一種催化生產(chǎn)1, 5-戊二胺的工程菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種催化生產(chǎn)1，5-戊二胺的工程菌及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 1，5_ 戊二胺（1，5-Pentanediamine)，又名尸胺（Cadaverine)、1，5_ 二氨基戊燒 (1，5-Diaminopentane)，與二元酸聚合可合成高分子聚酰胺材料（即尼龍）。全球每年生產(chǎn) 約700萬噸聚酰胺材料，消耗了大量石化資源，因此生物法合成聚酰胺的重要組成單體一 1，5-戊二胺，具有重要的經(jīng)濟(jì)學(xué)和生態(tài)學(xué)意義。生物法生產(chǎn)1，5-戊二胺主要采用微生物發(fā) 酵和催化兩種方法。目前，賴氨酸作為大宗氨基酸品種之一，其產(chǎn)能嚴(yán)重過剩，導(dǎo)致利潤(rùn)率 下降。因此，開發(fā)高效的以賴氨酸為底物的戊二胺生物催化的生產(chǎn)方法，可以推進(jìn)氨基酸發(fā) 酵產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型升級(jí)。
[0003] 大腸桿菌是最常用的全細(xì)胞催化生產(chǎn)戊二胺的微生物。大腸桿菌中的1，5-戊二 胺操縱子依次包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pcad、賴氨酸-戊二胺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 cadB和賴氨酸脫 羧酶基因 cadA。在低pH值、高賴氨酸濃度條件下，1，5-戊二胺操縱子上游調(diào)芐基因 cadC 被激活，其產(chǎn)物作用于Pcad啟動(dòng)子，激活賴氨酸脫羧酶CadA和賴氨酸-戊二胺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白CadB的表達(dá)合成。CadA催化細(xì)胞內(nèi)的賴氨酸合成1，5-戊二胺，CadB將合成的1，5-戊 二胺轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外（J Bacteriol，1992, 174(8) :2659 - 2669.)。除了誘導(dǎo)型賴氨酸脫羧酶 CadA外，大腸桿菌還包含組成型賴氨酸脫羧酶LdcC。
[0004] 在全細(xì)胞催化生產(chǎn)1，5-戊二胺的現(xiàn)有技術(shù)中，專利（US7189543、EP1482055)以 PUC18為載體過表達(dá)賴氨酸脫羧酶基因 cadA，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌K12衍生系 列菌株JM109中，獲得全細(xì)胞催化生產(chǎn)1，5-戊二胺的工程菌的戊二胺催化產(chǎn)量和戊二胺催 化速率較低。為了提升工程菌的催化性能，需要采用熱處理、冷凍熔融以及超聲等細(xì)胞處理 工藝（專利CN102782146)，但是該處理工藝增加了實(shí)際生產(chǎn)工藝難度和生產(chǎn)成本。此外，上 述1，5-戊二胺生物催化工藝需要在工程菌培養(yǎng)結(jié)束后收集菌體，去除培養(yǎng)液以后再加入 催化液和底物賴氨酸進(jìn)行戊二胺催化過程，增加了生產(chǎn)工序、操作時(shí)間、生產(chǎn)成本和廢水排 放?？傊?，目前戊二胺生物催化的現(xiàn)有技術(shù)存在工程菌細(xì)胞催化性能低、催化工藝復(fù)雜、成 本高等問題，嚴(yán)重限制了 1，5-戊二胺生物催化的實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種催化生產(chǎn)1，5_戊二胺的工程菌及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供一種工程菌，是在大腸桿菌B株或其衍生菌株中過表達(dá)賴氨酸脫羧酶 基因，同時(shí)適量表達(dá)賴氨酸-戊二胺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 cadB。
[0007] 上述工程菌中，所述過表達(dá)賴氨酸脫羧酶基因的方法是將所述賴氨酸脫羧酶基因 的全部或部分核苷酸序列置于外源表達(dá)質(zhì)粒中的啟動(dòng)子之后進(jìn)行表達(dá)；
