一種獲得山羊乳腺上皮細(xì)胞單細(xì)胞克隆的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及組織與細(xì)胞工程領(lǐng)域，尤其提供了一種獲得山羊乳腺上皮細(xì)胞單細(xì)胞克隆的方法，該方法通過顯微操作法進(jìn)行單細(xì)胞克隆制備，省去了傳統(tǒng)方法中繁瑣的細(xì)胞計(jì)數(shù)和反復(fù)稀釋，能在短時(shí)間內(nèi)完成單細(xì)胞克隆操作，提高了單細(xì)胞克隆形成率。通過本發(fā)明方法獲得的乳腺上皮細(xì)胞，可以應(yīng)用于研究不同世系乳腺上皮細(xì)胞的功能以及它們在泌乳過程中的相互作用。
【專利說明】一種獲得山羊乳腺上皮細(xì)胞單細(xì)胞克隆的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組織與細(xì)胞工程領(lǐng)域，尤其提供了一種獲得山羊乳腺上皮細(xì)胞單細(xì)胞克隆的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乳腺上皮細(xì)胞是研究乳腺生長發(fā)育、泌乳機(jī)制以及驗(yàn)證乳腺組織特異性表達(dá)載體有效性的體外模型。成熟的乳腺實(shí)質(zhì)中包括三種細(xì)胞，導(dǎo)管上皮、分泌上皮和肌上皮。近年來，研究者建立了眾多的以乳腺上皮細(xì)胞為模型的細(xì)胞系，然而多數(shù)已有研究并不能合適地區(qū)別對待各世系細(xì)胞的功能以及它們在泌乳過程中的相互作用。
[0003]原代乳腺上皮細(xì)胞的獲取方法主要有酶消化法、乳汁分離法以及組織塊培養(yǎng)法等。無論是哪種方法獲得的原代乳腺上皮細(xì)胞都是多世系細(xì)胞的混合體，為了純化培養(yǎng)體系，研究者應(yīng)用了一種或多種方法結(jié)合剔除混雜的細(xì)胞。密度梯度離心方法能夠分離到較為純凈的同質(zhì)細(xì)胞群體，此外差速消化法和差速貼壁法得到了更廣泛的應(yīng)用。然而這些純化方法都不能根本上獲得特定世系的乳腺組織細(xì)胞。
[0004]單細(xì)胞克隆技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于單克隆抗體及其他治療性蛋白的生產(chǎn)，通過該方法可以獲得基因和表型一致的克隆群體。但是通過有限稀釋法或者其他方法獲得單細(xì)胞克隆群體，細(xì)胞都要面臨在極低密度條件下生長的不利局面。多數(shù)研究表明，在極低密度條件下，細(xì)胞的克隆形成率很低。對于長期從事乳腺上皮細(xì)胞相關(guān)研究的實(shí)驗(yàn)室而言，如果能找到一種操作簡便并且單細(xì)胞克隆形成率高的試驗(yàn)方法，將對實(shí)驗(yàn)室的科研工作十分有利。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明基于上述原因，提供了一種獲得山羊乳腺上皮細(xì)胞單細(xì)胞克隆的方法，該方法通過顯微操作法進(jìn)行單細(xì)胞克隆制備，省去了傳統(tǒng)方法中繁瑣的細(xì)胞計(jì)數(shù)和反復(fù)稀釋，能在短時(shí)間內(nèi)完成單細(xì)胞克隆操作，提高了單細(xì)胞克隆形成率。通過本發(fā)明方法可獲得遺傳均一并保持其原有特性的山羊乳腺上皮細(xì)胞單細(xì)胞克隆細(xì)胞群體，可以應(yīng)用于研究不同世系乳腺上皮細(xì)胞的功能以及它們在泌乳過程中的相互作用。
[0006]本發(fā)明的具體技術(shù)方案是：
[0007]—種獲得山羊乳腺上皮細(xì)胞單細(xì)胞克隆的方法，包括以下步驟：
[0008]I)山羊乳腺上皮細(xì)胞的分離和純化；
[0009]2)單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基的制備；
[0010]3)單細(xì)胞克隆的制備；
[0011]其中步驟I山羊乳腺上皮細(xì)胞的分離和純化方法，主要包括以下步驟：
[0012]I)組織取樣：無菌采集山羊乳腺腺泡組織；發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)選用純種嶗山奶山羊泌乳期30天的乳腺腺泡組織時(shí)，可以為后續(xù)工作取得更好的效果。
[0013] 2)分離細(xì)胞：組織塊培養(yǎng)法分離乳腺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，具體步驟為：
[0014]a.用含有200U/mL青霉素和200 μ g/mL鏈霉素的PBS清洗上述獲得的乳腺組織，并將其分割成O. 5-lmm3的小組織塊；
[0015]b.用高濃度血清培養(yǎng)基浸潤a中所述小組織塊，以間隔O. 5cm接種于培養(yǎng)皿底，在37°C、5vt%濃度CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)4小時(shí)，上述高濃度血清培養(yǎng)基為含有50vt%FBS的DF12培養(yǎng)基；
