通過下述方法制備而成1)制取中心帶有鉆孔的表層軟骨骨塊模型，用PBS清洗，用γ射線消毒；2)將1.1％-1.3％海藻酸鈉加至細(xì)胞培養(yǎng)板，然后將步驟1得到的骨塊模型放入細(xì)胞培養(yǎng)板各孔；3)向孔中和骨塊模型周圍加入0.1-0.15MCaCl2溶液，使其凝固；4)吸出步驟3加入的CaCl2溶液，用細(xì)胞培養(yǎng)液潤洗。本發(fā)明的軟骨細(xì)胞仿生培養(yǎng)模型能模擬體內(nèi)微環(huán)境培養(yǎng)細(xì)胞，并且可以用來解決移植修復(fù)軟骨缺損面臨的瓶頸問題缺乏體外研究細(xì)胞模型。
文檔編號C12N5/071GK102344905SQ20101024525
公開日2012年2月8日 申請日期2010年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月4日
發(fā)明者葛子鋼 申請人:北京大學(xué)