專利名稱：利用特異性lna引物檢測基因突變的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明包括檢測不同核酸的方法，適于此目的一組寡核苷酸，用來進行本發(fā)明方法的試劑盒以及該方法在鑒定特異性基因序列及診斷疾病與感染的用途和應(yīng)用。
其次，癌癥的主要原因被認為是在直接或間接控制細胞生長及分化的細胞基因的改變。有至少三十個基因家族與人類腫瘤形成有關(guān)，稱的為致癌基因。其中一種家族成員-ras基因家族，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)在人類腫瘤中產(chǎn)生突變。在其正常狀態(tài)中，ras基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)被認為與正常細胞的成長及突變有關(guān)。Ras基因突變在蛋白質(zhì)產(chǎn)物中的三個臨界位置的一引起氨基酸改變，導(dǎo)致轉(zhuǎn)變成與腫瘤形成有關(guān)的類型。具有此突變的基因稱為”突變型”或”活化的”。未突變的ras稱為“野生型”或“正?！眗as。認為致癌劑或其它環(huán)境因素會誘導(dǎo)此種導(dǎo)致ras活化的點突變。已發(fā)現(xiàn)超過90％的胰臟癌，約50％的結(jié)腸腫瘤與癌，約50％的肺癌及甲狀腺癌，以及大部分如急性骨髓白血病、淋巴瘤和myelodysplastic并發(fā)癥含有活化的ras致癌基因。大體上，部分人類腫瘤的10至20％具有在三個ras基因(H-ras、Ki-ras或N-ras)中的一的突變。
與癌癥發(fā)展高度相關(guān)的另一個基因?qū)嵗秊門P53基因。超過半數(shù)以上的所有人類癌癥由于突變及/或缺失改變了TP53基因。該點突變散播在超過250密碼子并且大多數(shù)出現(xiàn)錯義突變。就這一點而言，TP53基因與其它腫瘤抑制基因如成視網(wǎng)膜細胞瘤腫瘤抑制基因(Rb1)和經(jīng)常由于缺失或無意義(nonsense)突變而失去活性的p16基因不同。
多數(shù)的惡性腫瘤顯示在TP53基因的兩等位基因發(fā)生了改變。此通常與一等位基因的完全缺失及錯義突變使其它等位基因失去活性有關(guān)。此結(jié)果為完全缺乏TP53蛋白質(zhì)或發(fā)生改變的蛋白質(zhì)的表達。在TP53高度保留區(qū)域的錯義突變也和TP53蛋白質(zhì)增加的程度有關(guān)。這似乎是由突變誘導(dǎo)的構(gòu)型改變所造成，此改變可穩(wěn)定蛋白質(zhì)并且延長半衰期從4小時到8小時。多數(shù)錯義突變?nèi)杭诘鞍踪|(zhì)中央核心的四個高度保留區(qū)域。此區(qū)域是序列特定DNA結(jié)合的由來且對于TP53功能的完整有絕對的重要性。在這些區(qū)域內(nèi)已鑒定出七個突變的熱點。這些熱點位于氨基酸殘基175、213、245、248、249、273和282。
第三，引起傳染病的寄生蟲、微生物和病毒，都具有其本身的核酸。通常利用一些傳統(tǒng)方法(例如培養(yǎng))來確定生物材料樣本中這些生物體的存在。各生物體皆有其獨特的基因組，假如存在對單一物種(對數(shù)種相關(guān)物種，對一屬(genus)，或?qū)^高程度關(guān)系)為特定的核酸基因或序列，此序列將提供該生物體(或物種等)的”指紋(fingerprint)”，例如在HIV病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的基因中(在密碼子215的A→T突變Science(1989)2461155-1158)。其它病毒的實例包括HPV、EBV、HSV、B型肝炎和C型肝炎及CMV。微生物的實例包括細菌，更特別地包括支原體、軍團菌屬、分枝桿菌、衣原體、假絲酵母、gonocci、志賀菌屬及沙門氏菌(salmonella)的各種菌株。藉由本發(fā)明鑒定微生物的功能將增加科學界從更多生物得到基因組的信息。在某些細菌菌株的核酸中，發(fā)現(xiàn)其核糖體基因與其rRNA有極大的相似性。
目前在檢驗不同核苷酸序列樣本領(lǐng)域的嘗試集中于利用在核苷酸序列中的唯一變異區(qū)別核酸。此種變異可為點突變造成的結(jié)果(例如核苷酸交換)或是在微生物的情況下，物種間變異的結(jié)果。此種接近的相關(guān)核酸的天然實例為等位基因，亦即在染色體上限定部位的已知基因序列的交替變體。
在上述各實例中，可從樣本中分離核酸并通過鑒定對于疾病或生物體特異的一個或多個序列，測定該樣本是否含有任何上述序列，亦即對“遺傳疾病”、癌癥、傳染病或傳染性生物體有特異性的序列。鑒定在核苷酸序列中的變異或改變時的困難是該檢測不易應(yīng)用于樣本中存在的靶序列復(fù)制數(shù)少的情況。此種情況中，難以區(qū)別信號與噪聲。繞過此問題的一種方法是增強信號。因此，一些用來擴增樣本靶序列的方法已有敘述。其中一種最為熟知且廣泛使用的擴增方法是聚合酶鏈反應(yīng)(稱為PCR)，此方法在美國專利US4,683,195、US4,683,202與US4,800,159中有詳細說明。
以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，一些用來檢測序列變異的方法已有敘述。從OncogenResearch 1(1989)，235-241及Nucl.Acids Res.17(1989)，8093-8099已知在PCR中利用特殊設(shè)計的引物先擴增可能含有等位基因變體的區(qū)域，接著以限制酶處理該區(qū)域。然后用限制片段長度多型性(RFLP)分析可診斷該等位基因。依大小電泳分離分裂的產(chǎn)物，于是顯露出探針中是否含有對應(yīng)的等位基因。此方法的缺點是需要特定的限制性消化。除了此方法對于尚未產(chǎn)生RFLP的各突變?yōu)橐宦闊┓椒ǖ氖聦嵉耐?，必須能將引物設(shè)計成與點突變相鄰，允許用在給定位點可精確分裂的限制酶加以消化。由于這些列于公開出版物中的原因，這可能是困難的處。
EP-A-0332435與US5,605,794說明了選擇性檢測與相鄰核酸僅有一個核苷酸不同的核酸的方法。在此使用的結(jié)果為下列一個由對待檢測的核酸雜交的寡核苷酸，僅那些利用酶可理論上在延長方向末端的單一核苷酸處延長，該單一核苷酸與待檢測的核酸(一等位基因)的對應(yīng)核苷酸互補。因此選擇僅能與欲檢驗的核酸互補的寡核苷酸。這樣，雜交到其它等位基因的寡核苷酸在理論上無法延長。其結(jié)果是實際上雜交到其它等位基因的寡核苷酸盡管只有較少的程度但仍會延長。這會降低該方法的敏感度，特別是特異性。尤其當T為3’-末端錯配的一部分時或是該錯配為一C∶A錯配時可能容易出現(xiàn)非特定延長(Kwok et al.(1990).NucleicAcids Research，18999-1005)。為了增加特異性，EP-A-0 332 435建議選擇寡核苷酸的核苷酸序列，該寡核苷酸末端區(qū)域含有與該兩核酸的對應(yīng)核苷酸不互補的其它核苷酸。對于兩等位基因的檢測兩反應(yīng)必須在每一反應(yīng)僅檢測兩等位基因其中之一的方式進行。此方法需要合成兩等位基因特定引物與一鏈互補鏈引物。在兩個反應(yīng)中擴增該樣本一次在PCR中利用鏈互補鏈引物與一等位基因特異的引物，在第二個平行反應(yīng)-PCR，利用該鏈互補鏈引物和第二等位基因特異的引物擴增樣本。假使在該反應(yīng)其中之一檢測不出被懷疑可能存在的等位基因特異的PCR產(chǎn)物，可假設(shè)為在該樣本中不存在該個別等位基因。由于同型結(jié)合的DNA樣本僅含有在兩個反應(yīng)僅其中之一可被檢測的兩等位基因中的一個，因此需要使用在所有反應(yīng)中產(chǎn)生相同控制產(chǎn)物的兩個額外引物。此控制產(chǎn)物與特異的產(chǎn)物不同以控制其它等位基因個別PCR的效率并建立缺少的個別等位基因。假使PCR產(chǎn)物中存在控制產(chǎn)物但未發(fā)現(xiàn)等位基因特異的產(chǎn)物，該樣本可能不含反應(yīng)中欲試驗的等位基因。此方法中，必須在兩個別反應(yīng)中建立存在或缺少的兩等位基因，各獨立的PCR必須包括一控制PCR。
Biochem.Biophys.Res.Commun.(1989)，160441-447建議利用減少dNTP濃度增加選擇性。即使需要額外的量測，不同批次中等位基因的檢測可生成非特異的產(chǎn)物。
在連接酶鏈反應(yīng)(ligase chain reaction)中(WO89/09835)，利用熱穩(wěn)定性特異地連接酶連接兩相鄰寡核苷酸。只要該寡核苷酸在嚴格的雜交溫度下雜交到互補靶上并在連鎖部位有完整的堿基配對就會發(fā)生此反應(yīng)。假使兩等位基因與各個其它在連鎖部位的突變結(jié)果不同，上述完整堿基配對會僅對于等位基因其中之一完成。接著在連接酶反應(yīng)中，需要與前兩個寡核苷酸互補的額外兩個寡核苷酸來擴增連接反應(yīng)(ligation)產(chǎn)物。迄今，兩等位基因的檢測需要具有至少六個寡核苷酸的兩個反應(yīng)并且利用放射標記檢測擴增產(chǎn)物(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1991)，88189-193)。
由Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1985)，821585-1588與New England Journal ofMedicine(1987)，317985已知一種以具有檢查下的等位基因的“等位基因特異的”寡核苷酸差別雜交(ASO)為基礎(chǔ)的檢測等位基因的方法。例如合成長度各為20bp兩個寡核苷酸。該兩寡核苷酸各與兩個不同等位基因配對但對于在寡核苷酸序列中間的另一等位基因具有錯配。利用具有標記寡核苷酸的差別雜交可區(qū)別等位基因。這可應(yīng)用在人類基因組DNA及PCR產(chǎn)物兩者的分析上。也可利用本方法直接及個別分析基因組DNA但需要額外的消化與電泳。
Nucleic Acids Research(1989)，172437-2448及EP-A-0 333 465說明一種利用等位基因-特異的引物競爭(競爭性寡核苷酸引發(fā)competitive oligonucleotide priming＝COP)檢驗在少數(shù)額外PCR循環(huán)存在不同等位基因的預(yù)擴增的人類基因組DNA的方法。然后上述ASO-技術(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)镻CR技術(shù)。在原本的ASO技術(shù)中，由于在對應(yīng)控制允許明確轉(zhuǎn)譯的期間信號強度的比較，因此由交錯雜交引起的5％錯誤率是可接受的。然而在PCR反應(yīng)中，該引物為等位基因特異的寡核苷酸，假使錯誤發(fā)生在兩等位基因擴增的試劑混合物中，則僅含有等位基因其中之一的樣本的錯誤率在十次循環(huán)后大概總計為12％。該引物競爭顯示增加的選擇性，但基因組DNA所關(guān)注的區(qū)域在PCR會先被擴增，接著以十次后續(xù)循環(huán)進行不同等位基因的分析。在這些循環(huán)中使用兩個等位基因特異的引物和互補鏈引物，并且在兩個反應(yīng)中放射標示等位基因特異的引物的其中之一。對于長度為12至16個堿基的寡核苷酸顯示出不同的等位基因的選擇性檢測，反之在該已知條件下較長的寡核苷酸也可生成非特異的產(chǎn)物。
存在著對于直接檢測在樣本中至少一個單一堿基變異的簡單及更特殊方法的需求，該樣本含有如基因組DNA核酸，該方法將檢測步驟減到最少而可利用最少的操作技巧，快速、精確及容易地進行該方法。
以示差雜交法為基礎(chǔ)的方法僅能應(yīng)用在某些情形，此外這些方法非常復(fù)雜而且易受干擾。并且，預(yù)擴增步驟為一程序步驟(例如在COP過程)，最好排除此步驟。
上述檢測不同核酸的所有方法具有依賴未修飾核苷酸在不同核酸檢測中作為區(qū)別因子的特性。
b)檢測該延長產(chǎn)物，例如利用標準凝膠電泳、毛細管電泳或各種雜交測定。
本發(fā)明其它實施方案為利用該至少一個寡核苷酸、一組寡核苷酸、不同組的寡核苷酸、一種試劑盒進一步延長和擴增以及該方法的各種應(yīng)用與用途。
根據(jù)本發(fā)明“靶核酸”為包含在樣本中的并存在感興趣對象的核酸，該靶核酸(Q’和Q)的核苷酸序列為實質(zhì)上完全相同，但該核酸Q’在其核苷酸序列的至少一個位置與核酸Q的核苷酸序列不同。核苷酸序列中變異的位置稱為“位置A”。位置A也稱為多型部位，并且核酸中位置A的存在稱為基因多型性。如果該不同核苷酸序列包括數(shù)種不同的核酸(Q’1，Q’2，...，Q’e)，該變異位置稱為A1，A2，...，Ae。此種變異的發(fā)生，例如可能為點突變的結(jié)果或可能由單一或數(shù)個堿基的缺失或插入引起。待檢測的核酸可為RNA或DNA且已證明特別適合于尤其細菌rRNA的診斷。
“診斷的寡核苷酸”指一種寡核苷酸，該寡核苷酸在位置A與在待檢測的靶核酸的位置A發(fā)現(xiàn)的核苷酸互補的核苷酸，且該寡核苷酸在給定雜交條件下能區(qū)別不同靶核酸序列(Q’1，Q’2，...，Q’e)，并且僅起始在位置A含有核苷酸的靶核酸序列的延長，該核苷酸與診斷寡核苷酸的位置A的核苷酸互補。
術(shù)語“產(chǎn)物靶”指那些為原始靶核酸的延長產(chǎn)物的核苷酸。也可以使用產(chǎn)物靶物作為靶核酸，其通常小于原始靶。
