專利名稱:同時檢測人cmv和bk病毒dna的引物序列及定量檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及生物技術(shù),是一種基于定量核酸擴增的分子生物學(xué)方法,特別是涉及用實時熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)(real-time PCR),通過使用特異性的引物擴增巨細胞病毒 (CMV)和多瘤病毒(BKV)保守性片段,并通過特異性探針釋放熒光信號對其進行定量。優(yōu)化實驗條件后,構(gòu)建可在單個反應(yīng)管內(nèi)同時完成對CMV DNA和BKV DNA檢測的試劑盒。
背景技術(shù):
CMV和BKV是腎移植受者體內(nèi)的潛伏病毒。當(dāng)免疫抑制治療過度時,兩種病毒會有不同程度的再激活而損傷移植腎臟。這些病毒可以在腎移植受者尿液、血漿和外周血細胞中被發(fā)現(xiàn),對腎移植受者的長期存活、移植腎的長期存活和醫(yī)療費用產(chǎn)生巨大的負面影響。目前,還未開發(fā)出可同時檢測CMV DNA和BKV DNA的診斷試劑,作為早期指標診斷 CMV和BKV感染。而且對腎移植受者免疫過度抑制的評價和危害也未有具體的方法。CMV 和BKV作為潛伏病毒,可以作為腎移植受者體內(nèi)的“探針”,檢測兩種病毒DNA的拷貝數(shù)變化可間接反應(yīng)機體免疫抑制程度。本發(fā)明基于實時熒光定量PCR技術(shù),利用此技術(shù)的敏感性和特異性,針對CMV DNA 和BKVDNA的保守序列設(shè)計了熒光定量PCR的引物和標記熒光的探針。通過不同熒光標記探針,可以在同一反應(yīng)管和同次實驗內(nèi)完成對CMV DNA和BKV DNA的檢測。并通過制備含 CMV和BKV靶DNA的標準品,使熒光定量PCR可以同時定量檢測CMV DNA和BKV DNA拷貝數(shù)。目前,尚無其他方法可同時對CMV、BKV兩種病毒的DNA進行定量檢測。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有分子診斷技術(shù)中對CMV和BKV DNA序列多態(tài)性考慮不足,提供了一種用于對CMV和BKV DNA保守性序列進行定量檢測的引物和探針,包括SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 4、SEQID NO. 5 和 SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 6。本發(fā)明第二個目的是提供CMV DNA和BKV DNA的保守序列作為檢測的靶DNA片段 SEQ IDN0. 7 和 SEQ ID N0. 8。本發(fā)明第三個目的是提供一種配套此引物和探針檢測CMV DNA和BKV DNA的標準品,其為含CMV、BKV兩種測定目的DNA片段SEQ ID N0. 9的純化質(zhì)粒,并提供了制備標準品的引物 SEQ ID N0. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12 到 SEQ ID NO. 13。本發(fā)明第四個目的是提供一種簡便的對臨床標本的CMV DNA和BKV DNA同時進行定量檢測的試劑盒。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一組用于擴增CMV和BKV的特異性引物和探針,分別針對CMV保守序列和BKV的保守序列。針對CMV有上游引物SEQ ID NO. 1和下游引物SEQ ID N0. 2,及一條探針SEQ ID N0. 3 ;針對BKV有上游引物SEQ ID N0. 4和下游引物SEQ ID N0. 5,及一條探針SEQ IDNO. 6。提供CMV DNA和BKV DNA的保守序列SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8作為檢測的靴 DNA片段,其具有高度的保守性。一種配套此引物和探針檢測CMV DNA和BKV DNA的標準品,其為含CMV、BKV兩種測定目的DNA片段SEQ ID NO. 9的純化質(zhì)粒。