一種大鼠乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種大鼠乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法，通過將大鼠乳腺組織小塊消化后，將離心沉淀細(xì)胞洗滌、重懸、吹散以及過濾處理后，再將細(xì)胞經(jīng)多次瞬時離心，將沉淀細(xì)胞制備為懸液，將懸液的乳腺上皮細(xì)胞調(diào)整密度后接種培養(yǎng)。本發(fā)明步驟簡單，經(jīng)過3小時的酶消化便可獲得大量活力較高的細(xì)胞；此外，本發(fā)明極大程度的降低了成纖維污染，經(jīng)角蛋白和酪蛋白檢測結(jié)果顯示本發(fā)明獲得的乳腺上皮細(xì)胞純度高且具備良好的分泌功能。
【專利說明】一種大鼠乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種大鼠乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有的大鼠乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法為組織貼塊培養(yǎng)法和膠原酶消化法，其中組織貼塊培養(yǎng)法時間長，步驟繁瑣，細(xì)胞易污染，且獲得的上皮細(xì)胞不均一，影響實驗的重復(fù)性；膠原酶消化法培養(yǎng)盡管能短時間內(nèi)獲取大量的細(xì)胞，但大量的成纖維細(xì)胞被消化下來，乳腺上皮細(xì)胞純度低，貼壁后，乳腺上皮細(xì)胞最終被更易增殖的成纖維細(xì)胞所取代。本發(fā)明克服了組織貼塊培養(yǎng)法步驟繁瑣、易污染的缺點，采取膠原酶與透明質(zhì)酸酶聯(lián)合消化并結(jié)合多次瞬時離心分離乳腺上皮細(xì)胞，盡可能的去除了細(xì)胞沉淀中的成纖維細(xì)胞，同時在培養(yǎng)液中添加胰島素、氫化可的松、轉(zhuǎn)鐵蛋白等生長因子，促進(jìn)了乳腺上皮細(xì)胞的生長，維持乳腺上皮細(xì)胞的體外分泌功能。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種大鼠乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法，旨在解決原代分離培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞純度低，易被成纖維細(xì)胞污染的問題。
[0004]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種大鼠乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法，包括以下步驟:
[0005](1)采集大鼠乳腺組織，將大鼠乳腺組織預(yù)處理后剪碎為11111113大小的大鼠乳腺組織小塊，將所述組織小塊懸浮于消化液中，在371消化31?。?br> [0006](2)消化結(jié)束后，離心取細(xì)胞沉淀，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液洗滌3次以去除脂肪，將細(xì)胞重懸于培養(yǎng)液中，吹散細(xì)胞，經(jīng)100目網(wǎng)篩過濾以去除未消化的組織和碎片；
[0007](3)細(xì)胞經(jīng)多次瞬時離心，棄去上清，向沉淀的上皮細(xì)胞中加入0121作12培養(yǎng)液制備成細(xì)胞懸液；
[0008](4)將懸浮的乳腺上皮細(xì)胞密度調(diào)至5 X從此―1，以每孔2此接種于六孔板或每孔100 ^ I接種于96孔板中，置371、5% 002條件下培養(yǎng)，48卜后第1次換液，去除未貼壁的紅細(xì)胞和碎片，以后每3(1換液1次。
[0009]優(yōu)選地，在步驟(1)中，所述大鼠乳腺組織為妊娠15?18天的大鼠第四、五對乳腺組織；
[0010]所述預(yù)處理為將采集的乳腺組織剝離脂肪組織和結(jié)締組織，置于滅菌培養(yǎng)皿中，預(yù)冷的0-^11^’ 8液漂洗三次。
[0011〕 優(yōu)選地，在步驟⑴中，所述消化液的組成為:101中包括211^ I型膠原酶、100口透明質(zhì)酸酶以及100口青鏈霉素。
[0012]優(yōu)選地，在步驟(2)中，所述含10%胎牛血清的培養(yǎng)液的組成為:0121/512培養(yǎng)液與胎牛血清的體積比為9:1。
[0013]優(yōu)選地，在步驟(3)中，所述瞬時離心為1000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘，重復(fù)10次。
[0014]優(yōu)選地，在步驟⑶中，所述0腿1/512培養(yǎng)液的組成為:111110腿1/512中包括100口青鏈霉素、5 0 8胰島素、1 ^ 8氫化可的松、5 0 8轉(zhuǎn)鐵蛋白、10118表皮生長因子、2 0 11101 1-谷氨酰胺及0.11111胎牛血清。
[0015]相比于現(xiàn)有技術(shù)的缺點和不足，本發(fā)明具有以下有益效果:本發(fā)明步驟簡單，經(jīng)過3小時的酶消化便可獲得大量活力較高的細(xì)胞；此外，本發(fā)明極大程度的降低了成纖維污染，經(jīng)角蛋白和酪蛋白檢測結(jié)果顯示本發(fā)明獲得的乳腺上皮細(xì)胞純度高且具備良好的分泌功能。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是大鼠乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)觀察圖；
[0017]圖2是大鼠乳腺上皮細(xì)胞角蛋白熒光免疫檢測圖；
[0018]圖3是乳腺上皮細(xì)胞@ -酪蛋白的免疫印跡法檢測結(jié)果圖。

【具體實施方式】
[0019]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0020]實施例
[0021](1)選擇妊娠15?18天的大鼠，無菌采集第四、五對乳腺組織，盡量剝離脂肪組織和結(jié)締組織，置于滅菌培養(yǎng)皿中，預(yù)冷的0-他成’ 8液漂洗三次。用眼科剪剪成約1皿3大小的乳腺組織小塊，懸浮于消化液(0腿1/512中添加2呢/此I型膠原酶，100^1透明質(zhì)酸酶、100^/此青鏈霉素)371消化3匕。