術(shù)語“位置”指該核酸上的限定部位。此種位置可例如為一核苷酸所占用。
術(shù)語“等位基因”指任何在同源染色體上不同堿基序列的相同基因座產(chǎn)生的相同基因的形式。
核苷酸指在確保正常沃森-克里克堿基配對條件(例如G-C，A-T或A-U)下存在互補性。此互補的堿基配對可導(dǎo)致匹配，反之不互補的堿基配對會導(dǎo)致錯配。能產(chǎn)生此種堿基配對的任何核堿基(例如7-脫氮-dGTP、dITP、LNA-堿基類似物等)也和存在互補性有關(guān)。
為了解本發(fā)明方法，待檢測的核酸必須以適合在體外反應(yīng)的形式存在。用已知的方法消化待檢測的樣本，例如組織樣本、組織萃取物、個別細胞或含細胞流體以打破細胞壁(例如熱溶解、酶溶解或化學溶解或其組合)釋出核酸。
然后使樣本與本發(fā)明的診斷寡核苷酸接觸。選擇可使本發(fā)明的寡核苷酸與待檢測核酸的對應(yīng)區(qū)域雜交的條件。此雜交通常已知為退火(annealing)。通過選擇適當?shù)暮塑账嵝蛄?、核苷酸長度、雜交溫度、佐劑等避免與無關(guān)的核酸(亦即那些不待檢測的核酸)雜交(參見Ausubel等人在Current Protocols in Molecular Biology，pub.John Wiley & Sons(1998)及實施例的細節(jié))。
本發(fā)明不同診斷的寡核苷酸的數(shù)目相當于待檢測的不同靶核酸的最少數(shù)目。因此兩個不同突變的檢測需要至少兩個不同診斷的寡核苷酸，各含有與可存在靶核酸位置A的核苷酸的其中僅有的一互補的核苷酸。使用診斷的寡核苷酸優(yōu)選具有小于50個核苷酸的長度，優(yōu)選在5-40個核苷酸的范圍內(nèi)，更優(yōu)選為5至30個核苷酸的范圍，甚至更優(yōu)選為5至25個核苷酸的范圍，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。各診斷寡核苷酸具有與位置A的鄰近區(qū)域高度互補的核苷酸序列，因此此寡核苷酸與待檢測的核酸雜交。
本發(fā)明方法為勝過以競爭引發(fā)或錯配引發(fā)法原則為基礎(chǔ)的方法。然而，不管應(yīng)用不同的方法，用于靶核酸檢測的各診斷寡核苷酸包括至少一個LNA。此LNA優(yōu)選與待檢測的靶核酸的位置A發(fā)現(xiàn)的核苷酸相對應(yīng)并互補。
本發(fā)明的一個實施方案為檢測樣本中靶核酸Q’樣本存在的方法，該靶核酸Q’的核苷酸序列與核酸Q在至少一個位置A不同，該方法包括下列步驟a)將存在于樣本中的核酸與適量的核苷三磷酸鹽、用于核苷三磷酸鹽聚合的試劑及至少一個診斷的寡核苷酸結(jié)合，該診斷的寡核苷酸在位置A含有核苷酸，該核苷酸在雜交條件下能與核酸Q’位置A的核苷酸雜交，但是不與核酸Q位置A的核苷酸雜交，至少一個診斷的寡核苷酸含有至少一個LNA，b)延長任何雜交到存在于樣本中的核酸的寡核苷酸以形成延長產(chǎn)物，其中該所述核酸作為模板，
c)檢測任何在步驟b)中所形成的核酸，因此檢測樣本中核酸Q’的存在。
此方法可應(yīng)用于例如RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA及其它第一鏈合成的應(yīng)用。利用增加下列步驟代替步驟c)循環(huán)延長反應(yīng)使該方法更有效率c1)形成延長產(chǎn)物之后，在變性條件下處理反應(yīng)混合物從模板分離延長產(chǎn)物，d1)在適量核苷三磷酸鹽及用于核苷三磷酸鹽聚合的試劑存在下，利用至少一個診斷的寡核苷酸雜交步驟c1)的單鏈核酸，該寡核苷酸在位置A含有在雜交條件下能與核酸Q’位置A的核苷酸雜交，但是不與核酸Q位置A的核苷酸雜交的核苷酸，該至少一個診斷的寡核苷酸含有至少一個LNA，e1)重復(fù)步驟c1)至d1)足夠次數(shù)以產(chǎn)生可檢測量的延長產(chǎn)物，f1)檢測形成的延長產(chǎn)物。
此方法會導(dǎo)致線性擴增，可進一步延伸包括作為靶核酸相反鏈延長產(chǎn)物合成引物的”下游寡核苷酸”的重新擴增步驟，此方法可允許對于PCR型的指數(shù)擴增。檢測靶核酸Q’存在的方法包括下列步驟，該靶核酸Q’的核苷酸序列與樣本中核酸Q至少一個位置A不同a)將核酸與適量的核苷三磷酸鹽、用于核苷三磷酸鹽聚合的試劑、至少一個下游寡核苷酸及至少一個診斷的寡核苷酸結(jié)合，該診斷的寡核苷酸在位置A含有核苷酸，該核苷酸在雜交條件下能與核酸Q’位置A的核苷酸雜交，但是不與核酸Q位置A的核苷酸雜交，至少一個該診斷的寡核苷酸含有至少一個LNA，b)延長任何雜交到該核酸的寡核苷酸以形成延長產(chǎn)物，其中所述核酸作為模板，c)形成延長產(chǎn)物的后，在變性條件下處理反應(yīng)混合物從模板分離延長產(chǎn)物，d)在適量核苷三磷酸鹽及用于核苷三磷酸鹽聚合的試劑存在下，利用至少一個下游寡核苷酸及至少一個診斷的寡核苷酸雜交步驟c)的單鏈核酸，該寡核苷酸在位置A含有在雜交條件下能與核酸Q’位置A的核苷酸雜交，但不與核酸Q位置A的核苷酸雜交的核苷酸，該至少一個診斷的寡核苷酸含有至少一個LNA，e)重復(fù)步驟c)至d)足夠次數(shù)以產(chǎn)生可檢測量的延長產(chǎn)物，f)檢測形成的延長產(chǎn)物。
依照本發(fā)明方法的變化選擇，該LNA-核苷酸位于診斷寡核苷酸的給定部位，優(yōu)選在位置A，例如在診斷寡核苷酸內(nèi)部位置或在診斷寡核苷酸的3’-末端。
本發(fā)明特別適用于多重分析。在一些情況下，分析可能含有在不同部位一些不同突變的基因，例如在許多密碼子具有突變的TP53基因。利用一些小心配對的LNA-寡體/DNA-寡體成對，各個成對指向一特定突變且各個成對可導(dǎo)致特征大小的片段或特征標記的片段，通過按大小切分所產(chǎn)生的片段或檢測片段的標記可區(qū)別一些不同的突變。檢測其核苷酸序列彼此在至少一個位置A不同的靶核酸的方法與上述方法類似，但此處的診斷寡核苷酸由一個以上的序列組成，該方法包括下列步驟a)在雜交條件下，將核酸與適量的核苷三磷酸鹽、用于核苷三磷酸鹽聚合的試劑及至少一組診斷的寡核苷酸結(jié)合，該至少一組診斷的寡核苷酸具有核苷酸序列，該核苷酸序列在至少一個位置A彼此不同且含有至少一個LNA，b)延長任何雜交到該核酸的寡核苷酸以形成延長產(chǎn)物，其中該核酸用作為模板，c)檢測在步驟b)中形成的核酸。
此構(gòu)成一種例如可用來作為不同核酸序列的序列特異的第一鏈合成以并且能夠用作例如RNA序列特異的逆轉(zhuǎn)錄的方法。也如同上述，檢測其核苷酸序列彼此在至少一個位置A不同的靶核酸的方法可通過重復(fù)幾次延長反應(yīng)，如同所述增加下列步驟代替步驟c)使該方法更有效c1)形成延長產(chǎn)物的后，在變性條件下處理反應(yīng)混合物從模板分離延長產(chǎn)物，d1)在適量核苷三磷酸鹽及用于核苷三磷酸鹽聚合的試劑存在下，使步驟c1)的單鏈核酸與至少一組診斷的寡核苷酸雜交以合成進一步的延長產(chǎn)物，該組診斷寡核苷酸的核苷酸序列彼此在至少一個位置A不同，e1)重復(fù)步驟c1)至d1)足夠次數(shù)以產(chǎn)生可檢測量的延長產(chǎn)物，f1)檢測形成的延長產(chǎn)物。
此方法會導(dǎo)致線性擴增對應(yīng)于所用的寡核苷酸的不同核酸，以及可進一步延伸包括作為靶核酸相反鏈延長產(chǎn)物合成引物的單一或多數(shù)下游寡核苷酸的重新擴增步驟，此方法可允許對于PCR型的指數(shù)擴增。檢測其核苷酸序列彼此在至少一個位置A不同的靶核酸的方法將包括下列步驟a)在雜交條件下結(jié)合核酸與適量的核苷三磷酸鹽、用于核苷三磷酸鹽聚合的試劑、至少一個下游寡核苷酸及至少一組診斷的寡核苷酸，該至少一組診斷寡核苷酸具有在至少一個位置A彼此不同的核苷酸序列，并含有至少一個LNA，b)延長任何雜交到該核酸的寡核苷酸以形成延長產(chǎn)物，其中該核酸用作為模板，c)形成延長產(chǎn)物的后，在變性條件下處理反應(yīng)混合物從模板分離延長產(chǎn)物，d)在適量核苷三磷酸鹽及用于核苷三磷酸鹽聚合的試劑存在下，使步驟c)的單鏈核酸與至少一個下游寡核苷酸及至少一組診斷的寡核苷酸雜交以合成進一步的延長產(chǎn)物，該組診斷寡核苷酸的核苷酸序列彼此在至少一個位置A不同，e)重復(fù)步驟c)至d)足夠次數(shù)以產(chǎn)生可檢測量的延長產(chǎn)物，f)檢測形成的延長產(chǎn)物。
同樣在該方法的變化中，由于在這些條件下該雜交具有較高的選擇性與特異性，因此優(yōu)選為對應(yīng)于突變位置(該靶核酸的位置A)的診斷寡核苷酸的3’-末端LNA-核苷酸。
在所有上述方法中的用于聚合的試劑優(yōu)選為酶，例如RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶。該DNA聚合酶優(yōu)選為熱穩(wěn)定DNA聚合酶，如Taq、Pfu、Pwo或Tth。
利用下列實例可說明不同核酸的檢測原則。單一反應(yīng)容器含有用于同步檢測一基因的兩等位基因的PCR試劑混合物。這些等位基因在一個堿基位置上不同(等位基因Q’(突變體)的位置A與等位基因Q(正常)的位置A)。在該反應(yīng)中使用三個引物、一個與兩等位基因互補的基因引物及各自對于兩等位基因之一有選擇性的兩個引物。堿基使引物的選擇性產(chǎn)生作用，該堿基位在單一選擇性引物的3’-末端系與Q’的位置A互補，另一引物的堿基與Q的位置A互補。兩個引物含有對應(yīng)于位置A在3’-位置的LNA。此外，為了容易區(qū)別最終的PCR產(chǎn)物，例如可選擇等位基因特異的引物以便產(chǎn)生不同長度或具有不同標記的PCR產(chǎn)物，并通過例如凝膠電泳、毛細管電泳或本領(lǐng)域中已知的各種雜交技術(shù)方便檢測不同長度或具有不同標記的PCR產(chǎn)物。
對于檢測在單一堿基的核苷酸序列變異的雜交的選擇性可利用連接酶反應(yīng)增強。一般而言(Nature 327，293-297(1987)and Nature 327，298-303(1987))，觀察到已知寡核苷酸長度越短對單一堿基變異的辨別效果越好。然而，短DNA-寡體具有極低的Tm，因此對DNA寡體長度設(shè)定了較低的限制。另一方面，該LNA修飾導(dǎo)致在Tm極為顯著的增加(每次修飾3至8℃)，因此能使甚至4至25個寡核苷酸的短引物在與標準PCR及LCR(連接酶鏈反應(yīng))條件相容的條件下雜交到靶核酸，并且在對于單一堿基變異具有改善識別的情形下進行此雜交。和PCR一樣，LCR使用交替溫度(alternating temperature)的多重循環(huán)來擴增許多DNA的靶標序列。但LCR不使用單獨核苷酸作模板延長反而藉助過量的寡核苷酸，該寡核苷酸與靶區(qū)域的雙鏈互補。在雙鏈模板DNA變性的后，利用與靶鏈其中之一相鄰區(qū)域互補的兩個(或更多)寡核苷酸引物起始該LCR程序。與任一鏈互補的寡核苷酸可被結(jié)合。在連接與第二次變性步驟的后，該原始模板與兩個(或更多)新結(jié)合的產(chǎn)物作為提供靶序列指數(shù)擴增的額外連接的模板。此方法詳述于Genomics，4560-569(1989)，引入本文作為參考。本發(fā)明中提出含有至少一個LNA，優(yōu)選含有4至25個核苷酸，更優(yōu)選為5至20個核苷酸，甚至更優(yōu)選為6至15個核苷酸，例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個核苷酸的短寡核苷酸。在該“LCR程序”中此寡核苷酸會抗基因-多型性。在交替溫度的多重循環(huán)之后，已擴增許多靶標序列并且可利用凝膠電泳、”三文治”-雜交或任一種本領(lǐng)域中敘述的許多方法加以檢測。以下列步驟說明a)在雜交條件下結(jié)合靶核酸與適量的核苷三磷酸鹽、至少兩個寡核苷酸以及用于寡核苷酸連接的試劑，其中至少一個該寡核苷酸為診斷寡核苷酸，該至少一個診斷寡核苷酸為在位置A含有與待檢測的靶核酸位置A發(fā)現(xiàn)的核苷酸互補的核苷酸的寡核苷酸，該診斷寡核苷酸含有至少一個LNA，b)連接任何在相鄰位置雜交到該核酸的寡核苷酸以形成連接產(chǎn)物，其中使用該核酸作為模板，c)在連接之后，在變性條件下處理反應(yīng)混合物從模板分離連接產(chǎn)物，d)在適量核苷三磷酸鹽及用于寡核苷酸連接的試劑存在下，使步驟c)的單鏈核酸與至少一個與步驟b)連接產(chǎn)物互補的寡核苷酸及至少一個診斷的寡核苷酸雜交，該至少一個診斷寡核苷酸為在位置A含有與待檢測的靶核酸位置A發(fā)現(xiàn)的核苷酸互補的核苷酸的寡核苷酸，該診斷寡核苷酸含有至少一個LNA，e)重復(fù)步驟c)至d)足夠次數(shù)以產(chǎn)生可檢測量的連接產(chǎn)物，f)檢測形成的連接產(chǎn)物。
該方法當然可以在步驟b)的后停止并立刻觀察。
優(yōu)選的用于連接的試劑為酶，例如連接酶、優(yōu)選為DNA連接酶、例如T4-DNA連接酶、更優(yōu)選為熱穩(wěn)定酶，例如Taq DNA連接酶。
本方法的另一改善是LCR及PCR的聯(lián)合使用。因此本方法提出將兩個(或更多)短(例如8bp)上游LNA-引物代替單一上游引物雜交至模板。將兩個(或更多)短LNA-引物彼此靠近地雜交，可利用連接反應(yīng)使該短LNA-引物與其中一個結(jié)合。因此連接將確保充分的特異性。在連接之后，可延長經(jīng)連接的引物。之前所述的兩個熱穩(wěn)定連接酶和聚合酶建議利用交替溫度多重循環(huán)以擴增許多DNA靶標序列。在雙鏈模板DNA變性之后，利用連接與靶鏈其中之一相鄰區(qū)域互補的兩個(或更多)寡核苷酸引物起始該程序。該結(jié)合/連接的寡核苷酸形成一個由該聚合酶延長的上游”引物”。在第二次變性步驟之后，該原始模板鏈與新形成產(chǎn)物作為提供靶序列指數(shù)擴增的額外連接的模板。在交替溫度多重循環(huán)之后，擴增許多DNA靶序列。
