鹽生草葉片細(xì)胞液泡的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物細(xì)胞液泡提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鹽生植物鹽生草葉片細(xì)胞液泡提取的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]研究植物耐鹽抗旱等逆境適應(yīng)機(jī)制已成為當(dāng)前生物學(xué)研究的熱點(diǎn)話題。鹽生草(Halogeton glomeratus)生長(zhǎng)于我國(guó)西北旱區(qū)，為藜科(Chenopodiaceae)鹽生草屬(Halogeton) —年生稀鹽鹽生植物，通過(guò)植株根系對(duì)鹽分的限制性吸收與肉質(zhì)化葉片對(duì)鹽分的有效富集，從而對(duì)鹽脅迫形成了特殊的耐性適應(yīng)機(jī)制，且其適合人工培養(yǎng)的特性，使鹽生草成為研究植物耐鹽抗旱機(jī)理的良好材料。植物細(xì)胞液泡是具備多種功能的細(xì)胞器，約占成熟細(xì)胞體積的90%，其主要功能在于積累貯存代謝物質(zhì)，調(diào)節(jié)滲透壓，維持細(xì)胞內(nèi)正常代謝環(huán)境。前期研究發(fā)現(xiàn)，鹽生草通過(guò)高效運(yùn)輸系統(tǒng)將鹽分運(yùn)輸?shù)饺~片葉肉細(xì)胞，進(jìn)而區(qū)隔化于細(xì)胞液泡當(dāng)中，使細(xì)胞質(zhì)中鹽分保持在較低水平，從而實(shí)現(xiàn)了在鹽脅迫環(huán)境下的正常生長(zhǎng)。由此可見(jiàn)，鹽生草必定存在以鹽分液泡區(qū)隔化為主的耐鹽適應(yīng)機(jī)制。提取和分離純化完整的細(xì)胞液泡無(wú)疑是研究鹽生草鹽分液泡區(qū)隔化機(jī)制的關(guān)鍵與難點(diǎn)所在。目前，關(guān)于提取鹽生植物液泡膜的研究很少，尤其關(guān)于鹽生草液泡分離純化的方法尚未見(jiàn)任何報(bào)道。因此，當(dāng)前急需一種以鹽生草葉片為材料來(lái)分離純化其液泡的方法，以便為液泡區(qū)隔化的耐鹽機(jī)制研究以及作物的抗逆性育種提供理論支撐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于避免現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種鹽生草葉片細(xì)胞液泡的提取方法。該方法能夠快速有效地獲得數(shù)量多、純度高、結(jié)構(gòu)完整的液泡。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:一種鹽生草葉片細(xì)胞液泡的提取方法，其主要特點(diǎn)在于步驟為:
[0005](1)葉片取材:以鹽生草幼苗為對(duì)象，切取地上部分，用蒸餾水沖洗3-5次，濾紙擦干葉片表面水分；
[0006](2)酶解和純化原生質(zhì)體:將步驟(1)獲得的葉片從莖桿上沿葉片基部切割下來(lái)，移入鋪有光滑干凈紙張的實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，用刀片沿葉片主脈縱切成兩半，然后放入酶解液，在溫度22-25°C、黑暗條件下，酶解2.5-3.0h ;酶解結(jié)束后，再向酶解液加入等體積的洗液，并置于黑暗條件，溫度4-6°C，轉(zhuǎn)速30-40rpm的搖床上震蕩10-15min，釋放原生質(zhì)體；然后用5ml的移液槍將全部酶解液轉(zhuǎn)移至試管，溫度為2-6°C，轉(zhuǎn)速為2200-2500rpm離心10-15min，最后用5ml移液槍吸取至多1/2體積上清液，即可獲得較純凈的原生質(zhì)體；
[0007](3)液泡的獲得與純化:將毛地黃皂苷加入步驟(2)獲得的原生質(zhì)體中，輕輕混勻，置于2-6°C靜置10min，充分溶解細(xì)胞質(zhì)膜，釋放液泡；然后轉(zhuǎn)速為1100-1300rpm，溫度為2-6°C，離心10_15min，用5ml的移液槍吸取至多1/4上清液，即可實(shí)現(xiàn)純凈液泡的富集。
[0008]所述的鹽生草葉片細(xì)胞液泡的提取方法，其步驟(1)所述的葉片為生長(zhǎng)25-40d的鹽生草幼苗。這些幼嫩葉片不僅保證了獲得純凈液泡的質(zhì)量，更是提供了獲得大量純凈液泡的原材料。
[0009]所述的鹽生草葉片細(xì)胞液泡的提取方法，其步驟(2)中所述的原生質(zhì)體酶解液組成為:纖維素酶 2.0-3.0% (w/v)，半纖維素酶 1.0-2.0% (w/v)，果膠酶 0.5-1.0% (w/v)，離析酶 0.3-0.5% (w/v)，甘露醇 350-450mM，MES 0.5-1.5mM，PH 為 5.5-6.0 ;所述的洗液的組成為:Ficoll 4001.5-3% (w/v)，甘露醇 250-350mM，Tris-HCl 20-30mM，PH 為 7.5-8.0，EDTA 15-25mM。
