專利名稱：從牛初乳中分離乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本項(xiàng)發(fā)明涉及從牛初乳中分離乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)。
背景技術(shù)：
乳腺細(xì)胞的培養(yǎng)，對于研究奶牛泌乳的生理、營養(yǎng)和內(nèi)分泌調(diào)控，揭示影 響奶產(chǎn)量和質(zhì)量的遺傳因素及其分子機(jī)制，探討通過基因選擇、內(nèi)分泌和營養(yǎng) 調(diào)控來提高奶產(chǎn)量具有重要的理論意義和應(yīng)用前景。另外，利用體外培養(yǎng)的乳 腺細(xì)胞系，通過轉(zhuǎn)基因手段將高附加值的藥用蛋白基因?qū)肴橄偌?xì)胞，獲得轉(zhuǎn) 基因乳腺細(xì)胞系，再通過轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆技術(shù)，獲得以奶牛乳腺作為生物反 應(yīng)器的?；蚰膛＃墙窈笾亟M藥用蛋白生產(chǎn)的一個(gè)具有廣闊應(yīng)用前景的領(lǐng)域。
目前，由于乳腺上皮細(xì)胞增殖分化過程受多種細(xì)胞因子和激素等復(fù)雜的時(shí) 空調(diào)控，牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)、尤其是能夠長時(shí)間穩(wěn)定傳代的原代乳腺細(xì)胞 的分離培養(yǎng)仍然是具有很大難度和挑戰(zhàn)性的一項(xiàng)技術(shù)，罕見成功的報(bào)道。
牛乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法常規(guī)的有乳腺組織塊種植法和乳腺組織膠原 酶消化法，從牛初乳中分離培養(yǎng)乳腺細(xì)胞尚未見成功的報(bào)道。組織塊種植法操 作簡便，細(xì)胞不易丟失，適用于小組織量培養(yǎng)。但是從種植的組織塊長出細(xì)胞 需要的時(shí)間較長，成纖維等結(jié)締組織細(xì)胞最先長出，含上皮細(xì)胞豐富的細(xì)胞單 層隨后出現(xiàn)。膠原酶消化法，可獲得更具組織代表性的細(xì)胞群，但工作量相對 大，費(fèi)用高(膠原酶價(jià)格高)。直接用這種消化物的濾過液培養(yǎng)，長出的往往是 上皮和成纖維混雜的細(xì)胞單層，在酶消化過程中還存在丟失和損傷細(xì)胞的危險(xiǎn) 性。有文獻(xiàn)報(bào)道，用膠原酶消化水牛、奶牛乳腺組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，均未獲得正常生長的乳腺細(xì)胞。故有人選擇機(jī)械破碎法，這種方法操作較簡便，比酶消 化法快，但可對細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械損傷。此外，上述三種方法還由于組織取材不太 容易，有一定局限性。為了解決這些問題，我們實(shí)驗(yàn)室采用從牛初乳中分離培 養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞，獲得了較好的效果。該方法樣品材料來源廣泛，取材方便， 操作簡單，避免了酶消化破碎法對細(xì)胞造成的傷害。從乳汁中分離得到的乳腺 細(xì)胞純度高，雜細(xì)胞少，體外培養(yǎng)細(xì)胞生長旺盛，形態(tài)規(guī)整，可用于各種體外 研究。

發(fā)明內(nèi)容
方法
1、 制備培養(yǎng)液 RPMI-1640 、用前添加FBS 20%、胰島素lug/ml、醋酸 鈉5mM、轉(zhuǎn)鐵蛋白10 ug/ml 、青霉素100U/ml、鏈霉素100ug/ml;
2、 包被培養(yǎng)瓶用膠原蛋白包被培養(yǎng)瓶。取少量的膠原蛋白加入培養(yǎng)瓶， 用自制的彎頭玻璃管，將其推開，使之均勻的鋪滿底壁，以傾斜瓶時(shí)不流動(dòng)為 益，將培養(yǎng)瓶蓋擰松，放置于超凈工作臺內(nèi)5—6小時(shí)，用于接種細(xì)胞。
3、 細(xì)胞來源細(xì)胞來自泌乳一周內(nèi)的荷斯坦奶牛乳汁中。用新潔爾滅水清 洗乳房，再用75%酒精擦抹消毒乳頭，用干燥、滅菌的容器采集50—100ml乳汁， 以1000-1500rpm離心20min，仔細(xì)去除上清，用含青霉素100U/ml、鏈霉素 100ug/ml的D-hanks液清洗沉淀的細(xì)胞團(tuán)塊3—4次直到上清液不渾濁為止。
4、 細(xì)胞原代培養(yǎng)及傳代將離心所得細(xì)胞混懸在含20% FBS、 lug/ml胰島 素、5mM醋酸鈉、10ug/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的 RPMI-1640培養(yǎng)液中，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置C02培養(yǎng)箱，在37。C、 5%(:02飽和濕 度下培養(yǎng)，3天后每天觀察1次，從第5天開始每3天更換 一次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80—90%時(shí)，用Trypsin/EDTA消化，收集細(xì)胞，用培養(yǎng)液稀釋制成 細(xì)胞懸液態(tài)觀察初培接入培養(yǎng)瓶中繼代培養(yǎng)。
5、 細(xì)胞形養(yǎng)細(xì)胞為圓形，經(jīng)2—3天，細(xì)胞開始伸偽足生長。此時(shí)細(xì)胞呈 短梭形、三角形或不規(guī)則多角形，第5—6天可見克隆形成。細(xì)胞逐漸向周圍擴(kuò) 展鋪開，成片生長。此時(shí)可觀察到兩種形態(tài)的上皮細(xì)胞，一種為多角形，細(xì)胞間 聯(lián)系緊密，呈大理石狀； 一種為短梭形，細(xì)胞互相銜接，呈鵝卵石狀。隨著細(xì) 胞進(jìn)一步匯合，培養(yǎng)瓶中形成以上皮細(xì)胞為主的不規(guī)則生長區(qū)域。第9—10天 細(xì)胞基本連接成片，達(dá)底面積的80%—90%，有些上皮細(xì)胞區(qū)域的邊緣出現(xiàn)細(xì)胞 堆積現(xiàn)象。繼代培養(yǎng)后，乳腺上皮細(xì)胞出現(xiàn)水泡樣或圓形中空的腺腔樣結(jié)構(gòu)。