所有上述方法的診斷寡核苷酸具有下列通式a) 5’-Nua(NubLNAc)mNudAeNuf-3’其中A為在位置A的LNA，在此該靶核酸的不同核酸序列彼此不同；LNA為LNA；Nu為選自除可與不同核酸形成特異的堿基配對的LNA以外的任何核苷酸的單體；a、b、c、d與f為0至30的整數(shù)，m為1至8的整數(shù)，e為1至6的整數(shù)，條件是a、b、c、d、e與f的總和至少為5。
此意指優(yōu)選為該診斷寡核苷酸序列的至少一個位置A與待檢測的靶核酸序列位置A互補，但與另一靶核苷序列的位置A不互補。此外，優(yōu)選為該診斷寡核苷酸至少一個位置A為LNA。
延長產(chǎn)物的特異性檢測為量測在樣本中待檢測核酸的量，例如也可利用以一個額外特征區(qū)別寡核苷酸的事實進行此特定檢測。此種特點可例如為一組寡核苷酸的長度變化。延長不同的診斷寡核苷酸，然后產(chǎn)生不同長度的延長產(chǎn)物。也可藉由不同標示區(qū)別該診斷寡核苷酸。此種標記例如為在后續(xù)反應(yīng)中藉由可檢測基團的輔助而可被檢測的彩色或螢光分子或化學基。此類化學基包含例如地高辛(digoxin)與地高辛配基(digoxigenin)的半抗原(hapten)。利用經(jīng)標記的抗體與半抗原反應(yīng)可以檢測半抗原，然后檢測該標記。另一種半抗原可例如為生物素(biotin)，其可利用不同經(jīng)標記的抗體或straptavidin檢測。
本文中，術(shù)語“標記”指通過其本身或作為檢測系列中的一部份而可被檢測的基團報道的基團的官能部分的實例有生物素，地高辛配基，熒光基團(可吸收電磁射線，例如特定波長的光或X-射線，以及接著將所吸收的能量轉(zhuǎn)變成波長較長的輻射的基團；說明性實例為丹酰(5-二甲氨基)-1-萘磺?；?，DOXYL(N-氧基-4，4-二甲基噁唑烷)，PROXYL(N-氧基-2，2，5，5-四甲基吡咯烷)，TEMPO(N-氧基-2，2，6，6，-四甲基哌啶)，二硝基苯基，吖啶，香豆素，Cy3和Cy5(生物檢測系統(tǒng)公司的商標)，原藻紅，香豆酸，繖形酮，德克薩斯紅，若丹明，四甲基若丹明，Rox，7-硝基苯并-2-氧雜-1-二唑(NBD)，芘，螢光黃，銪，釕，釤，和其它稀土金屬)，放射性同位素標記，化學發(fā)光標記(在化學反應(yīng)過程中通過發(fā)出光可檢測到的標記)，自旋標記(自由基(例如取代的有機硝基氧)或其它利用電子自旋共振光譜學可檢測的結(jié)合至生物分子的順磁性的探針(例如Cu2+，Mg2+))，酶(例如過氧化物酶，堿性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，和葡糖氧化酶)，抗原，抗體，半抗原(可與抗體結(jié)合的，但本身不能激活免疫反應(yīng)基團，如肽和類固醇激素，)，細胞膜穿透載體系統(tǒng)如脂肪酸殘基，類固醇部分(膽固醇基)，維生素A，維生素D，維生素E，作為特異性受體的葉酸肽，介導(dǎo)細胞內(nèi)吞作用的基團，表皮生長因子(EGF)，緩激肽，血小板衍生生長因子(PDGF)。特別關(guān)注的實例為生物素，螢光黃，德克薩斯紅，若丹明，二硝基苯基，地高辛配基，釕，釤，Cy5，Cy3等。
用以度量待檢測的核酸的量及核酸存在的不同延長產(chǎn)物可以各種方法檢測?？梢栽诜蛛x該試劑混合物的后或相繼在得到試劑混合物時，根據(jù)已知方法使用適當?shù)臉擞浲瑫r單獨檢測該延長產(chǎn)物。以可檢測基團標記在各寡核苷酸組的單獨寡核苷酸為優(yōu)選，對各單獨寡核苷酸而言，該可檢測基團不同。
已證明EP-A-0324474敘述的方法為利用類固醇荷爾蒙作為記號的優(yōu)選方法。另一種方法為使用不同的螢光染料?？芍苯訕耸驹摴押塑账峄蚩衫缫詫?yīng)的螢光標記賦予在抗體對化學基上。利用同時量測相當于不同寡核苷酸引物的數(shù)個頻道的螢光可檢測各種等位基因產(chǎn)物。并且利用螢光標記可以標示該產(chǎn)物的一部分，反的酶可用于出自該相同試劑混合物的其它產(chǎn)物。原則上，可采用標示與檢測的任何的已知方法。
在連續(xù)或同步檢測中，可以使用兩個不同的化學基，優(yōu)選為利用不同抗體可檢測的半抗原，來標記該兩個寡核苷酸。此種半抗原包含地高辛配基、生物素與螢光素。優(yōu)選地，對螢光素的抗體及對地高辛配基的抗體具有不同酶作為標記。然后通過連續(xù)或同時接觸酶-特異的可檢測底物檢測該核酸。
也可利用捕捉探針使一般延長反應(yīng)的混合物隨后進行變性反應(yīng)，以使該單鏈延長產(chǎn)物鍵合到固定或可經(jīng)由基團(例如生物素)固定的固體相上?；蛘呖深A(yù)先藉由例如蒽醌(anthraquinone)光化學作用(WO 96/31557)將捕捉探針永久地連接到固體相上。在這些方法中，反應(yīng)的延長產(chǎn)物與所有待檢測的核酸固定在一起。由于捕捉探針的特異性，因此可連續(xù)檢測該核酸(藉由清洗步驟分離)。如果在單一容器中可同時產(chǎn)生及檢測到待檢測的信號，則可省略此清洗步驟。
在延長反應(yīng)發(fā)生的后，從該試劑混合物取出不同兩足夠等分試樣的液體(或如果檢測超過兩個等位基因且使用超過兩組特異的引物則取相對更多等份)，檢驗各等分試樣的延長產(chǎn)物。該等分試樣由多重反應(yīng)取得，取決于用于寡核苷酸的不同標記的數(shù)目、在各等分試樣中可檢測的擴增產(chǎn)物的相對數(shù)目。
本發(fā)明方法可應(yīng)用在各種應(yīng)用。例如可由一個單一檢驗對象(個別診斷法)的待檢測核酸找出有關(guān)的某些疾病，例如代謝失調(diào)(metabolic disorders)、致死性疾病(lifestyle diseases)、癌癥或遺傳疾病。致死性疾病的實例為肥胖(obesity)、家族性血膽固醇過多(familial hypercholesterolaemia)、動脈硬化(atherosclerosis)與糖尿病(diabetes)。
含有待檢測的核酸的樣本典型為始生生物、原核生物或真核生物的細胞、組織樣本或組織萃取物。在來自動物如哺乳動物或人類的樣本的情形中，該樣本可以是血液、血清(serum)、血漿(plasma)、網(wǎng)狀細胞(reticulocytes)、淋巴細胞(lymphocytes)、尿、骨髓組織(bone marrow tissue)、腦脊髓液(cerebrospinal fluid)或由血液或淋巴制成的任何產(chǎn)物或任何類型的活組織活組織檢查(biopsy)，如肌肉活組織檢查、肝臟活組織檢查、腎臟活組織檢查、膀胱活組織檢查、骨骼活組織檢查、軟骨活組織檢查、皮膚活組織檢查、胰腺活組織檢查、腸道活組織檢查、胸腺活組織檢查、乳房活組織檢查、子宮活組織檢查、睪丸活組織檢查、眼睛活組織檢查或腦活組織檢查。
此外，由于該方法良好的特異性，該方法也適合進行集合體篩選(pool-screening)的探針檢驗。根據(jù)此原則混合不同檢驗對象的大量個別探針。當診斷出在apo B3500-基因例如與糖尿病、家族性血膽固醇過多、動脈硬化或肥胖有關(guān)缺陷時，已證實在單一集合體(pool)中適合結(jié)合64個探針。利用本發(fā)明方法可確定包含于該集合體中的探針的此缺陷的存在與否。當根據(jù)本發(fā)明方法連續(xù)數(shù)次檢驗來自具有陽性結(jié)果(positive results)集合體的數(shù)個部分集合體時，少數(shù)幾次測定(與現(xiàn)有技術(shù)相比)即足以檢測出具有該缺陷的基因。
在本發(fā)明方法中，已證實對于不具缺陷的基因存在時能同時檢測該基因特別有利。當篩選一集合體時，可交替檢測突變體產(chǎn)物，或如果突變的等位基因不存在時檢測正?；颉１景l(fā)明方法除作為如兩等位基因的檢測反應(yīng)的控制之外，也是量化待檢測核酸的一種工具。
由于用于集合體-篩選法的樣本并非患者特定而是不具名的，因此可將這些方法用于檢驗特別是流行病方面的疾病，例如AIDS病毒的污染率或例如高的膽固醇水平(elevated cholesterol levels)、高血壓或糖尿病(大量篩選)。這些方法可供測定等位基因的頻率。
該相同方法可應(yīng)用在生物體、微生物的特種(species)、亞種(sub-species)或菌株(strain)的檢測或診斷，或特別是細菌傳染病物的特種(species)、亞種(sub-species)或菌株(strain)的檢測或診斷及某些情況下可應(yīng)用在病毒上。特別感興趣的方面集中在密切相關(guān)的致病(pathogenic)/非致病(non-pathogenic)的種或菌株的同步檢測。此外，本發(fā)明方法也適用于可靠檢測，例如經(jīng)由已知AT-序列可靠檢測大腸桿菌K12(根據(jù)基因技術(shù)法評估)，因此可區(qū)別各種標準的大腸桿菌。該方法因此也可以應(yīng)用在環(huán)境狀態(tài)的分析上。
本發(fā)明的一重要主題為含有至少一個LNA的診斷寡核苷酸的用途，該LNA如藉由蒽醌(anthraquinone)光化學作用(WO96/31557)以數(shù)組形式(array format)共價附著到固體表面(Nature Genetics，suppl.vol.21，Jan 1999，1-60)。含有至少一個直接抗不同靶核酸序列的LNA的不同診斷寡核苷酸可以點在數(shù)組的中永久地附在該固體表面。此數(shù)組后續(xù)可進行延長反應(yīng)或PCR。如果該診斷寡核苷酸附著在適當?shù)娘@微鏡載玻片，如經(jīng)表面處理的玻璃或聚碳酸酯載玻片，便可在一市售的PCR加熱循環(huán)器中進行延長反應(yīng)或PCR反應(yīng)。在PCR反應(yīng)后，可利用適當標記檢測陽性點(顯示特定突變體者)。此方法的結(jié)果將為大量不同核酸半定量評估(semi-quantitative assessment)。
本發(fā)明優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的主要優(yōu)點為實際上沒有二級反應(yīng)而可以同步檢測在單一容器所含的混合物中的等位基因化合物。而且不需利用限制酶消化或后續(xù)雜交。藉由LNA寡聚物遵守沃森-克里克堿基配對原則并形成比DNA∶DNA所形成的相似二顯性組合更加穩(wěn)定的二顯性組合，及含有3’位置LNA的引物為PCR反應(yīng)的底物的事實的優(yōu)點而達成此目的。單獨等位基因的擴增過程產(chǎn)生高度辨別能力(交錯反應(yīng))并在相同反應(yīng)容器中發(fā)生數(shù)個反應(yīng)。
本發(fā)明的另一主題為核酸檢測的試劑盒。該試劑盒包括一組本發(fā)明的寡核苷酸及如有需要，額外的寡核苷酸與延長該寡核苷酸所需的佐劑。此外，該試劑盒可包括額外的寡核苷酸，例如互補鏈引物。優(yōu)選地，試劑盒提供了酶、寡核苷酸與其它分離容器中的試劑。
本文中使用的術(shù)語“LNA”或“含LNA的寡核苷酸”是指包含至少一個通式I的核苷類似物的寡聚物及其堿性鹽和酸性加成鹽 其中X選自-O-，-S-，-N(RN*)-，-CR6(R6*)；
B選自核堿基；P指核苷間鍵合至下一單體或5’-端基的游離基位置。，此核苷間鍵合或5’端基任選地包括取代基R5；R3或R3*為P*，其指與前一個單體或3’端基相連的核苷間鍵合；R4*和R2*共同指由1-4個基團/原子組成的雙游離基，所述1-4個基團/原子選自-C(RaRb)-，-C(Ra)＝C(Ra)-，-C(Ra)＝N-，-O-，-Si(Ra)2-，-S-，-SO2-，-N(Ra)-，和＞C＝Z，其中Z選自-O-，-S-，和-N(Ra)-，并且Ra與Rb各自獨立的選自氫，任選取代的C1-12-烷基，任選取代的C2-12-鏈烯基，任選取代的C2-12-炔基，羥基，C1-12-烷氧基，C2-12-烯氧基，羧基，C1-12-烷氧基羰基，C1-12-烷基羰基，甲?；蓟?，芳氧基羰基，芳氧基，芳基羰基，雜芳基，雜芳氧基-羰基，雜芳氧基，雜芳基羰基，氨基，一-和二(C1-6-烷基)氨基，氨基甲?；?，一-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基，氨基-C1-6-烷基-氨基羰基，一-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基，C1-6-烷基-羰基氨基，脲基，C1-6-烷酰氧基，磺酰基(sulphono)，C1-6-烷基磺酰氧基，硝基，疊氮基，亞磺?；?sulphanyl)，C1-6-烷基-硫，鹵素，DNA嵌入劑，光化學活性基，熱化學活性基，螯合基，報道基因(reporter group)和配體，其中芳基和雜芳基可任選地被取代，并且其中兩個雙取代基Ra及Rb共同指任選取代的亞甲基(＝CH2，被如對芳基的任選取代基所定義的取代基任選地取代一或二次)；和存在的但不包含于P或P*中的取代基R1*，R2，R3，R3*，R5，R5*，R6和R6*，各自獨立地選自氫，任選取代的C1-12-烷基，任選取代的C2-12-鏈烯基，任選取代的C2-12-鏈炔基，羥基，C1-12-烷氧基，C2-12-烯氧基，羧基，C1-12-烷氧基羰基，C1-12-烷基羰基，甲?；?，芳基，芳氧基-羰基，芳氧基，芳羰基，雜芳基，雜芳氧基-羰基，雜芳氧基，雜芳基羰基，氨基，一-和二(C1-6-烷基)氨基，氨基甲?；?，一-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基，氨基-C1-6-烷基-氨基羰基，一-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基，C1-6-烷基-羰基氨基，脲基，C1-6-烷酰基氧基，磺酰基，C1-6-烷基磺酰氧基，硝基，疊氮基，亞磺?；珻1-6-烷硫基，鹵素，DNA嵌入劑，光化學活性基，熱化學活性基，螯合基，報道基因，和配體(其中后面的基團可以包括如對取代基B所定義的間隔物)，其中芳基和雜芳基可任選地被取代，其中兩個雙取代基可共同指定為指氧代，硫代，亞氨基，或任選取代的亞甲基，或者可共同形成由1-5個碳原子亞烷基鏈組成的螺旋雙游離基，該亞烷基鏈可選擇性地被一個或多個選自-O-，-S-，和-(NRN)-的雜原子/基團中斷和/或結(jié)束，其中RN選自氫和C1-4-烷基，并且其中兩相鄰(非-雙)取代基可指定生成雙鍵的另外的鍵；和RN*，當其存在且與雙游離基無關(guān)時，選自氫及C1-4-烷基。