[0008] 所述適量表達(dá)賴氨酸-戊二胺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 cadB是指將包含或不包含RBS 序列的賴氨酸-戊二胺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的全部或部分核苷酸序列置于外源表達(dá)質(zhì)粒中 的賴氨酸脫羧酶基因的核苷酸序列之后進(jìn)行表達(dá)；或，使用適用于大腸桿菌的能解除cadB 轉(zhuǎn)錄阻遏的啟動(dòng)子替換大腸桿菌B株或其衍生菌株染色體上的賴氨酸-戊二胺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白基因自身的啟動(dòng)子；
[0009] 所述適用于大腸桿菌的能解除cadB轉(zhuǎn)錄阻遏的啟動(dòng)子具體為L(zhǎng)啟動(dòng)子、trc啟動(dòng) 子、T5啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子或T7啟動(dòng)子。
[0010] 上述任一所述的工程菌中，所述賴氨酸脫羧酶基因?yàn)閏adA ;
[0011] 所述在大腸桿菌B株或其衍生菌株中過表達(dá)賴氨酸脫羧酶基因，同時(shí)適量表達(dá)賴 氨酸-戊二胺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 cadB的方法為如下（1)或（2)所示：
[0012] (1)將含有賴氨酸脫羧酶蛋白的編碼基因和包含RBS22的賴氨酸-戊二胺逆向轉(zhuǎn) 運(yùn)蛋白編碼基因的片段導(dǎo)入所述大腸桿菌B株或其衍生菌株中；
[0013] 所述片段是通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入的；
[0014] 所述重組表達(dá)載體具體是將所述片段插入pET28a(+)的多克隆位點(diǎn)間得到的；
[0015] 所述重組表達(dá)載體具體構(gòu)建過程如下：將含有賴氨酸脫羧酶蛋白的編碼基因的片 段插入pET28a(+)的Nco I和Sal I酶切位點(diǎn)間，得到重組表達(dá)載體1 ;再將包含RBS22的 賴氨酸-戊二胺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的片段插入重組表達(dá)載體1的Not I和Hind III 位點(diǎn)間得到；
[0016] 所述賴氨酸-戊二胺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 14所示；
[0017] 所述賴氨酸-戊二胺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因的核苷酸序列具體如SEQ ID No. 12 中自5'末端起第7269位至第8603位核苷酸所示；
[0018] 所述RBS22的核苷酸序列如SEQ ID No. 12中自5'末端起第7255位至第7263位 核苷酸所示；
[0019] 所述包含RBS22的賴氨酸-戊二胺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的片段具體如SEQ ID No. 11所示；
[0020] (2)將所述大腸桿菌B株或其衍生菌株的cadBA操縱子的啟動(dòng)子替換為適用于大 腸桿菌的能解除cadB轉(zhuǎn)錄阻遏的啟動(dòng)子，再將含有賴氨酸脫羧酶蛋白的編碼基因的片段 導(dǎo)入所述大腸桿菌B株及其衍生菌株中；
[0021] 所述將大腸桿菌B株或其衍生菌株的cadBA操縱子的啟動(dòng)子替換為T7啟動(dòng)子的 過程如下：將帶有T7啟動(dòng)子序列的賴氨酸-戊二胺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因的質(zhì)粒導(dǎo)入所 述大腸桿菌B株或其衍生菌株中進(jìn)行同源重組得到；
[0022] 所述帶有T7啟動(dòng)子序列的賴氨酸-戊二胺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因的質(zhì)粒是將 帶有T7啟動(dòng)子序列的賴氨酸-戊二胺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因插入pKOV質(zhì)粒的BamHI和 Not I位點(diǎn)間得到；
[0023] 所述帶有T7啟動(dòng)子序列的賴氨酸-戊二胺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因的核苷酸序 列如SEQ ID No. 21所示；
[0024] 所述含有賴氨酸脫羧酶蛋白的編碼基因的片段是通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入的；