[0016]其中所述的高濃度血清培養(yǎng)基為FBS和DF12以體積比I: I配制出的培養(yǎng)基；這也是本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)的不同之一，現(xiàn)有技術(shù)中一般FBS和DF12是以體積比1:9的配比制備培養(yǎng)基，如下述步驟c中的培養(yǎng)液，但是在該步驟中發(fā)明人卻采用了這種高濃度的血清培養(yǎng)基，實(shí)際上相當(dāng)于傳統(tǒng)方法中在培養(yǎng)皿底包被膠原的步驟，但是該步驟沒有包被膠原那么繁瑣，降低了操作的難度，能夠起到較好的效果，主要體現(xiàn)在I.有利于組織塊的貼壁，2.有利于組織細(xì)胞的游出與生長兩個(gè)方面；同時(shí)，發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)了現(xiàn)有技術(shù)中FBS和DF12以體積比1:9的配比制備培養(yǎng)基之后，發(fā)現(xiàn)這一培養(yǎng)基難以滿足組織貼壁的需要，故而進(jìn)行了多次實(shí)驗(yàn)和調(diào)整后，最終確定了采用FBS和DF12以體積比1:1配制出的培養(yǎng)基；采用這種培養(yǎng)基浸潤組織塊后可以實(shí)現(xiàn)快速貼壁，且這種培養(yǎng)基僅作為浸潤時(shí)使用，并不用于后續(xù)的培養(yǎng)，而由于采用了組織貼壁法，相比與現(xiàn)有的酶消化法獲得的細(xì)胞而言，這種方法避免了長時(shí)間酶消化可能對細(xì)胞造成的損傷。
[0017]c.向上述培養(yǎng)皿中加入培養(yǎng)液，使其剛好覆蓋培養(yǎng)皿底，置于37°C、5vt%濃度CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，12小時(shí)后補(bǔ)加培養(yǎng)液至完全浸沒組織塊為止，2天后更換半量培養(yǎng)液，以后每2天更換半量培養(yǎng)液，總共培養(yǎng)至少8天后即得混合其他細(xì)胞生長的乳腺上皮細(xì)胞，
[0018]上述培養(yǎng)液為體積比FBS ：DF12為1:9的溶液，其中還含有5mg/L牛胰島素、5mg/L氫化可的松、10 μ g/L表皮生長因子和10萬IU/L青鏈霉素雙抗；上述所米用的各種材料均為市場上直接購得，在此不再贅述；
[0019]b步驟中，為了達(dá)到較好的效果且縮短整個(gè)操作的時(shí)間，一般將浸潤時(shí)間控制在2_4min ；
[0020]3)純化細(xì)胞：差速消化法結(jié)合差速貼壁法除去成纖維細(xì)胞，得到純化的乳腺上皮細(xì)胞，具體步驟如下：
[0021]a.差速消化法：向上述混合其他細(xì)胞生長的乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)物中加入消化液消化細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，待成纖維細(xì)胞脫離培養(yǎng)皿底壁時(shí)，吸棄消化液去除成纖維細(xì)胞，利用殘留的消化液繼續(xù)消化1-2分鐘，加入培養(yǎng)液終止消化，將剩余的細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液；
[0022]采用這種差速消化的方式，可以消化去除成纖維細(xì)胞，同時(shí)保留乳腺上皮細(xì)胞。在消化的過程中，成纖維細(xì)胞首先脫離底壁，漂浮在消化液中，而此時(shí)乳腺上皮細(xì)胞還沒有被消化脫離底壁，此時(shí)將瓶內(nèi)的消化液吸棄，從而將成纖維細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞分離，由于底壁還會殘留少量消化液，而且它足以使乳腺上皮細(xì)胞脫離底壁，所以不用再添加新鮮的消化液，此后終止消化、吹打均勻后再傳代培養(yǎng)即可。
[0023]其中所述消化液為等體積混合的不含鈣鎂離子的PBS和O. 25wt%胰蛋白酶的EDTA溶液，消化條件為室溫25°C，成纖維細(xì)胞消化時(shí)間為I. 5-2分鐘，其中所采用的O. 25被％胰蛋白酶的EDTA溶液購自gibco公司，其英文名稱為O. 25%Trypsin-EDTA, 一般使用時(shí)根據(jù)具體使用情況，控制消化液的用量過量即可保證全部消化完成；[0024]所述的培養(yǎng)液為體積比FBS ：DF12為1:9的溶液，其中還含有5mg/L牛胰島素、5mg/L氫化可的松、10 μ g/L表皮生長因子和10萬IU/L青鏈霉素雙抗；