本文中使用的術(shù)語”LNA”(鎖定的核苷類似物Locked Nucleoside Analogues)指并入寡聚物的雙-環(huán)核苷類似物(通式I)。
本文中，術(shù)語“核堿基”包含自然產(chǎn)生的核堿基和非-自然產(chǎn)生的核堿基。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知，一些以前認為的“非-自然產(chǎn)生”的核堿基后來在自然界中已發(fā)現(xiàn)。因此，“核堿基”不只包括已知的嘌呤和嘧啶雜環(huán)，也包括雜環(huán)類似物和其互變異構(gòu)物。核堿基的說明性實例是腺嘌呤，鳥嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶，尿嘧啶，嘌呤，黃嘌呤，二氨基嘌呤，8-氧代-N6-甲基腺嘌呤，7-去氮雜黃嘌呤，7-去氮雜鳥嘌呤，N4，N4-橋亞乙基胞嘧啶，N8，N6-橋亞乙基-2，6-二氨基嘌呤，5-甲基胞嘧啶，5-(C3-C5)-炔基胞嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，假異胞嘧啶，2-羥基-5-甲基-4-三偶氮吡啶(triazolopyridine)，異胞嘧啶，異鳥嘌呤，肌苷和詳述于Benner等人的美國專利第5,432,272號中的”非-自然產(chǎn)生”的核堿基。術(shù)語“核堿基”函蓋每一個一種和所有的這些實例及其類似物和互變異構(gòu)體。尤其關(guān)注的核堿基是腺嘌呤，鳥嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶，和尿嘧啶，這些都認為是與人類的治療和診斷應(yīng)用有關(guān)的自然產(chǎn)生的核堿基。
本文中所使用的術(shù)語“DNA嵌入劑”指可插入至DNA或RNA螺旋，二顯性組合或三顯性組合的基團。DNA嵌入劑的官能部分的實例為吖啶，蒽，醌如蒽醌，吲哚，喹啉，異喹啉，二羥基醌，蒽環(huán)素，四環(huán)素，亞甲基藍，蒽環(huán)酮，補骨脂素，香豆素，鹵化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓，dynemicin，金屬復(fù)合物如1，10-菲咯啉-銅，三(4，7-聯(lián)苯基-1，10菲咯啉)釕-鈷-烯二炔如卡開素(calcheamicin)，卟啉，遠端霉素，紡錘菌素，紫羅郡(viologen)，柔紅霉素。尤其值得關(guān)注的實例為吖啶，醌如蒽醌，亞甲基藍，補骨脂素，香豆素，和鹵化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓。
本文中，術(shù)語“光化學活性基”函蓋可經(jīng)受由光輻照引發(fā)的化學反應(yīng)的化合物。關(guān)于此官能團的說明性實例為醌，尤其是6-甲基-1，4-萘醌，蒽醌，萘醌，和1，4-二甲基-蒽醌，二氮雜苯(diazirines)，芳香族氮化物，二苯甲酮，補骨脂素，重氮化合物，和二氮雜苯(diazirino)化合物。
本文中，“熱化學活性基”定義為一官能團，該官能基團可與其它基團由熱化學誘發(fā)而形成共價鍵。熱化學活性基團的官能部分的說明性實例為羧酸、羧酸酯如活性酯、羧酸鹵化物如?；?，?；?，?；?，和?；?、羧酸氮化物、羧酸酰肼、磺酸、磺酸酯、磺酸鹵化物、氨基脲、硫氨基脲、乙醛、酮、伯醇、仲醇、叔醇、苯酚、烷基鹵、硫醇、二硫化物、伯胺、促胺、叔胺、肼、環(huán)氧化物、馬來酰亞胺和硼酸衍生物。
本文中，術(shù)語“螯合基”指含有一個以上的結(jié)合位置且經(jīng)常同時以一個以上的結(jié)合位置與其它分子，原子或離子結(jié)合的分子。螯合基的官能部分的實例為亞氨二乙酸，氨三乙酸，乙二胺四乙酸(EDTA)，氨基膦酸等。
本文中，“配體”意指可與某些物質(zhì)成鍵的化合物。配體可包括官能團如芳基(如苯，吡啶，萘，蒽，和菲)、雜芳基(如噻吩，呋喃，四氫化呋喃，吡啶，二噁烷和嘧啶)、羧酸、羧酸酯、羧酸鹵化物、羧酸氮化物，羧酸酰肼、磺酸、磺酸酯、磺酸鹵化物、氨基脲、硫氨基脲、乙醛、酮、伯醇、仲醇、叔醇、苯酚、烷基鹵、硫醇、二硫化物、伯胺、促胺、叔胺、肼、環(huán)氧化物、馬來酰亞胺、C1-C20烷基，其可選擇地以一個或多個雜原子如氧原子，氮原子和/或硫原子中斷和/或終止，選擇性可含有芳香族或單/多不飽和烴，聚環(huán)氧乙烷如聚乙二醇，寡/聚酰胺如聚-β-丙氨酸，聚甘氨酸，聚賴氨酸，肽，寡/多糖類，寡/聚磷酸酯，毒素，抗生素，細胞毒物，和類固醇及“親和力配體”，即對特定蛋白質(zhì)，抗體，多糖和寡糖，和其它生物分子的位置具有特異性親和力的官能團或生物分子。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員很清楚，以上所提及的特定的有關(guān)DNA嵌入劑，光化學活性基，熱化學活性基，螯合基，報道基因，和配體的實例與討論中的基團的“活性/官能”部分相對應(yīng)。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員更加清楚的是DNA嵌入劑，光化學活性基，熱化學活性基，螯合基，報道基因，和配體典型地以M-K-形式表示，其中M為討論中的基團的“活性/官能”部分，而K為間隔物，通過該間隔物“活性/官能”部分連接到5-或6-元環(huán)上。因此，應(yīng)當理解當B選自DNA嵌入物，光化學活性基，熱化學活性基，螯合基，報道基因和配體時，基團B具有M-K-形式，其中M為DNA嵌入物，光化學活性基團，熱化學活性基團，螯合基，報道基因和配體的各基團的“活性/官能”部分，K為可選擇的包含1-50個原子，優(yōu)選1-30個原子，特別為1-15個原子，在5-或6-元環(huán)與”活性/官能”部分之間的間隔物。
本文中，術(shù)語“間隔物”指熱化學作用和光化學作用的非-活性距離生成基團，該基團用來連接兩個或多個上述定義的類型的不同部分?；诓煌肿拥奶匦园ㄊ杷?，親水性，分子柔順性和長度(例如參見Hermanson等人”固定的親和力配體技術(shù)(Immobilized Affinity Ligand Techiniques)，Academic Press，圣地亞哥，加州(1992)，p.137-ff)來選擇間隔物。一般來說，間隔物的長度小于或等于約400，在一些應(yīng)用上優(yōu)選小于100。因此，該間隔物包括任選用一個或多個雜原子，如氧原子，氮原子和/或硫原子中斷或結(jié)束的碳原子鏈。因此，該間隔物K可以包括一個或多個酰氨，酯，氨基，醚和/或硫醚官能團，和任選的芳香族或單/聚不飽和烴，聚氧乙烯如聚乙二醇，寡/聚酰胺如聚-β-丙氨酸，聚甘氨酸，聚賴氨酸和肽，通常還有寡糖，寡/聚磷酸酯。此外，該間隔物可由其結(jié)合成的單位所組成?？紤]到理想的或必須的基團的“活性/官能”部分的定位和空間取向與5-或6-元環(huán)的關(guān)系，該間隔物的長度可以變化。特別值得關(guān)注的實施方案，該間隔物包括一化學上可劈開的基團。此化學上可劈開的基團的實例包括在還原條件下可劈開的二硫化物基團，由肽酶可劈開的肽的片段等。
變量K指一個單鍵以使所討論的基團的”活性/官能”部分直接連接到5-或6-元環(huán)上。
在一個優(yōu)選實施方案中，通式I和II中的取代基B優(yōu)選選自核堿基，特別選自腺嘌呤，鳥嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶和尿嘧啶。
在寡聚物中(通式I)，P指用于核苷間鍵合的連接至下一單體或5’-端基的游離基位置。第一個可能性適用于當所討論的LNA不是5’-末端“單體”時，而后一可能性適用于當所討論的LNA是5’-末端“單體”。應(yīng)理解(也可由進一步說明如下的核苷間鍵合和5’-端基的定義了解)此核苷間鍵合或5’-端基可包括取代基R5(或同樣適用的取代基R5*)從而與P基團形成一雙鍵。(5’末端指核苷內(nèi)對應(yīng)于核糖部分的5’碳原子的位置)。
另一方面，與前一個單體或3’-端基(P’)相連的核苷間鍵合可源自以取代基R3或R3*之一所定義的位置，優(yōu)選為來自以取代基R3*所定義的位置。(3’-末端指核苷內(nèi)對應(yīng)于核糖部分的3’碳原子的位置)應(yīng)理解到作為R3*(“正?！钡慕Y(jié)構(gòu))或R3(木(xylo)結(jié)構(gòu))的P*基團的取向代表著兩種同樣有趣的可能。已發(fā)現(xiàn)所有“正?！?R3*＝P*)寡聚物和具有“正?！盠NA單體和核苷酸(2-脫氧核苷酸和/或核苷酸)結(jié)合的寡聚物強烈地與DNA，RNA和其它LNA寡聚物雜交(親和力會增加)。目前認為結(jié)合所有-木LNA寡聚物和具有木LNA(R3＝P*)單體的寡聚物和，例如，木核苷酸(核苷酸和/或2-脫氧核苷酸)將引起類似的雜交特性。已顯示出當具有“正?！苯Y(jié)構(gòu)(R3*＝P*)的寡聚物雜交(親和力會增加)至DNA，RNA和其它LNA寡聚物時可引起一反向平行取向的LNA寡聚物。因此要設(shè)想當一具有木結(jié)構(gòu)(R3＝P*)的寡聚物雜交至DNA，RNA或另一LNA時將會引起的平行方向定位取向。
鑒于以上所述，應(yīng)考慮到在寡聚物中“正常”LNAs和木-LNAs(xylo-LNAs)的結(jié)合能夠產(chǎn)生有趣的特性，只要這些不同類型的單體位于區(qū)域中，即使包含至少5個，如至少10個單體(例如木-LNA，木核苷酸等單體)的未中斷區(qū)域被包含至少5個，如至少10個其他的類型(例如“正?！盠NA，“正常”核苷酸等)的單體的未中斷區(qū)域接隨等。此嵌合類型的寡聚物可以，例如用來捕捉核酸。
本文中，術(shù)語“單體”涉及自然產(chǎn)生的核苷酸，非-自然產(chǎn)生的核苷酸，PNAs，LNAs等。因此，“下一個單體”指5’-末端方向的相鄰單體，“前一個單體”指3’-末端方向的相鄰單體。此下一個單體和前一個單體，是以LNA單體的位置為參考的，可為自然產(chǎn)生的核苷酸或非-自然產(chǎn)生的核苷酸，而且甚至為LNA單體。
因此，本文中(可由上述定義衍生而來)，術(shù)語“寡聚物”意指經(jīng)由合并一個或多個LNA(s)修飾的寡核苷酸。
本文中，雙游離基(R2*-R4*)的方向為左-手側(cè)表示具有數(shù)目最小的取代基而右手側(cè)表示具有數(shù)目最大的取代基，因此，當R2*和R4*共同指定為指雙游離基“-O-CH2-”，應(yīng)理解氧原子代表R2*，從而該氧原子，例如連接至R2*的位置，且亞甲基代表R4*。
就合并入寡聚物中LNA(s)的雙游離基(R2*-R4*)的結(jié)構(gòu)的多種有趣的可能而論，相信該雙游離基優(yōu)選選自-(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-，-(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-Y-，-Y-(CR*R*)r+s-Y-，-Y-(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-，-(CR*R*)r+s-，-Y-，-Y-Y-，其中各Y獨立地選自-O-，-S-，-Si(R*)2-，-N(R*)-，＞C＝O，-C(＝O)-N(R*)-，和-N(R*)-C(＝O)-，其中各R*獨立地選自氫，鹵素，疊氮基，氰基，硝基，羥基，巰基，氨基，單-或雙(C1-6-烷基)氨基，任選取代的C1-6-烷氧基，任選取代的C1-6-烷基，DNA嵌入劑，光化學活性基團，熱化學活性基團，螯合基，報道基因，和配體，并且/或者兩相鄰(非雙)R*可共同指定一雙鍵；且r和s各為0-4，條件是r+s的總和為1-4。特別值得關(guān)注的情況是其中雙游離基是選自-Y-，-(CR*R*)r+s-，-(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-，和-y-(CR*R*)r+s-Y-的那些基團，其中r和s各為0-3，條件是r+s的和為1-4。