[0025] 所述重組表達(dá)載體具體是將所述片段插入pET28a(+)的多克隆位點(diǎn)間得到的；
[0026] 所述重組表達(dá)載體具體構(gòu)建過程如下：將含有賴氨酸脫羧酶蛋白的編碼基因的片 段插入pET28a(+)的Nco I和Sal I酶切位點(diǎn)間；
[0027] 所述賴氨酸脫羧酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 13所示；
[0028] 所述賴氨酸脫羧酶蛋白的編碼基因的核苷酸序列具體如SEQ ID No. 12中自5'末 端起第5071位至第7215位核苷酸所示；
[0029] 所述含有賴氨酸脫羧酶蛋白的編碼基因的片段如SEQ ID No. 3所示。
[0030] 上述任一所述的工程菌中，所述大腸桿菌B株為E. coli BL21(DE3)。
[0031] -種制備1，5-戊二胺的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，包括如下步驟：將上述任 一所述的工程菌在含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到種子液；將種子液接入豐富 培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)；加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)，再加入底物賴氨酸和維生素 B6開始全細(xì)胞催 化，即得；
[0032] 所述誘導(dǎo)劑具體為IPTG或乳糖；
[0033] 所述底物賴氨酸具體為含有賴氨酸生產(chǎn)菌的賴氨酸發(fā)酵液、去除菌體的賴氨酸發(fā) 酵液、去除菌體并脫色的賴氨酸發(fā)酵液、賴氨酸發(fā)酵液的離子交換洗脫液、游離賴氨酸、賴 氨酸鹽干粉或其溶液；
[0034] 所述維生素 B6為吡哆醛、磷酸吡哆醛和/或鹽酸吡哆醛；
[0035] 所述豐富培養(yǎng)基中含有10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，0. 9g/L Κ2ΗΡ04 · 3H20, 1. 14g/L KH2P04, 10g/L(NH4)2S04, 0· 3g/L MgS04 · 7H20, 5mL/L 微量元素儲(chǔ)液， 50mg/L卡那霉素，余量為水；
[0036] 所述微量元素儲(chǔ)液含有 6g/L FeS04 · 7H20, 1. 35g/L CaCl2, 0· 8g/ LZnS04 · 7H20, 1. 5g/L MnS04 · 4H20, 0· 15g/L CuS04 · 5H20, 0· 2g/L(NH4)6Mo7024 · 4H20, 0· lg/L H3B03, (λ 25g/L CoCl2 · 6H20 和 lOmL/L 濃鹽酸，余量為水。
[0037] 上述方法中，所述LB液體培養(yǎng)基中卡那霉素的濃度為5_200mg/L，具體為50 mg/ L ；
[0038] 所述種子液的0D6。。為5-25 ;
[0039] 所述種子液接入豐富培養(yǎng)基的比例為0. 5-30%，具體為5% ;
[0040] 所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為25°C -45°C，具體為37°C ;
[0041] 所述發(fā)酵培養(yǎng)的DO在50%以上；
[0042] 所述發(fā)酵培養(yǎng)的pH為4. 0-9. 0 ;
[0043] 所述IPTG的終濃度為0· 01-lOmM，具體為0· 4mM ;
[0044] 所述IPTG加入的時(shí)間為發(fā)酵培養(yǎng)后3-40小時(shí)，具體為3h ;
[0045] 所述IPTG誘導(dǎo)時(shí)還包括0. 5-10g/L的速率補(bǔ)加葡萄糖的步驟，所述速率具體為 3g/L ；
[0046] 所述賴氨酸鹽為L(zhǎng)-賴氨酸鹽酸鹽；
[0047] 所述加入底物賴氨酸和維生素 B6開始全細(xì)胞催化的時(shí)間為誘導(dǎo)開始后的 0· 5-30h，具體為 6h ;
[0048] 所述催化過程中pH維持在5. 5-7. 0之間，具體用硫酸調(diào)節(jié)；
[0049] 所述催化還包括如下步驟：按照0_5g/L的速率補(bǔ)加葡萄糖，通氣量為0-10vvm,溫 度控制在25-60°C，攪拌轉(zhuǎn)速為0_1200rpm ;
[0050] 所述催化過程中，所述補(bǔ)加葡萄糖的速率具體為2g/L ;
[0051] 所述催化過程中，所述通氣量具體為lvvm ;
[0052] 所述催化過程中，所述溫度具體為37°C ;
[0053] 所述催化過程中，所述攪拌轉(zhuǎn)速具體為500rpm。