一種高效分離純化乳腺上皮細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動(dòng)物細(xì)胞的體外分離純化方法，尤其是涉及一種體外高效分離純化動(dòng) 物乳腺上皮細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺最主要的功能就是泌乳，乳腺上皮細(xì)胞是乳腺中唯一具有分泌功能的細(xì)胞， 是研究乳腺泌乳機(jī)制的著手點(diǎn)。乳腺上皮細(xì)胞的增殖和分化始終貫穿于乳腺發(fā)育及泌乳過 程，因此，在細(xì)胞水平上進(jìn)行乳腺上皮細(xì)胞增殖及分化的調(diào)控研究是十分有意義的。乳腺上 皮細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)由于其細(xì)胞成分均一，脫離了體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境的干擾，被廣泛應(yīng)用于 乳腺的發(fā)育機(jī)制、乳汁的分泌機(jī)制、乳腺生物反應(yīng)器的構(gòu)建和乳腺癌發(fā)生機(jī)制的研究中。
[0003] 乳腺上皮細(xì)胞的體外分離方法主要有組織塊法、酶消化法、機(jī)械法及從初乳中分 離乳腺上皮細(xì)胞。組織塊法，操作簡(jiǎn)單，對(duì)細(xì)胞形態(tài)功能影響較小，但是分離所需時(shí)間較長(zhǎng)； 酶消化法，可以快速獲得細(xì)胞，但往往影響上皮細(xì)胞的形態(tài)功能，特別是泌乳功能；同時(shí)，這 兩種方法都需要一個(gè)漫長(zhǎng)的純化過程，才能得到均一的乳腺上皮細(xì)胞。因此，需要進(jìn)一步研 究乳腺上皮細(xì)胞的體外分離純化技術(shù)，期待發(fā)明一種既能快速高效得到均一純化的乳腺上 皮細(xì)胞，同時(shí)對(duì)乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)和特異性泌乳功能影響較小的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有乳腺上皮細(xì)胞分離純化方法的不足，提供一種能在短期 內(nèi)獲得均一純化的乳腺上皮細(xì)胞，且不會(huì)對(duì)細(xì)胞特異性功能造成影響的高效分離純化乳腺 上皮細(xì)胞的方法。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種高效分離純化乳腺上皮細(xì)胞的方法，包括 以下步驟：
[0006] 1)無菌手術(shù)采集動(dòng)物乳腺實(shí)質(zhì)組織，用含有青霉素、鏈霉素的Hank' s清洗液清 洗，剪碎成1_3以下的組織小塊，置于上述清洗液中室溫下震蕩，如此反復(fù)直至溶液清亮， 收集組織小塊備用；
[0007] 2)將步驟1)所得組織塊放入膠原酶-透明質(zhì)酸酶消化液中37°C震蕩消化，200 目細(xì)胞篩過濾，收集濾取組織小塊，接著用步驟1)中清洗液清洗組織小塊3-5次，將清洗 后的組織小塊置于細(xì)胞培養(yǎng)液中，接種到細(xì)胞瓶中培養(yǎng)，當(dāng)瓶底細(xì)胞生長(zhǎng)70 %以上時(shí)，用 0. 25%胰酶-0. 02% EDTA消化收集細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
[0008] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法還包括采集動(dòng)物乳腺實(shí)質(zhì)組織后剔除血 管、結(jié)締組織和脂肪組織的步驟。
[0009] 其中，所述Hank ' s清洗液中青霉素、鏈霉素的濃度分別為150_300U/mL和 150-300 μ g/mL〇
[0010] 其中，所述的細(xì)胞培養(yǎng)液為含5% -10% FBS的MEM、DMEM或DMEM/F12。