[0022](2)消化結(jié)束后，離心取細(xì)胞沉淀，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液洗滌3次以去除脂肪，將細(xì)胞重懸于培養(yǎng)液中，大口吸管吹散細(xì)胞，經(jīng)100目網(wǎng)篩過濾以去除未消化的組織和碎片。
[0023](3)細(xì)胞經(jīng)多次瞬時離心(1000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘；重復(fù)10次)，棄去上清(多為紅細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等)，向沉淀的上皮細(xì)胞中加入0121/512培養(yǎng)液制備成細(xì)胞懸液，培養(yǎng)液中含10011/111[青鏈霉素、5 4 8/此胰島素、8/此氫化可的松、5 0 8/此轉(zhuǎn)鐵蛋白、10118/1^表皮生長因子、2臟01凡卜谷氨酰胺及10%胎牛血清。
[0024](4)將懸浮的乳腺上皮細(xì)胞密度調(diào)至5 X從此―1，以每孔2此接種于六孔板或每孔100 ^ I接種于96孔板中，置371、5% 002條件下培養(yǎng)，48卜后第1次換液，去除未貼壁的紅細(xì)胞和碎片，以后每3(1換液1次。
[0025]用熒光免疫法和1606111 610七分別檢測角蛋白和￠-酪蛋白，如圖1?3所示，圖1為大鼠乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)觀察圖(200^),其中，八圖為細(xì)胞24?48卜內(nèi)貼壁，呈現(xiàn)島嶼狀連接；8圖為培養(yǎng)后5山細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板，融合成單層細(xì)胞。圖2為大鼠乳腺上皮細(xì)胞角蛋白熒光免疫檢測圖(200^),其中，八圖為乳腺上皮細(xì)胞呈角蛋白陽性，圖為陰性對照；8、0圖均為0八？1復(fù)染細(xì)胞核。圖3為乳腺上皮細(xì)胞13 -酪蛋白的免疫印跡法檢測結(jié)果圖，其中，泳道1為尬，泳道2、3、4為分離培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞提取物，結(jié)果顯示酪蛋白分泌為陽性。由上圖結(jié)果顯示分離培養(yǎng)的為上皮細(xì)胞，且具有乳腺分泌功能。
[0026]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種大鼠乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)采集大鼠乳腺組織，將大鼠乳腺組織預(yù)處理后剪碎為Imm3大小的大鼠乳腺組織小塊，將所述組織小塊懸浮于消化液中，在37°C消化3h ； (2)消化結(jié)束后，離心取細(xì)胞沉淀，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液洗滌3次以去除脂肪，將細(xì)胞重懸于培養(yǎng)液中，吹散細(xì)胞，經(jīng)100目網(wǎng)篩過濾以去除未消化的組織和碎片； (3)細(xì)胞經(jīng)多次瞬時離心，棄去上清，向沉淀的上皮細(xì)胞中加入DMEM/F12培養(yǎng)液制備成細(xì)胞懸液； (4)將懸浮的乳腺上皮細(xì)胞密度調(diào)至5X15Hir1,以每孔2mL接種于六孔板或每孔100 μ L接種于96孔板中，置37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)，48h后第I次換液，去除未貼壁的紅細(xì)胞和碎片，以后每3d換液I次。
2.如權(quán)利要求2所述的大鼠乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法，其特征在于，在步驟(I)中，所述大鼠乳腺組織為妊娠15?18天的大鼠第四、五對乳腺組織； 所述預(yù)處理為將采集的乳腺組織剝離脂肪組織和結(jié)締組織，置于滅菌培養(yǎng)皿中，預(yù)冷的D-Hank ’ s液漂洗三次。
3.如權(quán)利要求2所述的大鼠乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法，其特征在于，在步驟(I)中，所述消化液的組成為:1ml DMEM/F12中包括2mg I型膠原酶、100U透明質(zhì)酸酶以及100U青鏈霉素。
4.如權(quán)利要求3所述的大鼠乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述含10%胎牛血清的培養(yǎng)液的組成為:DMEM/F12培養(yǎng)液與胎牛血清的體積比為9:1。
5.如權(quán)利要求4所述的大鼠乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法，其特征在于，在步驟(3)中，所述瞬時離心為1000轉(zhuǎn)/分離心I分鐘，重復(fù)10次。
6.如權(quán)利要求5所述的大鼠乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法，其特征在于，在步驟(3)中，所述DMEM/F12培養(yǎng)液的組成為:lmlDMEM/F12中包括100U青鏈霉素、5 μ g胰島素、I μ g氫化可的松、5 μ g轉(zhuǎn)鐵蛋白、1ng表皮生長因子、2 μ mo I L-谷氨酰胺及0.1ml胎牛血清。
【文檔編號】C12N5/071GK104403992SQ201410738484
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月5日
【發(fā)明者】顧蓓蓓, 盧勁曄, 劉俊棟, 盧煒, 劉靜, 陸江, 馬卉, 苗晉鋒 申請人:中華人民共和國泰州出入境檢驗檢疫局, 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院