[0025]b.差速貼壁法：將上述的單細(xì)胞懸液移入新的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)20分鐘，待成纖維細(xì)胞貼壁后，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)液至另一個(gè)新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，原培養(yǎng)皿添加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如此轉(zhuǎn)移3次，每次轉(zhuǎn)移的時(shí)間間隔均為20分鐘，12小時(shí)后更換培養(yǎng)液，以后每2天換液一次；
[0026]上述各培養(yǎng)皿培養(yǎng)3-4天后，選擇其中純化程度和生長密度最好的培養(yǎng)皿，重復(fù)步驟a和步驟b進(jìn)行傳代純化，如此傳至第4代即得到純化的乳腺上皮細(xì)胞。
[0027]之所以采用b步驟這種方法，主要原因在于：由于貼壁速度的差異，通過轉(zhuǎn)移含有細(xì)胞的培養(yǎng)液，將貼壁速度快的成纖維細(xì)胞留在原先的培養(yǎng)皿中，而未及時(shí)貼壁的乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中，從而達(dá)到純化乳腺上皮細(xì)胞的目的；
[0028]而再轉(zhuǎn)移3次的意思是：將a步驟中獲得的單細(xì)胞懸液依次轉(zhuǎn)移經(jīng)過4個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿中停留20分鐘，每次轉(zhuǎn)移的均是培養(yǎng)皿中停留20分鐘的培養(yǎng)液，這樣就使得培養(yǎng)液中的細(xì)胞按順序在4個(gè)培養(yǎng)皿中貼壁，由于成纖維細(xì)胞貼壁快于乳腺上皮細(xì)胞，所以轉(zhuǎn)移經(jīng)過的前兩個(gè)培養(yǎng)皿，成纖維細(xì)胞快速貼壁，而后兩個(gè)培養(yǎng)皿貼壁得到的是較為純凈的乳腺上皮細(xì)胞，每次轉(zhuǎn)移后再在原培養(yǎng)皿中補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，2-3天后比較各培養(yǎng)皿細(xì)胞形態(tài)，選擇最佳繼續(xù)純化即可，而之所以限定總共轉(zhuǎn)移的次數(shù)為3次，主要原因在于如果轉(zhuǎn)移兩次可能分離不徹底，轉(zhuǎn)移次數(shù)過多貼壁存活的細(xì)胞也會大大減少，浪費(fèi)試劑及實(shí)驗(yàn)材料。實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)移3次可以充分分離成纖維細(xì)胞，得到純化的乳腺上皮細(xì)胞。
[0029]而之所以選擇培養(yǎng)皿培養(yǎng)3-4天后進(jìn)行傳代純化，主要原因就是采用本發(fā)明的方法后，一般需要上述的時(shí)間，才能保證貼壁細(xì)胞增殖并占據(jù)培養(yǎng)皿底壁面積的90%左右，才能達(dá)到傳代的要求；而如果細(xì)胞貼壁很多，2天左右即可傳代，如果貼壁較少，則需要生長更長時(shí)間才能傳代，因此3-4天為一般性選擇；
[0030]選擇其中純化程度和 生長密度最好的培養(yǎng)皿時(shí)，一般采用現(xiàn)有技術(shù)的常用方法進(jìn)行判定，如觀察細(xì)胞形態(tài)，本發(fā)明的具體做法是：鑒于成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞的形態(tài)不同，這里選擇的標(biāo)準(zhǔn)是顯微鏡下觀察到的成纖維細(xì)胞數(shù)量最少，細(xì)胞形態(tài)一致生長密度最佳，選取這種培養(yǎng)皿繼續(xù)進(jìn)行純化培養(yǎng)，其后期獲得的乳腺上皮細(xì)胞純化效果最好；
[0031]本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明的方法后，一般經(jīng)過4代的純化后就能得到形態(tài)一致的乳腺上皮細(xì)胞，再經(jīng)過多次傳代也沒有出現(xiàn)成纖維細(xì)胞明顯生長的現(xiàn)象，說明純化4代即可得到充分純化的乳腺上皮細(xì)胞，而低于4代則達(dá)不到最佳的純化效果，故而選擇純化至第4代即可，純化次數(shù)過多則會浪費(fèi)大量細(xì)胞，而且會增加整個(gè)方法的成本。
[0032]除了上述的分離純化方法外，可以采用現(xiàn)有技術(shù)中的分離純化方法，只要能夠提供乳腺上皮細(xì)胞即可；
[0033]而本發(fā)明的最重要特點(diǎn)則是：
[0034]步驟2單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基的制備，具體包括如下步驟：
[0035]a.細(xì)胞培養(yǎng)基的配制：配制體積比FBS ：DF12為1:9的溶液，其中還含有5mg/L牛胰島素、5mg/L氫化可的松、10 μ g/L表皮生長因子和10萬IU/L青鏈霉素雙抗；
[0036]b.細(xì)胞培養(yǎng)基處理：