[0011] 其中，步驟2)中膠原酶-透明質(zhì)酸酶消化液含200-300U/mL膠原酶I、100U/mL透 明質(zhì)酸酶、l〇〇U/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素。
[0012] 優(yōu)選的，步驟1)中乳腺組織取樣于處在妊娠后期或泌乳期的成年哺乳動(dòng)物。
[0013] 優(yōu)選的，奶牛、牦牛和綿羊乳腺組織震蕩消化的時(shí)間分別為2. 5-3h、3-3. 5h和 2~2. 5h〇
[0014] 優(yōu)選的，步驟2)中消化后的細(xì)胞小塊在細(xì)胞培養(yǎng)液中的密度為5-10塊/ml。
[0015] 本發(fā)明較現(xiàn)有技術(shù)具有以下特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)：
[0016] 1、大大提高培養(yǎng)效率。傳統(tǒng)植塊法一般在第三天左右開始有成纖維樣細(xì)胞長(zhǎng)出， 第6-8天才有上皮樣細(xì)胞長(zhǎng)出，本發(fā)明方法在接種后第三天上皮樣細(xì)胞就直接長(zhǎng)出且?guī)缀?不出現(xiàn)成纖維樣細(xì)胞，大大縮短第一代培養(yǎng)時(shí)間，提高分離效率。
[0017] 2、本發(fā)明先用膠原酶消化適當(dāng)時(shí)間，消化掉了腺泡外絕大部分以成纖維樣細(xì)胞為 主的基質(zhì)成分，剩余的主要是上皮細(xì)胞的腺泡組織，因此不需要反復(fù)的差速消化/差速貼 壁等復(fù)雜漫長(zhǎng)的純化方法去除成纖維樣細(xì)胞，就可直接獲得純度均一的乳腺上皮細(xì)胞。
[0018] 3、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單易行，由于酶的消化作用，組織塊更易貼壁生長(zhǎng)，不需要傳統(tǒng)植快 法中如培養(yǎng)瓶鼠尾膠原的處理、小塊的擺放、組織塊的粘附過程等的操作，只需將膠原酶消 化后組織小塊按密度接種即可。
[0019] 4、本發(fā)明對(duì)細(xì)胞損傷小，分離細(xì)胞可在體外連續(xù)傳代，且保留乳腺泌乳的特異性 功能。
[0020] 本發(fā)明方法先將組織小塊消化適當(dāng)時(shí)間再接種培養(yǎng)，國內(nèi)外未見這種方法的報(bào) 道。本發(fā)明的技術(shù)難題在于酶量的選擇、適當(dāng)?shù)南瘯r(shí)間以及合適的接種密度三者一個(gè)綜 合的技術(shù)整體，適當(dāng)?shù)南瘯r(shí)間對(duì)于方法的成功尤為重要，整個(gè)方法需要長(zhǎng)時(shí)間多次重復(fù) 試驗(yàn)才能最終確立。
[0021] 總之，本發(fā)明通過多次的試驗(yàn)探索和數(shù)據(jù)分析，創(chuàng)新的將酶消化法和組織塊法合 二為一，新的方法既綜合了以上兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，又克服了需反復(fù)純化的繁瑣操作，大大提 高了乳腺上皮細(xì)胞的分離純化效率。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】的實(shí)際操作步驟對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。但需說明的是， 本發(fā)明方法絕不局限于所舉的實(shí)施例。
[0023] 實(shí)施例1奶牛乳腺上皮細(xì)胞的分離純化
[0024] 1、乳腺組織的取樣
[0025] 樣品取自本地屠宰場(chǎng)一頭成年泌乳期的黑白花奶牛，無菌手術(shù)剪開乳腺，在實(shí)質(zhì) 部，避開血管、脂肪與結(jié)締組織，采集8mm3大小組織塊，75%酒精浸泡2~3s，在含200U/mL 青霉素和200 μ g/mL鏈霉素的Hank's液中清洗30s左右，置上述Hank's液中冰袋孵育帶 回實(shí)驗(yàn)室。