特別值得關(guān)注的寡聚物是其中寡聚物的至少一個一種LNA的R2*和R4*共同指定選自-O-，-S-，-N(R*)-，-(CR*R*)r+s+1-，-(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-，-(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-，-(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-，-O-(CR*R*)r+s-O-，-S-(CR*R*)r+s-O-，-O-(CR*R*)r+s-S-，-N(R*)-(CR*R*)r+s-O-，-O-(CR*R*)r+s-N(R*)-，-S-(CR*R*)r+s-S-，-N(R*)-(CR*R*)r+s-N(R*)-，-N(R*)-(CR*R*)r+s-S-，和-S-(CR*R*)r+s-N(R*)-的雙游離基。
更優(yōu)選的R*選自氫，羥基，任選取代的C1-6-烷氧基，任選取代的C1-6-烷基，DNA嵌入劑，光化學活性基團，熱化學活性基團，螯合基，報道基因，和配體，并且任何剩余取代基R*為氫。
對一優(yōu)選的變量，至少一個LNA的雙游離基的R*基團選自DNA嵌入劑，光化學活性基團，熱化學活性基團，螯合基，報道基因，和配體(其中后面的基團可包括如對取代基B所定義的間隔物)。
優(yōu)選地，存在的且不含于P或P*中的LNA(s)的取代基R1*，R2，R3，R3*，R5，R6，R6*，各自獨立地選自氫，任選取代的C1-6-烷基，任選取代的C2-6-鏈烯基，羥基，C1-6-烷氧基，C2-6-烯氧基，羧基，C1-5-烷氧羰基，C1-6-烷基羰基，甲酰基，氨基，單-和雙(C1-6-烷基)氨基，氨基甲?；?，單-和雙(C1-6-烷基)-氨基-羰基，C1-6-烷基-羰基氨基，脲基，疊氮基，C1-6-烷酰氧基，磺酰基，亞磺?；?，C1-6-烷硫基，DNA嵌入劑，光化學活性基團，熱化學活性基團，螯合基，報道基因，和配體，和鹵素，其兩個雙取代基可共同指定氧代，且當RN*存在且不為雙游離基時，選自鹵素和C1-4烷基。
在LNAs的優(yōu)選的變量中，X選自-O-，-S-，和-NRN*-，尤其為-O-，并且存在且不含于P或P*中的LNA(s)的各取代基R1*，R2，R3，R3*，R5，R5*，R6和R6*指鹵素。
在更優(yōu)選的變量中，X為O，R2選自氫，羥基，和任選取代的C1-6-烷氧基，R3與R3*之一為P*而另一個為氫，和R1*，R5與R5*指定為指氫，更確切地，該雙游離基(R2*-R4*)選自-O-，-(CH2)0-1-O-(CH2)1-3-，-(CH2)0-1-S-(CH2)1-3-，-(CH2)0-1-N(RN)-(CH2)1-3-，和-(CH2)2-4-，尤其選自-O-CH2-，-S-CH2-，和-NRH-CH2-。一般，由于具有目前獲得的結(jié)果，優(yōu)選地，構(gòu)成R2*和R4*的雙游離基形成兩碳原子橋，亦即雙游離基形成具有呋喃糖環(huán)(X＝O)的五元環(huán)。特別關(guān)注的也為那些寡聚物，其中式I中合并的LNA中的R2*和R4*共同指定為指選自-O-CH2-，-S-CH2-，和-NRH-CH2-的雙游離基；X為O，B指定為指選自腺嘌呤，鳥嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶和尿嘧啶的核堿基；R2為氫，R3或R3*之一指定為指P*，另一個為氫，，R1*，R3，R5，和R5*指定為指氫。
在這些實施方案中，更優(yōu)選的為并入寡聚物中的至少一個LNA包括選自腺嘌呤和鳥嘌呤的核堿基(取代基B)。尤其是，具有LNA并入其中的寡聚物包括至少一個選自胸腺嘧啶，尿嘧啶和胞嘧啶的核堿基和至少一個選自腺嘌呤和鳥嘌呤的核堿基。至于LNA單體，尤其優(yōu)選的為核堿基選自腺嘌呤和鳥嘌呤。
在這些關(guān)注的具體實施方案中，寡核苷酸的所有單體為LNA單體。
由通式I(寡聚物中的LNA(s))和與之相關(guān)的定義，依據(jù)取代基的特性和可能的雙游離基如下所示，寡聚物中可能存在一到數(shù)個不對稱碳原子。
在一個變量中，R3*指定為指P*。在另一個變量中R3指定為指P*，在第三個變量中，在一些LNAs中R3*指定為指P*，在寡聚物中其它的LNAs的R3指定為指P*。
一般的寡聚物包括1-10000個通式I的LNA(s)和0-10000個選自自然產(chǎn)生的核苷和核苷類似物的核苷。核苷酸數(shù)目和LNA(s)數(shù)目的總和至少為2，優(yōu)選至少為3，特別至少為5，尤其至少為7，例如在2-15000的范圍，優(yōu)選在2-100的范圍，如3-100，特別為2-50的范圍，如3-50或5-50或7-50。
在本文中，術(shù)語“核苷”指雜環(huán)堿基的糖苷。術(shù)語“核苷”廣泛的使用于包括非-自然產(chǎn)生的核苷，自然產(chǎn)生的核苷與其它核苷類似物。有關(guān)核苷的說明性的例子為包含核糖部分的核糖核苷和包含脫氧核糖部分的脫氧核糖核苷。關(guān)于該種核苷的堿基，應(yīng)了解其可能為任何自然發(fā)生的堿基例如腺嘌呤，鳥嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶，和尿嘧啶和任何修飾的變體或任何可能的非自然堿基。
當考慮核苷的定義與已知的核苷(自然產(chǎn)生和非-自然產(chǎn)生)和核苷類似物(包括已知的雙-與三環(huán)類似物)時，顯然地，寡聚物可以包括一個或多個LNA(s)(由于所選擇的取代基和所選擇的雙游離基，其可能相同或不同)和一個或多個核苷和/或核苷類似物。本文中“寡核苷酸”指由通過核苷間鍵合所連接的連續(xù)鏈的核苷；然而，應(yīng)理解寡聚物(寡核酸)中一個或多個核苷酸單位(單體)的核堿基可以被上述所定義的取代基B修飾。
如上文所提及，寡聚物的LNA(s)通過核苷間鍵合與其它單體連結(jié)。本文中“核苷間鍵合”指由2到4，優(yōu)選為3個選自-CH2-，-O-，-S-，-N(RH)-，＞C＝O，＞C＝NRH，＞C＝S，-Si(R”)2-，-SO-，-S(O)2-，-P(O)2-，-PO(BH3)-，-P(O，S)-，-P(S)2-，-PO(R”)-，-PO(OCH3)-，和-PO(NHRH)-的基團/原子所組成的鍵合，其中RH選自氫和C1-4-烷基，和R”選自C1-6-烷基和苯基。該種核苷間鍵合的說明性的例子為-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CO-CH2-、-CH2-CHOH-CH2-、O-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-O-CH2-CH＝(當作為與下一個單體的鍵合時包括R5)、-CH2-CH2-O-、-NRH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NRH-、-CH2-NRH-CH2-、-O-CH2-CH2-NRH-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-、-NRH-CS-NRH-、-NRH-C(＝NRH)-NRH-、-NRH-CO-CH2-NRH-、-O-CO-O-、-O-CO-CH2-O-、-O-CH2-CO-O-、-CH2-CO-NRH-、-O-CO-NRH-、NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO--NRH、-O-CH2-CH2-NRH、-CH＝N-O-、-CH2-NRH-O-、-CH2-O-N＝(當作為與下一個單體的連接時包括R5)、-CH2-O-NRH-、-CO-NRH--O-CH2-、-CH2-NRH-O-、-CH2-NRH-CO-、-O-NRH-CH2-、-O-NRH-、-O-CH2-S-、-S-CH2-O-、-CH2-CH2-S-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH＝(當作為對與下一個單體的連接時包括R5)、-S-CH2-CH2-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-S-CH2-、-CH2-SO-CH2-、-CH2-SO2-CH2-、-O-SO-O-、-O-S(O)2-O-、-O-S(O)2-CH2-、-O-S(O)2-NRH-、-NRH-S(O)2-CH2-、-O-S(O)2-CH2-、-O-P(O)2-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O，S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O，S)-S、-O-P(S)2-S-、-S-P(O)2-S-、-S-P(O，S)-S-、-S-P(S)2-S-、-O-PO(R”)-O-、-O-PO(OCH)3-O-、-O-PO(OCH2CH3)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRN)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-O-P(O，NRH)-o-、-CH2-P(O)2-O-、-O-P(O)2-CH2-、和-Si(R”)2-O-、其中優(yōu)選的是-CH2-CO-NRH-、-CH2-NRH-O-、-S-CH2-O-、-O-P(O)2-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)2-O-、-NRH-P(O)2-O-、-O-P(O，NRH)-O-、-O-PO(R”)-O-、-O-PO(CH3)-O-，和-O-PO(NHRN)-O-，其中RH選自氫和C1-4烷基，R’選自C1-6烷基和苯基。Mesmaeker等人的Current Opinion inStructural Biology 1995，5，343-355中進一步提出了說明性的例子。核苷間左手側(cè)的健合與5-元環(huán)以取代基P*結(jié)合，而右手側(cè)與前一個單體的5’-位結(jié)合。
由上述說明很清楚當討論中的LNA為5’-末端的單體時，P基團也可指5’-端基。這種5’-端基的實例有氫、羥基、任選取代的C1-6烷基、任選取代的C1-6烷氧基、任選取代的C1-6烷基羰氧基、任選取代的芳氧基、單磷酸根、雙磷酸根、三磷酸根、和-W-A’-，其中W選自-O-，-S-，和-N(RH)-，而RH選自氫和C1-6烷基，A’選自DNA嵌入物，光化學活性基團，熱化學活性基團，螯合基，報道基因，和配體(其中后面的基團可包含如對取代基B所定義的間隔物)。
于本文的說明和權(quán)利要求中，“單磷酸根”，“雙磷酸根”，和“三磷酸根”分別指下式的基團-O-P(O)2-O-，-O-P(O)2-O-P(O)2-O-，和-O-P(O)2-O-P(O)2-O-P(O)2-O-。
在特別關(guān)注的實施方案中，基團P指定為指選自單磷酸根、雙磷酸根和三磷酸根的5’-端基。尤其關(guān)注的是三磷酸根的變異物作為核酸聚合酶的底物。
相似地，當討論中的LNA為3’-末端的單體時，該P*基團可指定為指3’-端基。這種3’-端基的實例有氫、羥基、任選取代的C1-6-烷氧基、任選取代的C1-6-烷基羰氧基、任選取代的芳氧基、和-W-A’-，其中W選自-O-、-S-和-N(RH)-而，RH選自氫和C1-6-烷基，A’選自DNA嵌入物，光化學活性基團，熱化學活性基團，螯合基，報道基因和配體(其中后面基團可包含如取代基B所定義的間隔物)。
優(yōu)選的LNA(s)的變異物，其寡聚物具有下列通式VG-[Nu-L]n(o)-{[LNA-L]m(q)-[Nu-L]n(q)}q-G*V其中q為1到50；n(0)，.....，n(q)各自獨立地為0到10000；m(1)，.....，m(q)各自獨立地為1到10000；條件是n(0)，.....，n(q)和m(1)，.....，m(q)的總和為2到15000；G指5’-端基；Nu各自獨立地指選自自然產(chǎn)生的核苷和核苷類似物的核苷；LNA各自獨立地指核苷類似物；L各自獨立地指選自Nu和LNA兩基團之間的核苷間鍵合，或L與G*一起指3’-端基；和LNA-L各自獨立地指上述所定義的通式I的核苷類似物。
在該變異物中，一般地，LNAs優(yōu)選包括不同的核堿基，特別是選自胸腺嘧啶，胞嘧啶和尿嘧啶的核堿基和選自腺嘌呤和鳥嘌呤的核堿基。
該寡聚物也打算包括嵌合寡聚物。術(shù)語“嵌合寡聚物”意指兩個或多個寡聚物帶有不同來源直接或由間隔物連接的單體?？山Y(jié)合的該寡聚物說明性的例子有肽，PNA-寡聚物，含有LNAs的寡聚物，和寡核苷酸寡聚物。該具有木-LNA(R3＝P*)區(qū)域和“正?！盠NA(R3*＝P*)區(qū)域的寡聚物的結(jié)合可構(gòu)成作為嵌合寡聚物的例子，因為各個區(qū)域可具有不同的親和性和特異的結(jié)構(gòu)。
一般地，以親和力和特異性而言該寡聚物具有驚人地良好的雜交特性。因此，該寡聚物含有至少一種核苷類似物，該核苷類似物賦予該具有一個互補DNA的寡核苷酸的寡聚物較高的Tm，該Tm比不含有任何核苷類似物的相應(yīng)的未經(jīng)修飾的對照寡核苷酸至少高2.5℃，優(yōu)選為至少高3.5℃，特別則至少高4℃，尤其至少高5℃。尤其是該寡聚物的Tm至少提高2.5×N℃，優(yōu)選為至少提高3.5×N℃，特別則至少提高4×N℃，尤其至少提高5×N℃，其中N為核苷類似物的數(shù)目。
在與互補RNA寡核苷酸的雜交中，至少一種核苷類似物賦予該具有互補DNA寡核酸的寡聚物較高的Tm，該Tm比相應(yīng)的未經(jīng)修飾的不含有任何核苷類似物的對照的寡核苷酸至少高4℃，較佳為至少高5℃，較特別則至少高6℃，尤其至少高7℃。尤其是該寡聚物的Tm至少是提高4×N℃，較佳者為至少提高5×N℃，較特別則至少提高6×N℃，尤其至少提高7×N℃，其中N為核苷類似物的數(shù)目。