[0010]所述的鹽生草葉片細(xì)胞液泡的提取方法，其步驟(2)中所述的酶解液中的葉片的量以葉片鋪滿酶解液表面。在保證了酶解效果的同時(shí)節(jié)約成本。
[0011]所述的鹽生草葉片細(xì)胞液泡的提取方法，其步驟(2)中所述的洗液組成中甘露醇的濃度比所述的酶解液中甘露醇的濃度低80-100mM。適量降低滲透壓有助于提高液泡穩(wěn)定性。
[0012]所述的鹽生草葉片細(xì)胞液泡的提取方法，其步驟(3)所述的毛地黃皂苷的用量為30-40ul/ml。從而實(shí)現(xiàn)盡可能全部降解細(xì)胞質(zhì)膜的同時(shí)，減少對(duì)液泡膜的傷害。
[0013]所述的鹽生草葉片細(xì)胞液泡的提取方法，步驟(2)、(3)中所用離心管均為塑料平底離心管，所述離心所用離心機(jī)轉(zhuǎn)子均為水平轉(zhuǎn)子。所用試劑均為進(jìn)口分析純，用超純水配制。需將5ml移液槍槍頭尖端剪去，以最大限度減少對(duì)分離與純化原生質(zhì)體和液泡過(guò)程中的機(jī)械損傷。
[0014]本發(fā)明的有益效果如下:
[0015]1.直接以生長(zhǎng)25-40d的幼苗嫩葉為材料來(lái)富集液泡，從植株本身直接獲得的液泡比懸浮細(xì)胞培養(yǎng)分離獲得的液泡更能代表植株本身特性；
[0016]2.幼苗生物量大，為大量液泡的獲得提供了充足的原材料；
[0017]3.應(yīng)用毛地黃皂苷來(lái)解離細(xì)胞質(zhì)膜，從而能高效快速地得到完整性好，純度高，數(shù)量多的液泡。
【附圖說(shuō)明】
:
[0018]圖1.實(shí)施例1獲得的液泡；
[0019]圖2.實(shí)施例2獲得的液泡；
[0020]圖3.實(shí)施例3獲得的液泡；
[0021]圖4.實(shí)施例4獲得的液泡；
[0022]圖5.實(shí)施例5獲得的液泡；
[0023]圖6.試驗(yàn)例獲得的液泡。
【具體實(shí)施方式】
[0024]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下面對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。
[0025]實(shí)施例1: 一種鹽生草葉片細(xì)胞液泡的提取方法，其步驟為:
[0026](1)葉片取材:切取生長(zhǎng)30d幼苗葉片，蒸餾水沖洗3次，濾紙將其表面擦干；
[0027](2)酶解和純化原生質(zhì)體:將步驟(1)獲得的葉片從莖桿上沿葉片基部切割下來(lái)，移入鋪有光滑干凈紙張的實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，用刀片沿葉片主脈縱切成兩半，然后放入酶解液，在溫度25°C、黑暗條件下，酶解2.5h ;酶解結(jié)束后，再向酶解液加入等體積的洗液，并置于黑暗條件，溫度6°C，轉(zhuǎn)速30rpm的搖床上震蕩lOmin，釋放原生質(zhì)體；然后用5ml的移液槍將全部酶解液轉(zhuǎn)移至試管，溫度為4°C，轉(zhuǎn)速為2500rpm離心10_15min，最后用5ml移液槍吸取至多1/2體積上清液，即可獲得較純凈的原生質(zhì)體；
[0028](3)液泡的獲得與純化:將上清液中加入35ul/ml的毛地黃皂苷加入步驟⑵獲得的原生質(zhì)體中，輕輕混勻，置于4°C靜置lOmin，充分溶解細(xì)胞質(zhì)膜，釋放液泡；然后轉(zhuǎn)速為1200rpm，溫度為4°C，離心lOmin，用5ml的移液槍吸取至多1/4上清液，即可實(shí)現(xiàn)純凈液泡的富集。加入35ul/ml的毛地黃皂苷，從而實(shí)現(xiàn)盡可能全部降解細(xì)胞質(zhì)膜的同時(shí)，減少對(duì)液泡膜的傷害。
[0029]所述的原生質(zhì)體酶解液為:纖維素酶3.0% (w/v)，半纖維素酶2.0% (w/v)，果膠II 1.0% (w/v)，離析酶 0.5% (w/v)，甘露醇 450mM, MES 1.0mM，PH 為 5.5 ;洗液配方為:甘露醇 360mM，F(xiàn)icoll 4002.0% (w/v)，Tris-HCl 20mM, PH 為 8.0，EDTA 20mM。獲得的液泡見(jiàn)圖1。
[0030]步驟(2)中所述的酶解液中的葉片的量以葉片鋪滿酶解液表面。在保證了酶解效果的同時(shí)節(jié)約成本。
[0031]步驟(2)中所述的洗液組成中甘露醇的濃度比所述的酶解液中甘露醇的濃度低90mM。適量降低滲透壓有助于提高液泡穩(wěn)定性。
[0032]步驟(2)、(3)中所用離心管均為塑料平底離心管，所述離心所用離心機(jī)轉(zhuǎn)子均為水平轉(zhuǎn)子。所用試劑均為進(jìn)口分析純，用超純水配制。需將5ml移液槍槍頭尖端剪去，以最大限度減少對(duì)分離與純化原生質(zhì)體和液泡過(guò)程中的機(jī)械損傷。
[0033]實(shí)施例2:—種鹽生草葉片細(xì)胞液泡的提取方法，其步驟為:
[0034](1)葉片取材:切取生長(zhǎng)40d幼苗葉