[0026] 在超凈工作臺(tái)中修剪掉組織塊可見的脂肪和結(jié)締組織，用含150U/mL青霉素和 150 μ g/mL鏈霉素的Hank's液清洗2次，剪碎至1mm3以下大小，再加入30mL此Hank's液， 室溫下震蕩5min，棄去清洗液，如此反復(fù)，直至上清液清亮為止。收集10g左右組織小塊備 用。
[0027] 2、最佳消化酶與消化時(shí)間的篩選
[0028] 1)、消化酶的篩選
[0029] 為了篩選合適的消化酶及酶的合適濃度，我們選取0. 05%胰酶-0. 02% EDTA、 0. 25 % 胰酶-0. 02 % EDTA、100U/mL 膠原酶 I -100U/mL 透明質(zhì)酸酶、200U/mL 膠原酶 I -100U/mL透明質(zhì)酸酶（四種消化液都含100U/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素）各15ml 消化不同時(shí)間后，200目細(xì)胞篩過濾，收集濾取組織小塊進(jìn)行培養(yǎng)，據(jù)培養(yǎng)后溢出成纖維細(xì) 胞團(tuán)塊的比例篩選消化酶，溢出成纖維細(xì)胞團(tuán)塊的比例越低，消化酶消化效果越好。結(jié)果如 表1 :
[0030] 表1 :不同消化液不同消化時(shí)間的消化培養(yǎng)結(jié)果
[0032] 從上表可以看出200U/mL膠原酶I -100U/mL透明質(zhì)酸酶消化培養(yǎng)效果最佳，但 仍需純化以去掉成纖維細(xì)胞，下步可以從膠原酶的濃度和消化時(shí)間上進(jìn)一步篩選最佳的組 合。
[0033] 2)、最適消化時(shí)間的篩選
[0034] 為了確定最適合的消化時(shí)間和最佳的膠原酶濃度，選取200U/mL膠原酶I -100U/ mL透明質(zhì)酸酶、250U/mL膠原酶I -100U/mL透明質(zhì)酸酶、300U/mL膠原酶I -100U/mL透明 質(zhì)酸酶各15ml (四種消化液都含100U/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素）消化不同時(shí)間后， 200目細(xì)胞篩過濾，收集濾取組織小塊進(jìn)行培養(yǎng)，據(jù)培養(yǎng)后溢出成纖維細(xì)胞團(tuán)塊的比例篩選 消化酶，溢出成纖維細(xì)胞團(tuán)塊的比例越低，消化酶消化效果越好。結(jié)果如表2 :
[0035] 表2 :不同膠原酶濃度不同消化時(shí)間的消化培養(yǎng)結(jié)果
[0036]
[0037] 從上表可以看出250U/mL和300U/mL的膠原酶濃度消化2. 5-3h都可以得到較好 的結(jié)果。雖有極低比例的組織塊周邊有極少成纖維細(xì)胞溢出，但原代消化后得到乳腺上皮 細(xì)胞純度達(dá)98%以上，滿足細(xì)胞純化的要求，同時(shí)，原代傳代時(shí)可挑選沒有成纖維細(xì)胞溢出 的傳代。綜合考慮效率、成本，實(shí)施例1選取250U/mL膠原酶I -100U/mL透明質(zhì)酸酶，室溫 消化3h為奶牛乳腺組織的最佳消化組合。
[0038] 3、最適接種密度的篩選
[0039] 將最佳消化酶與消化時(shí)間篩選實(shí)驗(yàn)中，250U/mL膠原酶I -100U/mL透明質(zhì)酸酶， 室溫震蕩消化3h，200目細(xì)胞篩過濾所得的細(xì)胞團(tuán)塊分別按1-5、5-10、10-15塊/ml的密度 接種培養(yǎng)，據(jù)培養(yǎng)效果篩選最適的接種密度。結(jié)果見表3 :
[0040] 表3 :消化后組織塊不同接種密度培養(yǎng)結(jié)果
[0042] 從上表看出5-10塊/ml的接種密度，5-6d就可生長(zhǎng)70%以上，從而傳代培養(yǎng)，有 效的縮短了原代培養(yǎng)的時(shí)間，為最佳接種密度。
[0043] 實(shí)施例2綿羊乳腺上皮細(xì)胞的分離純化培養(yǎng)
[0044] 樣品取自一頭成年妊娠后期綿羊，無菌剪開乳腺，在實(shí)質(zhì)部，避開脂肪和結(jié)締組 織，采集8mm3大小組織塊，75 %酒精浸泡2~3s，在含200U/mL青霉素和200 μ g/mL鏈霉素 的Hank's液中清洗30s左