術(shù)語“相應(yīng)的未經(jīng)修飾的對照寡核苷酸”指寡核苷酸只包括自然產(chǎn)生的核苷酸，其在相同的絕對順序(和相同的方向)表示相同的核堿基。
該Tm在下列條件之一下測得a)10mM Na2HPO4，pH7.0，100mM NaCl，0.1mM EDTA；b)10mM Na2HPO4，pH7.0，0.1mM EDTA；或c)3M四甲基氯化銨(TMAC)，10mM Na2HPO4，pH7.0，0.1mM EDTA；優(yōu)選a)條件，等摩爾量(一般為1.0μM)的寡聚物和互補DNA寡核苷酸。
該寡聚物優(yōu)選如上所定義，至少一種核苷類似物具有通式I，其中B為核堿基。特別有趣的是至少一種核苷類似物包括選自腺嘌呤和鳥嘌呤的核堿基的情況。
再者，有關(guān)特異性和親和力，當該寡聚物與部份互補的DNA寡核苷酸雜交或與部份互補RNA寡核苷酸雜交時，含有一個或多個與該寡聚物錯誤的配對，將因該錯誤的配對而呈現(xiàn)出Tm減少，該結(jié)果系相等或大于相應(yīng)的未含有任何核苷類似物的未經(jīng)修飾的對照核苷酸其所觀察到Tm的減少。同樣地，該寡聚物對雜交緩沖液中離子強度與相應(yīng)的未經(jīng)修飾的對照核苷酸一樣具有相同的Tm敏感性。
這里所定義的寡聚物為通常至少有1％經(jīng)過修飾，如至少2％經(jīng)過修飾，例如3％經(jīng)過修飾，4％經(jīng)過修飾，5％經(jīng)過修飾，6％經(jīng)過修飾，7％經(jīng)過修飾，8％經(jīng)過修飾，或9％經(jīng)過修飾，至少10％經(jīng)過修飾，例如至少11％經(jīng)過修飾，例如12％經(jīng)過修飾，13％經(jīng)過修飾，14％經(jīng)過修飾，或15％經(jīng)過修飾，至少20％經(jīng)過修飾，例如至少30％經(jīng)過修飾，至少50％經(jīng)過修飾，例如70％經(jīng)過修飾，和在一些有趣的應(yīng)用中100％經(jīng)過修飾。
優(yōu)選寡聚物比相應(yīng)的未經(jīng)修飾的對照寡核苷酸具有更高的3’-核外分解穩(wěn)定性。應(yīng)了解該寡聚物(其中LNAs被并入的)和LNAs包括其鹽類，其中藥理學上可接受鹽類尤其重要。鹽類包括酸加成鹽和堿性鹽。例如，酸加成鹽的實例有鹽酸鹽，鈉鹽，鈣鹽，鉀鹽等。堿性鹽的例子是這樣的鹽，其中(殘余)相反離子選自堿金屬，如鈉和鉀，堿土金屬，如鈣，和銨離子(+N(Rg)3Rh，其中各個Rg和Rh獨立地指任選取代的C1-6-烷基，任選取代的C2-6-鏈烯基，任選取代的芳基，或任選取代的的雜芳基)。藥理學上可接受鹽為，例如詳述于Remington’s Pharmaceutically Science，17.Ed.Alfonso R.Gennaro(Ed.)，Mack Publishing Company，Easton，PA，U.SA.，1985和較近版本和于Encyclopedia of Pharmaceutical Technology中的那些。因此，這里所用的短語“其酸加成鹽或堿性鹽”包含該種鹽類。再者，該寡聚物、LNAs和任何中間產(chǎn)物或起始物都可以水合物形式存在。
利用PCR擴增部分含有ApoB3500基因座的野生型人類ApoB基因(Ludwig etal.(1987)DNA 6363-372；accession no.M19828，SEQ ID ON 4)產(chǎn)生ApoB基因的“G-等位基因”。利用TOPOTMTA Cloning試劑盒(美國，加州，Carisbad，Invitrogen公司，Invitrogen，序號K4500-01)將該PCR片段克隆到質(zhì)粒pCR2.1-TOPO上。利用QUIAGEN質(zhì)粒試劑盒(德國，Hilden，QIAGEN德國)從細菌培養(yǎng)中純化質(zhì)粒DNA。利用ALFexpress II DNA分析系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biotech)并緊接著依照制造商的建議步驟，藉由DNA排序證實插入的DNA序列。PCR擴增利用Hybaid PCR Express加熱循環(huán)器(英國，Middlesex，Hybaid)在0.5毫升的薄壁試管中進行PCR反應(yīng)。該dNTP來自瑞典，Uppsala，Amersham PharmaciaBiotech AB。最終試劑混合物的組成如下dATP、dGTP、dTTP、dCTP各200μM1.5mM MgCl25μL 10×GeneAmp PCR緩沖液(美國，康內(nèi)得肯州，Norwalk，Perkin-Elmer公司)1μM引物EQ3053，SEQ ID NO 11μM引物EQ3054，SEQ ID NO 21單位AmpliTaq Gold聚合酶(美國，康內(nèi)得肯州，Norwalk，Perkin-Elmer公司，Perkin Elmer序號N808-0240)2μL在連續(xù)稀釋中的DNA模板，參見


圖150μL總體積熱循環(huán)變性 95℃15分鐘循環(huán) 35次(在94℃30秒；在63℃30秒；在72℃30秒)最終延長 10分鐘72℃冷卻至4℃延長產(chǎn)物的檢測10μL PCR產(chǎn)物隨后與2μL應(yīng)用緩沖液(40％蔗糖，0.25％溴苯酚藍，0.25％二甲苯苯胺(xylene cyanol)，0.1M EDTA pH8.0)混合，并且在瓊酯糖凝膠(agarosegel)中電泳。該凝膠由1％SeaKem、1×TAE中瓊酯糖(美國，賓州，費城，F(xiàn)MCBioProducts公司)、0.5μg/mL溴苯酚藍(丹麥，Vallensbaek Strand，Sigma-Aldrich丹麥A/S，Sigma-Aldrich序號E7637)(50×TAE＝242克Tris堿基，57.1毫升冰醋酸，100毫升0.5M EDTA pH8.0)組成。該凝膠在大約5V/cm電壓下0.5至1小時。利用Image-Master VDS設(shè)備(瑞典，Uppsala，Amersham Pharmacia Biotech AB)拍攝螢光。典型實驗示于
圖1。
為了證實具有LNA單體的PCR引物中的3’-末端取代基是否可提供等位基因特異的擴增，用兩組引物EQ3053/ApoBR2與EQ3054/ApoBR2擴增DNA模板。只要使用ApoB基因(SEQ ID NO 4)的“G-等位基因”作為模板，則該引物組EQ3053/ApoBR2(SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 3)會產(chǎn)生667bp PCR，而當使用30.4毫微克(ng)或更少的ApoB基因的“A-等位基因”(SEQ ID NO 5)作為模板時，該EQ3053/ApoBR2引物組不會生成任何特異的PCR產(chǎn)物。結(jié)果示于
圖1。EQ3053(SEQ ID NO 1)5’-CCT ACT TGA ATT CCA AGA GCA CAC GLNA-3’EQ3054(SEQ ID NO 2)5’-CCT ACT TGA ATT CCA AGA GCA CAC ALNA-3’ApoBR2(SEQ ID NO 3)5’-TTT AGA TCA TTT AGT TTC AGC CC-3’ApoB基因(SEQ ID NO 4)的“G-等位基因”5’-CTTACTTGAA TTCCAAGAGC ACACGGTCTT CAGTGAAGCT GCAGGGCAAT-3’ApoB基因的“A-等位基因”(SEQ ID NO 5)5’-CTTACTTGAA TTCCAAGAGC ACACAGTCTT CAGTGAAGCT GCAGGGCAAT-3’
為了證實具有LNA引物的PCR的多用途，已建立能正向鑒定ApoB R3500Q多型性的“G-等位基因”和“A-等位基因”的兩等位基因特異的PCR。引物的合成與分析主要如實施例1所述進行LNA引物的合成與分析。由商業(yè)來源(丹麥，Aarthus，DNA Technology)獲得如經(jīng)HPLC純化寡體的下游DNA引物。樣本制備如實施例1所述利用PCR擴增部分含有ApoB3500基因座的野生型人類ApoB基因產(chǎn)生該ApoB基因的“G-等位基因”。利用在氨基酸3500于PCR擴增部分含有ApoB3500基因座(SEQ ID NO 4)的野生型人類ApoB基因的過程中引起寡核苷酸導(dǎo)入的單一堿基突變(G A突變)。通過在PCR反應(yīng)中并入3DNA寡體、兩擴增寡體與涵蓋欲突變部位的一個寡體獲得寡核苷酸指導(dǎo)的單一堿基突變，此寡體在產(chǎn)生突變處含有一個錯配。在圖2中說明此原則。利用TOPOTMTA Cloning試劑盒(美國，加州，Carisbad，Invitrogen公司，Invitrogen，序號K4500-01)將該PCR片段克隆到質(zhì)粒pCR2.1-TOPO。利用QUIAGEN質(zhì)粒試劑盒(德國，Hilden，QIAGEN德國)從克隆的細菌培養(yǎng)中純化質(zhì)粒DNA。然后利用ALFexpress II DNA分析系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biotech)并緊接著依照制造商的建議步驟，藉由DNA排序?qū)Υ嬖诘乃Ｍ耐蛔兒Y選質(zhì)粒制劑。PCR擴增利用Eppendorf Mastercycler Gradient加熱循環(huán)器(德國，漢堡，Eppendorf-Netheler-Hinz德國)在0.5毫升的薄壁試管進行PCR反應(yīng)。該dNTP來自瑞典，Uppsala，Amersham Pharmacia Biotech AB。最終試劑混合物組成如下人類ApoB3500基因座的野生型(G-等位基因)檢測方法dATP、dGTP、dTTP、dCTP各200μM1.5mMMgCl25μL 10×GeneAmp PCR緩沖液(美國，康內(nèi)得肯州，Norwalk，Perkin-Elmer公司)1μM引物EQ3053，SEQ ID NO 11μM引物EQ3213，SEQ ID NO 61單位AmpliTaq Gold聚合酶(美國，康內(nèi)得肯州，Norwalk，Perkin-Elmer公司，Perkin Elmer序號N808-0240)2μLDNA模板(約50ng質(zhì)粒/μL)。50μL總體積利用PCR擴增產(chǎn)生人類ApoB基因“G-等位基因”與“A-等位基因”并且使用克隆的質(zhì)粒pCR2.1-TOPO。熱循環(huán)變性 95℃15分鐘循環(huán) 35次(在94℃30秒；在55℃30秒；在72℃30秒)最終延長 10分鐘72℃冷卻至4℃檢測隨后利用標準的瓊酯糖凝膠電泳(參見實施例1)分析PCR產(chǎn)物。不同的僅是2％瓊酯糖并利用GelStar(美國，緬因州，Rockland，F(xiàn)MC BioProducts)以1∶30.000稀釋在凝膠中著色。該塊存有永久紀錄的凝膠利用一合適的UV-透照器(ModelTM-20E UV Product，Upland，CA，USA)以及濾光鏡(Kodak Wratten#9 EastmanKodak Co.，Rochester，NY，USA)拍照。人類ApoB3500基因座的突變型(A-等位基因)檢測程序dATP、dGTP、dTTP、dCTP各200μM1.5mM MgCl25μL10×GeneAmp PCR緩沖液(美國，康內(nèi)得肯州，Norwalk，Perkin-Elmer公司)1μM引物EQ3157，SEQ ID NO 71μM引物EQ3176，SEQ ID NO 81單位AmpliTaq Gold聚合酶(美國，康內(nèi)得肯州，Norwalk，Perkin-Elmer公司，Perkin Elmer序號N808-0240)2μLDNA模板(約50ng質(zhì)粒/μL)。50μL總體積利用PCR擴增產(chǎn)生人類ApoB基因“G-等位基因”與“A-等位基因”并使用克隆的質(zhì)粒pCR2.1-TOPO。熱循環(huán)變性 95℃15分鐘循環(huán) 35次(在94℃30秒；在67℃30秒；在72℃30秒)最終延長 10分鐘72℃冷卻至4℃檢測隨后利用標準的瓊酯糖凝膠電泳(參見實施例1)分析PCR產(chǎn)物。不同的僅是2％瓊酯糖并利用GelStar(美國，緬因州，Rockland，F(xiàn)MC BioProducts)以1∶30.000稀釋在凝膠中著色。該塊存有永久紀錄的凝膠利用一合適的UV-透照器(ModelTM-20E UV Product，Upland，CA，USA)以及濾光鏡(Kodak Wratten#9 EastmanKodak Co.，Rochester，NY，USA)拍照。結(jié)果顯示具有LNA單體的PCR引物中的3’-末端取代基能提供等位基因特異的擴增DNA模板，該模板含有借助兩組引物EQ3053/EQ3213與EQ3157/EQ3176擴增的人類ApoB的“G-等位基因”和“A-等位基因”。EQ3053(SEQ ID NO 1)5’-CCT ACT TGA ATT CCA AGA GCA CAC GLNA-3’EQ3123(SEQ ID NO 6)5’-GTT TTT CGT ACT GTG CTC CCA GAG-3’EQ3157(SEQ ID NO 7)5’-CCC TGC AGC TTC ACT GAA GAC TLNA-3’EQ3176(SEQ ID NO 8)5’-CAC CTC TTA CTT TTC CAT TGA GT-3’ApoB基因(SEQ ID NO 4)的“G-等位基因”5’-CTTACTTGAA TTCCAAGAGC ACACGGTCTT CAGTGAAGCT GCAGGGCAAT-3’ApoB基因的“A-等位基因”(SEQ ID NO 5)5’-CTTACTTGAA TTCCAAGAGC ACACAGTCTT CAGTGAAGCT GCAGGGCAAT-3’只要使用ApoB基因(SEQ ID NO 4)的“G-等位基因”作為模板，則該引物組EQ3053/EQ3213(SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 6)會產(chǎn)生153bp PCR，而當使用ApoB基因的“A-等位基因”(SEQ ID NO 5)作為模板時，該引物組不會生成任何特異的PCR產(chǎn)物。參見圖3。