CMV DNA片段經(jīng)引物對SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11擴增而獲得,其BKV DNA片段經(jīng)引物對SEQ ID N0. 12,SEQ ID NO. 13擴增而獲得。標準品通過基因工程技術(shù)將包含檢測CMV和BKV的目的DNA片段連接到質(zhì)粒上,并通過鑒定、 擴增、提取、純化獲得,并通過260nM的進行吸光度值讀取,進行濃度分析而獲得目的DNA準確的拷貝數(shù)目,并通過稀釋制備成不同濃度的標準品。一種同時檢測CMV和BKV兩種病毒DNA的試劑盒試劑A 由針對CMV、BKV的引物和探針混合組成250 μ L溶液。溶液包含5 μ M SEQ ID NO. 1,5 μ M SEQ ID NO. 2,5 μ M SEQ ID NO. 4,5 μ M SEQ ID NO. 5 禾口 2 μ M 探針 SEQ ID NO. 3、2μΜ 探針 SEQ ID NO. 6 ;試劑B :由 250 μ L 緩沖液組成,包含 ImM dNTPs (包括 dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、 200mMTris-HCl、200mM KClUOOmM(NH4) 2S04,45mM MgSO4 ;試劑C :5U/ μ L Taq DNA 聚合酶;試劑D 制備的標準品經(jīng)過梯度稀釋達到5Ε7(5Χ107拷貝/mL)、5Ε6、5Ε5、5Ε4、 5Ε3,用于標準曲線的制定;試劑E 陰性對照(無CMV、BKV感染的正常人DNA);試劑G 陽性對照(采用5Ε4的標準品)。本發(fā)明優(yōu)點 利用CMV DNA和BKV DNA上保守序列的穩(wěn)定性,設(shè)計高特異性的弓I物和探針,提高 CMV DNA和BKV DNA的檢出。通過優(yōu)化實驗反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,組成簡單、快速、靈敏、特異的檢測試劑盒,可用于對臨床標本CMV DNA和BKV DNA拷貝數(shù)的跟蹤和動態(tài)檢測。有利于CMV DNA和BKV DNA拷貝數(shù)的檢測和對兩種病毒感染的診斷。同時在單一反應(yīng)管內(nèi)檢測可減少人力和物力,提供更多的實驗信息。
圖1為CMV和BKV DNA標準品同時檢測的測定結(jié)果。圖2為CMV和BKV DNA同時檢測后,單獨顯示CMV DNA檢測結(jié)果。圖3為CMV和BKV DNA同時檢測后,單獨顯示CMV DNA檢測結(jié)果。圖4為CMV和BKV DNA梯度濃度標準品測定值的兩條標準曲線。圖5為CMV和BKV DNA同時檢測后,單獨顯示CMV DNA檢測標準曲線。圖6為CMV和BKV DNA同時檢測后,單獨顯示BKV DNA檢測標準曲線。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例1一種用于對CMV和BKV DNA進行定量檢測的一組引物和探針。包括一對針對CMV的引物包括上游引物SEQ ID NO. 1和下游引物SEQ ID NO. 2及一條探針SEQ ID NO. 3 ;和一對針對BKV的引物包括上游引物SEQ ID NO. 4和下游引物SEQ ID NO. 5,及一條探針SEQ ID NO. 6。SEQ IDNO. 3、SEQ ID NO. 6可標記不同的熒光染料用于定量檢測。實施例2一種配套此方法檢測CMV和BKV DNA的標準品,同時含CMV、BKV兩種測定目的 DNA片段SEQ ID N0. 9的純化質(zhì)粒。制備過程通過對CMV和BKV DNA擴增后獲得目的片段并連接于T載體。用SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 11引物對CMV DNA進行次擴增,程序為 95 0C 2min ;94°C 20sec,60°C 30sec,72°C 30sec 共;35 個循環(huán),條件為 200nM 引物、Taq 酶 50U/mL、100yM dNTPs、20mM Tris_HCl、20mM KCl、10mM(NH4)2S04、2mM MgS04。通過以上方法獲得CMV目的DNA片段。對BKV DNA進行PCR擴增,采用SEQ ID N0. 12和SEQ ID N0. 