一種制備重組間充質(zhì)干細胞的方法及其得到的重組間充質(zhì)干細胞的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種制備重組間充質(zhì)干細胞的方法及其得到的重組間充質(zhì)干細胞。
【背景技術(shù)】
[0002] 間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal Stem cell, MSC)是最早從骨髓中分離的一種非造血 干細胞。MSC可分化為成骨細胞、成脂肪細胞、成軟骨細胞、神經(jīng)元、肌肉細胞和腸上皮細胞 等。MSC的多向分化特性使其成為理想的種子細胞用于衰老、病變引起的組織損傷修復(fù)及抑 制免疫相關(guān)疾病。雖然MSC可從多種組織中分離獲得，但在臨床應(yīng)用中存在的普遍問題是 MSC純度不夠、數(shù)量不夠且自我更新能力差等。
[0003] Mysml 是 MYb_like, SWIRM and MPN domain-containing protein-1 的縮寫，又稱 為2A-DUB，或者KIAA1915/MYSM1，是組蛋白H2A去泛素化酶之一。Mysml可以特異性的調(diào)節(jié) 組蛋白H2A的單泛素化，從而改變組蛋白修飾，進而影響基因的轉(zhuǎn)錄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何快速獲得大量的間充質(zhì)干細胞。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種重組間充質(zhì)干細胞的制備方法。
[0006] 本發(fā)明所提供的重組間充質(zhì)干細胞的制備方法，包括如下步驟：降低受體間充質(zhì) 干細胞中Mysml基因的表達量，得到重組間充質(zhì)干細胞；所述受體間充質(zhì)干細胞為離體的 間充質(zhì)干細胞；所述Mysml為組蛋白H2A去泛素化酶。
[0007] 本發(fā)明的重組間充質(zhì)干細胞與所述受體間充質(zhì)干細胞相比，所述Mysml基因的表 達量降低；所述Mysml基因的表達量可以為Mysml基因的mRNA水平。
[0008] 上述方法中，所述Mysml是氨基酸序列為SEQ ID No. 1所示的蛋白質(zhì)。SEQ ID No. 1 由819個氨基酸組成。
[0009] 上述方法中，所述Mysml基因為編碼SEQ ID No. 1所示蛋白質(zhì)的基因，其cDNA序 列為SEQ ID No. 2所示。
[0010] 上述方法中，所述降低受體間充質(zhì)干細胞中Mysml基因的表達量包括向受體間充 質(zhì)干細胞中導(dǎo)入抑制所述受體間充質(zhì)干細胞中所述Mysml基因表達的物質(zhì)。
[0011] 上述方法中，所述抑制所述受體間充質(zhì)干細胞中所述Mysml基因表達的物質(zhì)為下 述1)-10)中任一種生物材料：
[0012] 1) shRNA，是形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的短發(fā)夾RNA ;
[0013] 2)表達1)所述的shRNA的表達載體；
[0014] 3)表達1)所述的shRNA的重組微生物細胞；
[0015] 4)表達1)所述的shRNA的重組動物細胞；
[0016] 5)表達1)所述的shRNA的重組植物細胞；
[0017] 6) 1)所述 shRNA 產(chǎn)生的 siRNA ;
[0018] 7)表達6)所述siRNA的表達載體；
[0019] 8)表達6)所述siRNA的重組微生物細胞；
[0020] 9)表達6)所述siRNA的重組動物細胞；
[0021] 10)表達6)所述siRNA的重組植物細胞。
[0022] 上述方法中，所述生物材料中，1)所述的shRNA的核苷酸序列是SEQ ID No. 3。
[0023] 上述方法中，所述抑制所述受體間充質(zhì)干細胞中所述Mysml基因表達的物質(zhì)可為 表達所述shRNA的重組慢病毒LV-shmMysml〇
[0024] 上述方法中，所述重組慢病毒LV-shmMysml與所述受體間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)，抑 制所述受體間充質(zhì)干細胞中所述Mysml基因的表達。
[0025] 上述方法中，所述重組慢病毒LV-shmMysml按照如下方法制備：將表達SEQ ID No. 3所示的shRNA的重組質(zhì)粒、質(zhì)粒pMDLg/pRRE、質(zhì)粒pRSV-Rev和質(zhì)粒pMD2. G共轉(zhuǎn)染哺 乳動物細胞，培養(yǎng)細胞后得到所述重組慢病毒。