如使用ApoB基因的“突變體”或“A-等位基因”(SEQ ID NO 5)作為模板，則該引物組EQ3157/EQ3176(SEQ ID NO 7，SEQ ID NO 8)會產(chǎn)生145bp PCR，而當使用ApoB基因(SEQ ID NO 4)的“野生型”或“G-等位基因”作為模板時，該引物組不會生成任何特異的PCR產(chǎn)物。參見圖3。注意兩引物組EQ3053/EQ3213與EQ3157/EQ3176是指向模板分子的不同鏈。
一個反應(yīng)如實施例2所述為利用LNA引物EQ3053檢測人類ApoB3500基因座的野生型(G-等位基因)的反應(yīng)。
另一個反應(yīng)類似，但以使用用具有類似EQ3053的DNA引物代替使用LNA引物EQ3053。引物的合成與分析主要如實施例l所述進行LNA引物的合成與分析。由商業(yè)來源(丹麥，Aarthus，DNA Technology)獲得如經(jīng)HPLC純化寡體的下游DNA引物。PCR擴增利用Eppendorf Mastercycler Gradient加熱循環(huán)器(德國，漢堡，Eppendorf-Netheler-Hinz德國)在0.5毫升的薄壁試管進行PCR反應(yīng)。該dNTP來自瑞典，Uppsala，Amersham Pharmacia Biotech AB。最終試劑混合物組成如下利用LNA引物的反應(yīng)含有1μM引物EQ3053(SEQ ID NO 1)及1μM引物EQ3213(SEQ ID NO 6)。
利用DNA引物的反應(yīng)含有1μM引物EQ3647(SEQ ID NO 9)及1μM引物EQ3213(SEQ ID NO 6)。
利用LNA與DNA反應(yīng)在其它方面完全相同，為dATP、dGTP、dTTP、dCTP各200μM1.5mM MgCl25μL 10×GeneAmp PCR緩沖液(美國，康內(nèi)得肯州，Norwalk，Perkin-Elmer公司)1單位AmpliTaq Gold聚合酶(美國，康內(nèi)得肯州，Norwalk，Perkin-Elmer公司，Perkin Elmer序號N808-0240)2μLDNA模板(約50ng質(zhì)粒/μL)。50μL總體積人類ApoB基因的“G-等位基因”與“A-等位基因”兩個模板為實施例2所述的質(zhì)粒。熱循環(huán)變性95C15分鐘循環(huán)35次(在94℃30秒；在55℃30秒；在72℃30秒)最終延長10分鐘72℃冷卻至4℃檢測隨后利用標準的瓊酯糖凝膠電泳(參見實施例1)在％瓊酯糖中并如實施例2所述利用GelStar(美國，緬因州，Rockland，F(xiàn)MC BioProducts)著色分析PCR產(chǎn)物。2。最后該凝膠如實施例2所述方式拍照。結(jié)果如圖4所見，當使用ApoB基因(SEQ ID NO 4)的“G-等位基因”作為模板，該引物組EQ3053/EQ3213(SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 6)會產(chǎn)生153bp PCR產(chǎn)物，而當使用ApoB基因的“A-等位基因”(SEQ ID NO 5)作為模板時，該引物組不會生成任何特定PCR產(chǎn)物-參見圖4。EQ3053(SEQ ID NO 1)5’-CCT ACT TGA ATT CCA AGA GCA CAC GLNA-3’EQ3123(SEQ ID NO 6)5’-GTT TTT CGT ACT GTG CTC CCA GAG-3’ApoB基因(SEQ ID NO 4)的“G-等位基因”5’-CTTACTTGAA TTCCAAGAGC ACACGGTCTT CAGTGAAGCT GCAGGGCACT-3’ApoB基因的“A-等位基因”(SEQ ID NO 5)5’-CTTACTTGAA TTCCAAGAGC ACACAGTCTT CAGTGAAGCT GCAGGGCACT-3’當使用“G-等位基因”或“A-等位基因”兩者作為模板，該所有DNA引物組EQ3647/EQ3213(SEQ ID NO 9，SEQ ID NO 6)會產(chǎn)生153bp PCR-參見圖4。EQ3647(SEQ ID NO 9)5’-CCT ACT TGA ATT CCA AGA GCA CAC G-3’EQ3123(SEQ ID NO 6)5’-GTT TTT CGT ACT GTG CTC CCA GAG-3’我們推斷LNA引物而非相似的DNA引物能檢測ApoB R3500Q突變的單一堿基變異。
為了說明具有LNA引物的PCR的靈活性，在光循環(huán)器(LightCycler)(德國，幕尼黑，Roche Diagnostics德國)上建立一個等位基因特異的PCR。光循環(huán)器為一種裝置，該裝置在單一操作中利用Tm量測可以擴增及鑒定所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物。
能正向辨別人類ApoB R3500Q多型性的“G-等位基因”的反應(yīng)如下引物的合成與分析主要如實施例1所述進行LNA引物的合成與分析。由商業(yè)來源(丹麥，Aarthus，DNA Technology)獲得如經(jīng)HPLC純化寡體的下游DNA引物。PCR擴增利用該光循環(huán)器并緊接著依照制造商的建議步驟在硼硅酸玻璃毛細管內(nèi)進行PCR反應(yīng)。各反應(yīng)含有2μL的光循環(huán)器-DNA主SyBR Green I混合物(德國，幕尼黑，RocheDiagnostics德國)。該主混合物含有核苷酸、PCR緩沖液、SyBR Green與Taq聚合酶。1μLDNA模板(約50ng質(zhì)粒/μL)。1μM引物EQ3053(SEQ ID NO 1)及1μM引物EQ3213(SEQ ID NO 6)3mM MgCl220μL總體積加入“G-等位基因”或“A-等位基因”質(zhì)粒作為模板。人類ApoB基因的“G-等位基因”與“A-等位基因”兩個模板為實施例2所述的質(zhì)粒。熱循環(huán)變性 95℃2分鐘，20℃/秒循環(huán) 44次(設(shè)定在95℃0秒；在55℃5秒；在72℃7秒)Tm量測第1段95℃，0秒，設(shè)定。第2段65℃，10秒。第3段95℃，0秒，設(shè)定0.1℃/秒連續(xù)量測。冷卻40℃，30秒。結(jié)果該引物組EQ3053/EQ3213(SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 6)明確地擴增“G-等位基因”，而當使用“A-等位基因”作為模板時，僅觀察到極少的PCR產(chǎn)物-參見圖5。
如圖6所見該引物組EQ3053/EQ3213生成具有確定Tm為82℃的PCR產(chǎn)物。
我們推斷EQ3053/EQ3213引物組能在光循環(huán)器中作為等位基因特異的擴增之用。
序列表<110>?？宋鲙焖脊?amp;lt;120>利用特異性LNA-引物檢測基因突變<130>22601PC1<160>9<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物 EQ 3053<221>modified base<222>(25)...(25)<223>G LNA<400>1cctacttgaa ttccaagagc acacg 25<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物EQ3054<221>modified base<222>(25)...(25)<223>A LNA<400>2cctacttgaa ttccaagagc acaca 25<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物 ApoBR2<400>3tttagatcat ttagtttcag ccc 23<210>4<211>50<212>DNA<213>人
<400>4cttacttgaa ttccaagagc acacggtctt cagtgaagct gcagggcact50<210>5<211>50<212>DNA<213>人<400>5cttacttgaa ttccaagagc acacagtctt cagtgaagct gcagggcact50<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物 EQ3213<400>6gtttttcgta ctgtgctccc agag24<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物 EQ3157<221>modified base<222>(22)...(22)<223>T LNA<400>7ccctgcagct tcactgaaga ct22<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物 EQ3176<400>8cacctcttac ttttccattg agt 23<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物 EQ3647<400>9cctacttgaa ttccaagagc acacg 2權(quán)利要求
1.一種檢測樣本中核酸Q’存在的方法，該核酸Q’的核苷酸序列與核酸Q在至少一個位置A不同，該方法包括下列步驟a)將存在于樣本中的核酸與適量的核苷三磷酸鹽、用于核苷三磷酸鹽聚合的試劑及至少一個診斷的寡核苷酸結(jié)合，該診斷的寡核苷酸在位置A含有核苷酸，該核苷酸在雜交條件下能與核酸Q’位置A的核苷酸雜交，但不與核酸Q位置A的核苷酸雜交，該至少一個診斷的寡核苷酸含有至少一個LNA，b)延長任何與樣本中核酸雜交的寡核苷酸，以形成延長產(chǎn)物，其中該核酸用作模板，c)檢測任何在步驟b)所形成的核酸并因此檢測樣本中核酸Q’的存在。
2.一種檢測樣本中核酸Q’存在的方法，該核酸Q’的核苷酸序列與核酸Q在至少一個位置A不同，該方法包括下列步驟a)將存在于樣本中的核酸與適量的核苷三磷酸鹽、用于核苷三磷酸鹽聚合的試劑及至少一個診斷的寡核苷酸結(jié)合，該診斷的寡核苷酸在位置A含有核苷酸，該核苷酸在雜交條件下能與核酸Q’位置A的核苷酸雜交，但不與核酸Q位置A的核苷酸雜交，該至少一個診斷的寡核苷酸含有至少一個LNA，b)延長任何與樣本中核酸雜交的寡核苷酸，以形成延長產(chǎn)物，其中該核酸用作模板，c)形成延長產(chǎn)物之后，在變性條件下處理反應(yīng)混合物從模板分離延長產(chǎn)物，d)在適量核苷三磷酸鹽及用于核苷三磷酸鹽聚合的試劑存在下，使步驟c)的單鏈核酸與至少一個診斷的寡核苷酸雜交，該診斷的寡核苷酸在位置A含有核苷酸，該核苷酸在雜交條件下能與核酸Q’位置A的核苷酸雜交，但不與核酸Q位置A的核苷酸雜交，該至少一個診斷的寡核苷酸含有至少一個LNA，e)重復(fù)步驟c)至d)足夠次數(shù)以產(chǎn)生可檢測的延長產(chǎn)物，f)檢測形成的延長產(chǎn)物。
3.一種檢測樣本中核酸Q’存在的方法，該核酸Q’的核苷酸序列與核酸Q在至少一個位置A不同，該方法包括下列步驟a)將核酸與適量的核苷三磷酸鹽、用于核苷三磷酸鹽聚合的試劑、至少一個下游寡核苷酸及至少一個診斷的寡核苷酸結(jié)合，該診斷的寡核苷酸在位置A含有核苷酸，該核苷酸在雜交條件下能與核酸Q’位置A的核苷酸雜交，但不與核酸Q位置A的核苷酸雜交，該至少一個診斷的寡核苷酸含有至少一個LNA，b)延長任何雜交到該核酸的寡核苷酸以形成延長產(chǎn)物，其中該核酸用作模板，c)形成延長產(chǎn)物之后，在變性條件下處理反應(yīng)混合物從模板分離延長產(chǎn)物，d)在適量核苷三磷酸鹽及用于核苷三磷酸鹽聚合的試劑存在下，使步驟c)的單鏈核酸與至少一個下游寡核苷酸及至少一個診斷的寡核苷酸雜交，該寡核苷酸在位置A含有核苷酸，該核苷酸在雜交條件下能與核酸Q’位置A的核苷酸雜交，但不與核酸Q位置A的核苷酸雜交，該至少一個診斷的寡核苷酸含有至少一個LNA，e)重復(fù)步驟c)至d)足夠次數(shù)以產(chǎn)生可檢測的延長產(chǎn)物，f)檢測形成的延長產(chǎn)物。
4.一種檢測靶核酸的方法，該靶核酸的核苷酸序列彼此在至少一個位置A不同，該方法包括下列步驟a)在雜交條件下，將核酸與適量的核苷三磷酸鹽、用于核苷三磷酸鹽聚合的試劑及至少一組診斷的寡核苷酸結(jié)合，該至少一組寡核苷酸具有在至少一個位置A彼此不同的核苷酸序列并含有至少一個LNA，b)延長任何與該核酸雜交的寡核苷酸，以形成延長產(chǎn)物，其中該核酸用作模板，c)檢測步驟b)形成的核酸。