13 引物進行擴增,程序為950C 2min ;94°C 20sec,60°C 30sec,72°C 30sec共35個循環(huán),條件為 200nM 引物、Taq 酶 50U/mL、100yM dNTPs、20mM Tris_HCl、20mM KClUOmM(NH4)2SO4,2mM MgS04。通過以上方法獲得BKV的目的DNA片段。經(jīng)BamH I內(nèi)切酶在37 °C,酶切CMV和BKV 的PCR產(chǎn)物2. 5小時(CMV和BKV PCR產(chǎn)物各10 μ LUOXTango緩沖液4 μ L、BamH I內(nèi)切酶2 μ LdK 14 μ L),酶切產(chǎn)物經(jīng)過PCR產(chǎn)物純化柱純化獲得20 μ L酶切產(chǎn)物。酶切產(chǎn)物再經(jīng) iM連接酶22°C反應(yīng)12小時(酶切產(chǎn)物5 μ L、Τ4連接酶lyL、10X緩沖液1 μ L、/K 3 μ L) 連接CMV和BKV靶DNA片段,再經(jīng)PCR產(chǎn)物純化柱純化獲得IOyL的連接產(chǎn)物。此產(chǎn)物再經(jīng) SEQ ID NO. 10 和 SEQ ID N0. 13 引物進行擴增,程序為 95°C 2min ;94°C 20sec,60°C 30sec, 72°C 30sec共30個循環(huán),再72°C延伸5min ;反應(yīng)條件為引物濃度為200nM、Taq酶50U/mL、 100 μ M dNTPs、20mM Tris_HCl、20mM KClUOmM(NH4)2SO4,2mM MgS04。將最后一次 PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后連接到T載體上(純化的PCR產(chǎn)物5 μ L、T4連接酶1 μ L、T載體1 μ L、10 X緩沖液1 μ LdK 2 μ L),隨后通過標準的基因工程技術(shù),進行篩選、擴增和純化。并通過對質(zhì)粒進行DNA測序證實CMV和BKV目的DNA片段已經(jīng)共同被連接于質(zhì)粒載體。對純化質(zhì)粒進行 260ηΜ的吸光度檢測,計算質(zhì)粒的拷貝數(shù)。實施例3一種對CMV和BKV的DNA進行定量檢測的試劑盒,由下列試劑組成試劑A 由針對CMV、BKV的引物和探針混合組成250 μ L溶液。溶液包含5 μ M SEQ ID NO. 1,5 μ M SEQ ID NO. 2,5 μ M SEQ ID NO. 4,5 μ M SEQ ID NO. 5 禾口 2 μ M 探針 SEQ ID NO. 3、2μΜ 探針 SEQ ID NO. 6 ;試劑B :由 250 μ L 緩沖液組成,包含 ImM dNTPs (包括 dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、 200mMTris-HCl、200mM KClUOOmM(NH4) 2S04,45mM MgSO4 ;試劑C :5U/ μ L Taq DNA 聚合酶;試劑D 制備的標準品經(jīng)過梯度稀釋達到5Ε7(5Χ107拷貝/mL)、5Ε6、5Ε5、5Ε4、 5Ε3,用于標準曲線的制定;試劑E 陰性對照(無CMV、BKV感染的正常人DNA);試劑G 陽性對照(采用5Ε4的標準品)。實施例4用本發(fā)明試劑盒進行實時熒光定量PCR(real-time PCR)檢測。首先,按實驗的標本個數(shù)計算各試劑的需要量,實驗步驟如下
1.需要進行5個標準品和標本的復(fù)孔檢測外,還需檢測陰性對照和陽性對照。2.按如順序和數(shù)量配置反應(yīng)液加入水790 μ L、試劑A 100 μ L、試劑B 100 μ L、試劑C 10 μ L共900 μ L,可進行20
個反應(yīng)孔的實驗。3.混勻上述反應(yīng)液后,每次吸取45 μ L分別加入20孔的PCR反應(yīng)管。4.各管按順序加入5μ L的5Ε3、5Ε4、5Ε5、5Ε6、5Ε7標準品、標本、陰性對照、陽性對
照(如下)。
PCR反應(yīng)板 123