[0026] 上述方法中，所述表達SEQ ID No. 3所示的shRNA的重組質(zhì)粒具體可為質(zhì)粒 pLKO. 1-shmMysmlo
[0027] 上述方法中，所述哺乳動物細胞具體可為293T/17細胞
[0028] 上述方法中，所述重組慢病毒的感染劑量Μ0Ι可為（5-40)，具體可為5。
[0029] 上文中，所述離體的間充質(zhì)干細胞可為哺乳動物的離體的間充質(zhì)干細胞，具體可 為小鼠的離體的間充質(zhì)干細胞（胚胎間充質(zhì)干細胞）。
[0030] 本發(fā)明所提供的上述方法制備得到的重組間充質(zhì)干細胞也屬于本發(fā)明保護的范 圍。
[0031] 上述重組間充質(zhì)干細胞具有下述1)-6)中至少一種特性：
[0032] 1)所述重組間充質(zhì)干細胞的增殖能力高于所述受體間充質(zhì)干細胞；
[0033] 2)所述重組間充質(zhì)干細胞的分化能力高于所述受體間充質(zhì)干細胞；
[0034] 3)所述重組間充質(zhì)干細胞的成骨標(biāo)志基因 RUNX2的表達能力高于所述受體間充 質(zhì)干細胞；
[0035] 4)所述重組間充質(zhì)干細胞的成脂標(biāo)志基因 PPARy的表達能力高于所述受體間充 質(zhì)干細胞；
[0036] 5)所述重組間充質(zhì)干細胞的前列腺素 E2分泌能力高于所述受體間充質(zhì)干細胞；
[0037] 6)所述重組間充質(zhì)干細胞的免疫抑制能力高于所述受體間充質(zhì)干細胞。
[0038] 上文中，所述免疫抑制能力可為抑制T細胞增殖的能力，具體可為抑制CD3+T細胞 增殖的能力。
[0039] 實驗證明，采用本發(fā)明的方法制備的重組間充質(zhì)干細胞C3_shM細胞干擾了 Mysml 基因的表達，增殖迅速，分化能力增強。以C3H/10T1/2細胞中Mysml基因的mRNA相對于 β-actin基因的mRNA表達量為1，C3-G細胞中Mysml基因的mRNA相對于β-actin基因 的mRNA表達量為0. 96，C3_shM細胞中Mysml基因的mRNA相對于β-actin基因的mRNA 表達量為0. 56。C3H/10T1/2細胞和C3-G細胞的增殖能力相當(dāng)，C3-shM細胞的增殖能力明 顯強于C3H/10T1/2細胞和C3-G細胞，C3-shM細胞的BrdU陽性細胞比例為24. 1%，C3-G 細胞的BrdU陽性細胞比例為15. 3%。C3-shM細胞中成骨相關(guān)基因 RUNX2的表達量和成 脂相關(guān)基因 PPARy的表達量均明顯高于C3H/10T1/2細胞和C3-G細胞，以C3-G細胞中成 骨相關(guān)基因 RUNX2相對β -actin的表達量為1，C3-shM細胞中成骨相關(guān)基因 RUNX2相對 β -actin的表達量為23 ;以C3-G細胞中成脂相關(guān)基因 PPAR γ相對β -actin的表達量為 l，C3-shM細胞中成脂相關(guān)基因 PPARy相對β-actin的表達量為15。在TNF-α和IFN-γ 的刺激下，誘導(dǎo)培養(yǎng)的C3-shM細胞中PGE2基因表達水平顯著升高，是誘導(dǎo)培養(yǎng)的C3-G細 胞中PGE2基因表達水平的5倍；在非誘導(dǎo)培養(yǎng)和誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，C3-shM細胞分泌PEG2 的水平均明顯高于C3-G細胞和C3H/10T1/2細胞，C3-G細胞和C3H/10T1/2細胞分泌PEG2 的水平相當(dāng)。C3-shM細胞對CD3+T細胞的增殖抑制能力明顯強于C3H/10T1/2細胞和C3-G 細胞，C3H/10T1/2細胞和C3-G細胞對CD3+T細胞的增殖抑制能力相當(dāng)。當(dāng)C3-shM細胞與 ⑶3+T細胞的數(shù)量比為1:10時，⑶3+T細胞的增殖率只有33. 2%，強于相同條件下C3-G細 胞（57. 7% )對⑶3+T細胞增殖抑制能力；單純⑶3+T細胞的增殖率為85. 7%。本發(fā)明制 備方法操作簡單、方便實用，建立了快速獲得大量間充質(zhì)干細胞的方法，有望解決臨床MSC 量不夠的問題。
【附圖說明】
[0040] 圖1為重組間充質(zhì)干細胞的免疫表型鑒定結(jié)果圖。C3-G細胞和C3_shM細胞免疫 表型鑒定圖中的橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)與C3H/10T1/2細胞免疫表型鑒定圖中的橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo) 相同。
[0041] 圖2為實時熒光定量PCR檢測細胞中Mysml基因的mRNA表達量結(jié)果。其中，A為 C3-G細胞和C