5.一種檢測靶核酸的方法，該靶核酸的核苷酸序列彼此在至少一個位置A不同，該方法包括下列步驟a)在雜交條件下，結(jié)合該核酸與適量的核苷三磷酸鹽、用于核苷三磷酸鹽聚合的試劑及至少一組診斷的寡核苷酸，該至少一組寡核苷酸具有在至少一個位置A彼此不同的核苷酸序列并含有至少一個LNA，b)延長任何雜交到該核酸的寡核苷酸以形成延長產(chǎn)物，其中該核酸用作模板，c)形成延長產(chǎn)物之后，在變性條件下處理反應(yīng)混合物從模板分離延長產(chǎn)物，d)在適量核苷三磷酸鹽及用于核苷三磷酸鹽聚合的試劑存在下，雜交步驟c)的單鏈核酸與至少一組診斷的寡核苷酸以合成進一步的延長產(chǎn)物，該組診斷的寡核苷酸的核苷酸序列彼此在至少一個位置A不同，e)重復(fù)步驟c)至d)足夠次數(shù)以產(chǎn)生可檢測量的延長產(chǎn)物，f)檢測形成的延長產(chǎn)物。
6.一種檢測靶核酸的方法，該靶核酸的核苷酸序列彼此在至少一個位置A不同，該方法包括下列步驟a)在雜交條件下，使核酸與適量的核苷三磷酸鹽、用于核苷三磷酸鹽聚合的試劑、至少一個下游寡核苷酸及至少一組診斷的寡核苷酸結(jié)合，該至少一組診斷的寡核苷酸具有在至少一個位置A彼此不同的核苷酸序列，并且含有至少一個LNA，b)延長任何雜交到該核酸的寡核苷酸以形成延長產(chǎn)物，其中該核酸用作模板，c)形成延長產(chǎn)物之后，在變性條件下處理反應(yīng)混合物從模板分離延長產(chǎn)物，d)在適量核苷三磷酸鹽及用于核苷三磷酸鹽聚合的試劑存在下，使步驟c)的單鏈核酸與至少一個下游寡核苷酸及至少一組診斷的寡核苷酸雜交以合成進一步的延長產(chǎn)物，該組診斷的寡核苷酸的核苷酸序列彼此在至少一個位置A不同，e)重復(fù)步驟c)至d)足夠次數(shù)以產(chǎn)生可檢測量的延長產(chǎn)物，f)檢測形成的延長產(chǎn)物。
7.一種檢測靶核酸的方法，該靶核酸的核苷酸序列彼此在至少一個位置A不同，該方法包括下列步驟a)在雜交條件下，使該核酸與適量的核苷三磷酸鹽、至少兩個寡核苷酸以及用于寡核苷酸連接的試劑結(jié)合，其中至少一個所述的寡核苷酸為診斷寡核苷酸，該至少一個診斷寡核苷酸為在位置A含有核苷酸的寡核苷酸，所述核苷酸與待檢測的靶核酸位置A的核苷酸互補，該診斷寡核苷酸含有至少一個LNA，b)連接任何在相鄰位置雜交到該核酸的寡核苷酸以形成連接產(chǎn)物，其中該核酸用作模板，c)檢測步驟b)形成的核酸。
8.一種檢測靶核酸的方法，該靶核酸的核苷酸序列彼此在至少一個位置A不同，該方法包括下列步驟a)在雜交條件下，使該核酸與適量的核苷三磷酸鹽、至少兩個寡核苷酸以及用于寡核苷酸連接的試劑結(jié)合，其中至少一個該寡核苷酸為診斷寡核苷酸，該至少一個診斷寡核苷酸為在位置A含有核苷酸的寡核苷酸，該核苷酸與待檢測的靶核酸位置A的核苷酸互補，該診斷寡核苷酸含有至少一個LNA，b)連接任何在相鄰位置雜交到該核酸的寡核苷酸以形成連接產(chǎn)物，其中該核酸用作模板，c)在連接之后，在變性條件下處理反應(yīng)混合物從模板分離連接產(chǎn)物，d)在適量核苷三磷酸鹽及用于寡核苷酸連接的試劑存在下，使步驟c)的單鏈核酸與至少一個與步驟b)連接產(chǎn)物互補的寡核苷酸及至少兩個寡核苷酸雜交，該至少一個診斷寡核苷酸為在位置A含有核苷酸的寡核苷酸，該核苷酸與待檢測的靶核酸位置A的核苷酸互補，該診斷寡核苷酸含有至少一個LNA，e)重復(fù)步驟c)至d)足夠次數(shù)以產(chǎn)生可檢測量的連接產(chǎn)物，f)檢測形成的連接產(chǎn)物。
9.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中該診斷寡核苷酸序列至少一個位置A與待檢測的核酸序列的位置A互補，但與其它核酸序列的位置A不互補。
10.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中在該診斷寡核苷酸至少一個位置A的核苷酸為LNA。
11.如權(quán)利要求1至10中任一項所述的方法，其中該診斷寡核苷酸具有如下通式a) 5’-Nua(NubLNAc)mNudAeNuf-3’其中A為在位置A的LNA，在此該靶核酸的不同核酸序列彼此不同；LNA為LNA；Nu為選自除可與不同核酸形成特異的堿基配對的LNA以外的任何核苷酸的單體；a、b、c、d與f為0至30的整數(shù)，m為1至8的整數(shù)，e為1至6的整數(shù)，條件是a、b、c、d、e與f的總和至少為5。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中在通式a的a＝10，b＝0，c＝4，d＝8，e＝1，f＝0，m＝0。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中在通式a的a＝0，b＝1，c＝1，d＝8，e＝1，f＝0，m＝5。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其中在通式a的a＝10-30，b＝0，c＝0，d＝0，e＝1-4，f＝1-8，m＝0。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其中在通式a的a＝10-30，b＝0，c＝0，d＝0，e＝1-4，f＝1，m＝0。
16.如權(quán)利要求11所述的方法，其中在通式a的a＝10-30，b＝0，c＝0，d＝0，e＝1-4，f＝0，m＝0。
17.如權(quán)利要求11所述的方法，其中在通式a的a＝10-30，b＝0，c＝0，d＝0，e＝1，f＝0，m＝0。
18.如權(quán)利要求11所述的方法，其中在通式a的a＝10，b＝0，c＝0，d＝0，e＝4，f＝8，m＝0。
19.如權(quán)利要求11所述的方法，其中在通式a的a＝24，b＝0，c＝0，d＝0，e＝1，f＝0，m＝0。
20.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中該至少一個診斷寡核苷酸被共價地附著至一固體支持體上。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中該不同的診斷寡核苷酸在固體表面上點成數(shù)組形式。
22.如權(quán)利要求1至19中任一項所述的方法，其中該不同的下游寡核苷酸在固體表面上點成數(shù)組形式。
23.如權(quán)利要求20至22中任一項所述的方法，其中利用蒽醌光化學作用進行所述附著。
24.如權(quán)利要求1至21中任一項所述的方法，其中該至少一個診斷寡核苷酸用可檢測基團標記。
25.如權(quán)利要求4至21中任一項所述的方法，其中該至少一個第一組診斷寡核苷酸以可檢測基團標記，該可檢測基團與不同的診斷寡核苷酸相異。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中在各寡核苷酸組的單獨寡核苷酸以可檢測基團標記，該可檢測基團與各單獨診斷寡核苷酸相異。
27.如權(quán)利要求1至8中任一項所述的方法，其中該待檢測的靶核酸來自細胞樣本、組織樣本或組織萃取物。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中該細胞來自始生生物、原核生物或真核生物。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中該細胞樣本來自血液、血清、血漿、網(wǎng)狀細胞、淋巴細胞、尿、骨髓組織、腦脊髓液或由血液或淋巴制成的任何產(chǎn)物。
30.如權(quán)利要求27所述的方法，其中該組織樣本來自肌肉活組織檢查、肝臟活組織檢查、腎臟活組織檢查、膀胱活組織檢查、骨骼活組織檢查、軟骨活組織檢查、皮膚活組織檢查、胰腺活組織檢查、腸道活組織檢查、胸腺活組織檢查、乳房活組織檢查、子宮活組織檢查、罩丸活組織檢查、眼睛活組織檢查或腦活組織檢查。
31.如權(quán)利要求28至30中任一項所述的方法，其中該待檢測的靶核酸是至少一個序列，該序列對特種生物體有特異性。
32.如權(quán)利要求28至30中任一項所述的方法，其中該待檢測的靶核酸是至少一個序列，該序列對生物體的特定物種、亞種或菌株有特異性。
33.如權(quán)利要求28至30中任一項所述的方法，其中該待檢測的靶核酸為至少一個序列，該序列對特種微生物有特異性。
34.如權(quán)利要求28至30中任一項所述的方法，其中該待檢測的靶核酸為至少一個序列，該序列對微生物的特定物種、亞種或菌株有特異性。
35.如權(quán)利要求28至30中任一項所述的方法，其中該待檢測的靶核酸為至少一個序列，該序列對特定的傳染物有特異性。
36.如權(quán)利要求28至30中任一項所述的方法，其中該待檢測的靶核酸為至少一序列，該序列對傳染物的特定物種、亞種或菌株有特異性。
37.如權(quán)利要求28至30中任一項所述的方法，其中該待檢測的靶核酸為至少一序列，該序列對編碼與遺傳疾病有關(guān)的特殊蛋白質(zhì)的基因有特異性。
38.如權(quán)利要求28至30中任一項所述的方法，其中該待檢測的靶核酸為至少一序列，該序列對與致死性疾病相關(guān)的基因有特異性。
39.如權(quán)利要求28至30中任一項所述的方法，其中該待檢測的靶核酸為至少一序列，該序列對與癌癥有關(guān)的特定基因有特異性。
40.如權(quán)利要求38所述的方法，其中該致死性疾病選自肥胖、家族性血膽固醇過多、動脈硬化與糖尿病。
41.如權(quán)利要求27至40中任一項所述的方法，其中該待檢測的靶核酸為等位基因。
42.如權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其中該用于聚合的試劑為酶。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中該用于聚合的試劑為DNA聚合酶。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中該用于聚合的試劑為熱穩(wěn)定性DNA聚合酶。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中該熱穩(wěn)定性DNA聚合酶選自Taq、Pfu、Pwo、Tth。
46.如權(quán)利要求42所述的方法，其中該用于聚合的試劑為RNA聚合酶。
47.如權(quán)利要求7至8中任一項所述的方法，其中該用于連接的試劑為酶。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其中該用于連接的試劑為連接酶。
49.一種試劑盒，用于檢測樣本中核酸Q’的存在，該核酸Q’的核苷酸序列與核酸Q在至少一個位置A不同，該試劑盒包括a)適量的核苷三磷酸鹽，b)用于核苷三磷酸鹽聚合的試劑，c)至少一個診斷寡核苷酸，該診斷寡核苷酸在位置A含有核苷酸，該核苷酸在雜交條件下能與核酸Q’位置A的核苷酸雜交，但不與核酸Q位置A的核苷酸雜交，該至少一個診斷的寡核苷酸含有至少一個LNA。
50.一種試劑盒，用于檢測樣本中核酸Q’的存在，該核酸Q’的核苷酸序列與核酸Q在至少一個位置A不同，該試劑盒包括a)適量的核苷三磷酸鹽，b)用于核苷三磷酸鹽聚合的試劑，c)至少一個下游寡核苷酸，d)至少一個診斷寡核苷酸，該診斷寡核苷酸在位置A含有核苷酸，該核苷酸在雜交條件下能與核酸Q’位置A的核苷酸雜交，但不與核酸Q位置A的核苷酸雜交，該至少一個診斷的寡核苷酸含有至少一個LNA。
51.一種試劑盒，用于檢測靶核酸，該靶核酸的核苷酸序列在至少一個位置A彼此不同，該試劑盒包括a)適量的核苷三磷酸鹽，b)用于核苷三磷酸鹽聚合的試劑，c)至少一組診斷寡核苷酸，該診斷寡核苷酸具有在至少一個位置A彼此不同的核苷酸序列，且含有至少一個LNA。
52.一種試劑盒，用于檢測靶核酸，該靶核酸的核苷酸序列在至少一個位置A彼此不同，該試劑盒包括a)適量的核苷三磷酸鹽，b)用于核苷三磷酸鹽聚合的試劑，c)至少一個下游寡核苷酸，d)至少一組診斷寡核苷酸，該診斷寡核苷酸具有在至少一個位置A彼此不同的核苷酸序列，且含有至少一個LNA。
53.一種試劑盒，用于檢測靶核酸，該靶核酸的核苷酸序列在至少一個位置A彼此不同，該試劑盒包括a)核苷三磷酸鹽，b)用于連接的試劑，c)至少兩個寡核苷酸，該至少一個診斷寡核苷酸為在位置A含有核苷酸的寡核苷酸，該核苷酸與待檢測的靶核酸位置A的核苷酸互補，該診斷寡核苷酸含有至少一個LNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測不同核酸的方法,該核酸的核苷酸序列彼此在單一或多個位置的不同。本方法使用一組含有DNA單體和新穎種類的DNA類似物－鎖定核酸(LNA)的嵌合寡核苷酸。LNA寡聚物遵循沃森－克里克堿基配對原則形成雙顯性組合,該雙顯性組合比DNA所形成的類似雙顯性組合更加穩(wěn)定。其中在3’位置發(fā)現(xiàn)LNA核苷酸的含有“等位基因特異的”LNA寡核苷酸可利用酶僅在延長方向末端的核苷酸處延長,該核苷酸與待檢測的核酸(一等位基因)的對應(yīng)核苷酸互補。因此可區(qū)別不具序列示差雜交而具有標記寡核苷酸的等位基因。本發(fā)明進一步涉及進行該方法的試劑和該方法的應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/68GK1361829SQ00807543
公開日2002年7月31日 申請日期2000年3月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月18日
發(fā)明者J·斯科夫, M·芬格, M·H·雅格布森 申請人:?？宋鲙於鞴?br>