/10T1/2細(xì)胞懸液。將C3H/10T1/2細(xì)胞懸液按2 X 105/cm2的密 度接種于6孔板中，置于37°C、5% C02的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)，加入 LV-shmMysml重組慢病毒液（Μ0Ι = 5)，并加入polybrene (工作濃度為8 μ g/mL)，繼續(xù)培 養(yǎng)6小時(shí)后吸除原培養(yǎng)液，加入等體積的含10% (體積百分含量）胎牛血清的a-MEM培養(yǎng) 液，置于37°C、5% 0)2的恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，獲得Mysml基因敲除的C3H/10T1/2細(xì)胞， 命名為實(shí)驗(yàn)組重組間充質(zhì)干細(xì)胞（簡稱C3-shM細(xì)胞）。
[0069] 對照組除將LV-shmMysml重組慢病毒液替換為LV-GFP重組慢病毒液外，其余條件 均不變，獲得對照組間充質(zhì)干細(xì)胞（簡稱C3-G細(xì)胞）。
[0070] 二、重組間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定
[0071] 1、免疫表型鑒定
[0072] 采用含10% (體積百分含量）胎牛血清的α-ΜΕΜ培養(yǎng)液培養(yǎng)步驟一獲得的 C3-shM細(xì)胞，置于37 °C、5 % C02的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待該細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí)采用 0. 25%胰酶消化，收集細(xì)胞，采用PBS緩沖液清洗3次，最后用PBS緩沖液重懸細(xì)胞，并用血 細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。用PBS緩沖液稀釋細(xì)胞懸液，得到C3-shM細(xì)胞液，C3-shM細(xì)胞液中細(xì)胞 密度為2 X 106個(gè)/mL。向100 μ L C3-shM細(xì)胞液加入抗體，每種抗體單獨(dú)加入細(xì)胞液中檢 測，所用抗體分別為抗小鼠⑶44,⑶105，Sca-l和MHCII的抗體，4°C搖床避光反應(yīng)30分鐘， 然后在400g條件下離心5min，收集細(xì)胞沉淀并用PBS清洗2次，采用1 %多聚甲醛200 μ L 固定，進(jìn)行流式分析。
[0073] C3H/10T1/2細(xì)胞和C3-G細(xì)胞的免疫表型鑒定方法同C3_shM細(xì)胞。
[0074] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：C3_shM細(xì)胞和C3-G細(xì)胞均高效表達(dá)Sca-Ι分子、⑶105分子和 CD44分子，細(xì)胞所占比例均在90%以上，MHCII分子的表達(dá)量均比較低，與C3H/10T1/2細(xì) 胞的表型鑒定結(jié)果一致（圖1)。
[0075] 2、重組間充質(zhì)干細(xì)胞中Mysml基因沉默效率鑒定
[0076] 將培養(yǎng)至第三代的C3_shM細(xì)胞采用Tripure試劑裂解，收取細(xì)胞裂解液，提取RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR，QRT-PCR)檢測細(xì) 胞中Mysml基因的mRNA表達(dá)量，以相對于β -actin基因的mRNA表達(dá)量來表示，以檢測該 基因的沉默效率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
[0077] 其中，Mysml基因引物對：
[0078] Forward :5,-GATGCAGAAGCAGCATACCA-3,；
[0079] Reverse :5' -CCTCCACAGACAAATGCTCA-3' 〇
[0080] C3H/10T1/2細(xì)胞和C3-G細(xì)胞的Mysml基因沉默效率鑒定方法同C3-shM細(xì)胞。
[0081] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：以C3H/10T1/2細(xì)胞中Mysml基因的mRNA相對于β-actin基因的 mRNA表達(dá)量為1，C3-G細(xì)胞中Mysml基因的mRNA相對于β -actin基因的mRNA表達(dá)量為 0· 96, C3-shM細(xì)胞中Mysml基因的mRNA相對于β -actin基因的mRNA表達(dá)量為0· 56 (圖 2) ;C3-shM細(xì)胞中Mysml基因的mRNA的表達(dá)量明顯低于C3-G細(xì)胞和C3H/10T1/2細(xì)胞
[0082] 3、重組間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力檢測
[0083] 取對數(shù)生長期的C3_shM細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，細(xì)胞密度為（1-1. 5) X 105/孔，待 細(xì)胞生長到80%融合時(shí)，加入工作濃度為10 ymol/L的BrdU，1小時(shí)之后按照BrdU檢測試 劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞增殖能力的檢測，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
[0084] C3H/10T1/2細(xì)胞和C3-G細(xì)胞的增殖能力檢測方法同C3-shM細(xì)胞。