A5E+35E+7樣品4B5E+35E+7樣品4C5E+4樣品1陽性對照D5E+4樣品1陰性對照E5E+5樣品2F5E+5樣品2G5E+6樣品3H5E+6樣品3_」5.蓋好蓋子后放入熒光定量PCR儀進行檢測。程序設(shè)計為95°C 2min; 94°C 10sec,60°C Imin共45個循環(huán);熒光信號值在60°C度檢測。6.結(jié)果計算通過熒光定量PCR儀的分析軟件,記錄不同標準品的Ct值并繪制標準曲線,通過標準曲線計算各樣本的CMV和BKV的DNA拷貝數(shù)。通過陰性對照和陽性對照進行實驗的控制。
權(quán)利要求
1.一種用于對巨細胞病毒(CMV)和BK病毒(BKV)脫氧核糖核酸片段(DNA)進行定量檢測的一組引物和探針。其特征是一對針對CMV的引物包括上游引物SEQ ID NO. 1和下游引物SEQ IDN0. 2,及一條探針SEQ ID NO. 3 ;和一對針對BK的引物包括上游引物SEQ ID NO. 4和下游引物SEQ ID NO. 5,及一條探針SEQ ID NO. 6。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的對CMV和BKV的DNA進行定量檢測的一組引物和探針,其特征在于可定量測定CMV和BKV的特定靶DNA片段。CMV的特定靶DNA片段為SEQ ID NO. 7, BKV的特定靶DNA片段為SEQ ID NO. 8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的對CMVDNA和BKV的DNA進行定量檢測的一組引物和探針, 其特征在于可定量測定含CMV和BKV的特定靶DNA片段的標本和標準品。此標準品為純化的質(zhì)粒,其同時含用于此方法檢測的特定CMV DNA和BKV DNA片段SEQ ID NO. 9。其CMV DNA片段經(jīng)引物對SEQ ID NO. 10,SEQ ID NO. 11擴增而獲得,其BKV DNA片段經(jīng)引物對SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 擴增而獲得。
4.一種用于對CMV和BKV的DNA進行定量檢測的試劑盒,其特征包括1,由下述試劑組成試劑A 由針對CMV、BKV的引物和探針混合組成250 μ L溶液。溶液包含5 μ M SEQ ID NO. 1,5 μ M SEQ ID NO. 2,5 μ M SEQ ID NO. 4,5 μ M SEQ ID NO. 5和 2 μ M探針SEQ ID NO. 3, 2 μ M 探針 SEQ ID NO. 6 ;試劑 B :由 250 μ L 緩沖液組成,包含 ImM dNTPs (包括 dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、 200mMTris-HCl、200mM KClUOOmM(NH4) 2S04,45mM MgSO4 ;試劑C :5U/ μ L Taq DNA聚合酶;試劑D 制備的標準品經(jīng)過梯度稀釋達到5Ε7(5Χ107拷貝/mL)、5E6、5E5、5E4、5E3,用于標準曲線的制定;試劑E 陰性對照(無CMV、BKV感染的正常人DNA);試劑G 陽性對照(采用5E4的標準品)。
全文摘要
同時檢測人CMV和BK病毒DNA的引物序列及定量檢測試劑盒本發(fā)明公開了可同時用于對巨細胞病毒(CMV)和BK病毒(BKV)脫氧核糖核酸片段(DNA)進行定量檢測的引物、熒光探針和實時定量多聚酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)試劑盒。試劑盒包括試劑A、B、C、D、E和G。試劑A由一組引物和探針混合組成,引物和探針均針對CMV DNA、BKV DNA的保守序列;試劑B為含dNTP的緩沖液;試劑C為Taq DNA聚合酶;試劑D由不同濃度標準品組成;試劑E和G分別為陰性、陽性對照。本發(fā)明所提供的整套試劑盒可對尿液、血液、其他體液等臨床標本中CMV和BKV兩種病毒DNA同時進行定量檢測。
文檔編號C12N15/11GK102344970SQ20101024487
公開日2012年2月8日 申請日期2010年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月27日
發(fā)明者楊亦榮, 白永恒, 陳必成 申請人:溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院