6、 乳腺上皮細(xì)胞的免疫組化鑒定運(yùn)用乳腺細(xì)胞的特異性標(biāo)記物抗體可以 對培養(yǎng)的細(xì)胞類型進(jìn)行鑒定。乳腺上皮細(xì)胞中的骨架蛋白主要以角蛋白7、 8和 18為主，是其重要的標(biāo)志蛋白。實(shí)驗(yàn)中，我們選擇角蛋白一18抗體對所建立的 乳腺上皮細(xì)胞系進(jìn)行免疫組化鑒定。經(jīng)FITC標(biāo)記的二抗孵育，在熒光顯微鏡下 觀察，乳腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈綠色熒光信號，而細(xì)胞核中無熒光信號。說明 細(xì)胞中存在乳腺上皮細(xì)胞的標(biāo)志性骨架蛋白pr-角蛋白18，進(jìn)而確定該細(xì)胞系 的乳腺上皮特性。
7、 體外培養(yǎng)的牛乳腺上皮細(xì)胞中P酪蛋白的檢測
對體外原代培養(yǎng)的牛乳腺上皮細(xì)胞中P -酪蛋白的檢測用雙抗夾心ELISA方 法和RT-PCR兩種方法從蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平對原代培養(yǎng)的牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行 檢測，均檢測到了3-酪蛋白。證明所培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞具有泌乳功能。
通過對所培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、免疫組化鑒定、P酪蛋白的檢測等方面 的研究和細(xì)胞來源，證明我們從牛初乳中分離、培養(yǎng)的細(xì)胞確為牛乳腺上皮細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式
采集泌乳一周內(nèi)的荷斯坦奶牛乳汁，經(jīng)反復(fù)離心沉淀，收集細(xì)胞將其混懸
在含20。/。FBS 、 lug/ml胰島素、5mM醋酸鈉、10ug/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、100U/ml青霉 素、100ug/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，接種于用膠原蛋白包被的培養(yǎng)瓶 內(nèi)，置37°C 、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長滿底壁達(dá)80-90%時(shí)，用Trypsin/EDTA 消化，收集細(xì)胞，繼續(xù)傳代培養(yǎng)。
權(quán)利要求
1、一種從牛初乳中分離和培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)液，包括各種培養(yǎng)成份含量是RPMI-164075-80％、胎牛血清20％、胰島素1ug/ml、醋酸鈉5mM、轉(zhuǎn)鐵蛋白10ug/ml、青霉素100U/ml、鏈霉素100ug/ml。
2、 培養(yǎng)瓶包被方法用膠原蛋白包被培養(yǎng)瓶。取少量的膠原蛋白加 入培養(yǎng)瓶，用自制的彎頭玻璃管，將其推開，使之均勻的鋪滿底壁，以傾 斜瓶時(shí)不流動(dòng)為益，將培養(yǎng)瓶蓋擰松，放置于超凈工作臺內(nèi)5—6小時(shí)，用 于接種細(xì)胞。
3、 細(xì)胞來源細(xì)胞來自泌乳一周內(nèi)的荷斯坦奶牛乳汁。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從牛初乳中分離乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法。針對目前乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法中存在的組織取材不易、培養(yǎng)成功率低等問題，我們采用從泌乳2-7天的牛初乳中分離培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞，進(jìn)行原代培養(yǎng)。培養(yǎng)液為RPMI-1640，添加胎牛血清20％、胰島素1μg/ml、醋酸鈉5mM、轉(zhuǎn)鐵蛋白10μg/ml、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml等，培養(yǎng)條件為37℃，5％CO₂。細(xì)胞接種在膠原包被的培養(yǎng)瓶內(nèi)，經(jīng)過15-18天培養(yǎng)，細(xì)胞可鋪滿瓶子底壁，并可傳代。用角蛋白-18抗體對所培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行免疫組化鑒定，結(jié)果呈陽性，證明所培養(yǎng)細(xì)胞系確為乳腺上皮細(xì)胞。用ELLISA和RT-PCR方法從原代培養(yǎng)的牛乳腺上皮細(xì)胞中均檢測到了β-酪蛋白，表明所培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞具有泌乳功能，可用于多種體外研究。
文檔編號C12N5/06GK101591636SQ20081007288
公開日2009年12月2日 申請日期2008年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月26日
發(fā)明者李文蓉, 牛志剛, 譚立新 申請人:新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院中國-澳大利亞綿羊育種研究中心