[0085] 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果如圖3所示，C3H/10T1/2細(xì)胞和C3-G細(xì)胞的增殖能力相當(dāng)， C3-shM細(xì)胞的增殖能力明顯強(qiáng)于C3H/10T1/2細(xì)胞和C3-G細(xì)胞，C3-shM細(xì)胞的BrdU陽性 細(xì)胞比例為24. 1 %，C3-G細(xì)胞的BrdU陽性細(xì)胞比例為15. 3%，結(jié)果表明，干擾Mysml表達(dá) 后，間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)。
[0086] 4、重組間充質(zhì)干細(xì)胞的分化能力檢測
[0087] 細(xì)胞用成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)液：DMEM-HG培養(yǎng)液含10% (體積百分比）胎牛血 清，濃度為10 7M的地塞米松，濃度為10mM的β -磷酸甘油和濃度為50 μ Μ的磷酸化維生素 C〇
[0088] 細(xì)胞用成脂誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)液：DMEM-HG培養(yǎng)液含10% (體積百分比）胎牛血 清，濃度為10 6M的地塞米松，濃度為10ng/mL的胰島素，濃度為0. 5 μ Μ的IBMX和濃度為 200 μ Μ的吲哚美辛。
[0089] 將C3-shM細(xì)胞、C3-G細(xì)胞和C3H/10T1/2細(xì)胞分別用成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)液和 成脂誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)7天，分別獲得成骨誘導(dǎo)的C3-shM細(xì)胞、C3-G細(xì)胞 和C3H/10T1/2細(xì)胞，成脂誘導(dǎo)的C3-shM細(xì)胞、C3-G細(xì)胞和C3H/10T1/2細(xì)胞。
[0090] 按照如下方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次：
[0091] 收集誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后的細(xì)胞，用TRIZ0L抽提總RNA并且用反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒反轉(zhuǎn)錄 成cDNA。cDNA被用作模板添加 Τ0Υ0Β0品牌SYBR Green試劑采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR來確 定特定基因的表達(dá)，以相對于β -actin基因的表達(dá)量來表示。
[0092] 其中，小鼠 β-actin基因引物對：
[0093] Forward :5,-CTTCCGCCTTAATACTTC-3,；
[0094] Reverse :5, -AAGCCTTCATACATCAAG-3,；
[0095] 小鼠成骨相關(guān)基因 RUNX2引物對：
[0096] Forward :5'-CCACAAGGACAGAGTCAGAT-3' ；
[0097] Reverse :5, -GATAGGAGGGGTAAGACTGG-3,；
[0098] 小鼠成脂相關(guān)基因 PPARγ引物對：
[0099] Forward :5,-TTGATTTCTCCAGCATTTCT-3,；
[0100] Reverse : 5，-GCACTTTGGTATTCTTGGAG-3，〇
[0101] 結(jié)果如圖4所示，C3H/10T1/2細(xì)胞和C3-G細(xì)胞中成骨相關(guān)基因 RUNX2的表達(dá)量 和成脂相關(guān)基因 PPARy的表達(dá)量均相當(dāng)；C3-shM細(xì)胞中成骨相關(guān)基因 RUNX2的表達(dá)量和 成脂相關(guān)基因 PPARy的表達(dá)量均明顯高于C3H/10T1/2細(xì)胞和C3-G細(xì)胞。以C3-G細(xì)胞中 成骨相關(guān)基因 RUNX2相對β -actin的表達(dá)量為l，C3-shM細(xì)胞中成骨相關(guān)基因 RUNX2相對 β -actin的表達(dá)量為23 ;以C3-G細(xì)胞中成脂相關(guān)基因 PPAR γ相對β -actin的表達(dá)量為 1，C3-shM細(xì)胞中成脂相關(guān)基因 PPARy相對β -actin的表達(dá)量為15。
[0102] 5、重組間充質(zhì)干細(xì)胞高效分泌前列腺素 E2(PGE2)的鑒定
[0103] 培養(yǎng)液1 :含10% (體積百分含量）胎牛血清、濃度為5ng/mL的TNF- α和濃度為 5ng/mL 的 IFN-γ 的 α -MEM培養(yǎng)液。
[0104] 1)熒光定量PCR檢測PGE2的基因表達(dá)水平
[0105] 將步驟一獲得的重組病毒感染72h后的C3_shM細(xì)胞和重組病毒感染72h后的 C3-G細(xì)胞分別用培養(yǎng)液1進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，按照（1-1. 5) X 105的細(xì)胞密度接種于6孔板中， 置于37°C、5% C02的恒溫培養(yǎng)箱中在TNF- α和IFN- γ的刺激下培養(yǎng)12h，分別獲得誘導(dǎo)培 養(yǎng)的C3-shM細(xì)胞和誘導(dǎo)培養(yǎng)的C3-G細(xì)胞。將步驟一獲得的重組病毒感染72h后的C3-shM 細(xì)胞、重組病毒感染72h后的C3-G細(xì)胞和