[0037]在進(jìn)行第四代傳代培養(yǎng)的時(shí)候，在細(xì)胞傳代24小時(shí)后，將培養(yǎng)基更換成上述全新的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6-8小時(shí)后收獲培養(yǎng)基，離心除去雜質(zhì)、微孔濾膜過濾除菌，分裝后置于_20°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0038]其中所述的濾膜孔徑大小為O. 20 μ m ;
[0039]c.單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基的配制：將上述處理獲得的培養(yǎng)基與步驟a配制的細(xì)胞培養(yǎng)基等體積混合，再加入0.05倍體積的FBS，分裝后置于_20°C冰箱保存?zhèn)溆?；這樣就可以獲得細(xì)胞生長產(chǎn)生的有益因子，以幫助單細(xì)胞的生長；
[0040]步驟3單細(xì)胞克隆的制備，[0041]a.消化細(xì)胞：消化第四代山羊乳腺上皮細(xì)胞并吹打成單細(xì)胞懸液；
[0042]b.稀釋細(xì)胞懸液：移取201^細(xì)胞懸液稀釋于含有51^、371：預(yù)熱后的單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基的60mm培養(yǎng)皿中，吹打均勻，一般控制使其在40倍視野下觀察到細(xì)胞之間有較大間距；
[0043]c.單細(xì)胞顯微操作：在40倍視野下用IOyL微量移液器吸取單個(gè)細(xì)胞，接種于含有37°C預(yù)熱后的單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基的24孔板中；[0044]上述a步驟中，所采用的消化方式為胰蛋白酶常規(guī)消化方式，采用常用的實(shí)驗(yàn)用
O.25%胰蛋白酶、37°C、2-5分鐘即可完成；
[0045]上述操作過程在25分鐘之內(nèi)完成，其主要原因在于：操作時(shí)間過長會明顯降低細(xì)胞的成活率，控制縮短操作時(shí)間有利于減少細(xì)胞在不良外界環(huán)境中的暴露時(shí)間，提高單細(xì)胞克隆形成率。
[0046]d.傳代培養(yǎng)：培養(yǎng)觀察并選取合適的單細(xì)胞克隆群落。
[0047]將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，24小時(shí)后在倒置顯微鏡下觀察,標(biāo)記含有1-3個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)孔并補(bǔ)加500 μ L單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基；總共培養(yǎng)48-72小時(shí)后，在顯微鏡下用無菌槍頭剔除多余的細(xì)胞，使得選定的每孔含有一個(gè)細(xì)胞，更換單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)；以后每48小時(shí)更換一半培養(yǎng)液并觀察，4-5天后即可得到單細(xì)胞克隆群落。
[0048]上述篩選出的單細(xì)胞克隆群落即可采用常規(guī)方法對單細(xì)胞克隆群落進(jìn)行傳代和培養(yǎng)。
[0049]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明在單細(xì)胞克隆階段采用了特殊的單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由新配制的培養(yǎng)基、經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)處理后的培養(yǎng)基以及額外添加的胎牛血清（FBS)組成，采用這種構(gòu)成的單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基，較之現(xiàn)有技術(shù)有了很大的進(jìn)步，其原因在于經(jīng)過處理后，單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基內(nèi)增加了促進(jìn)細(xì)胞生長分裂的有益因子，同時(shí)加上額外添加的血清，能夠明顯提高單細(xì)胞克隆的形成率。
[0050]另外，本發(fā)明的發(fā)明人一改傳統(tǒng)的96孔板單克隆培養(yǎng)方法，采用了 24孔板單克隆培養(yǎng)方法，這樣就縮短制備單克隆操作所需要的時(shí)間和擴(kuò)大單細(xì)胞克隆群的選擇空間。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單克隆制備所需要的時(shí)間越長，細(xì)胞的存活率就越低，這是因?yàn)樵谥苽溥^程中，細(xì)胞長時(shí)間處于不利的外界環(huán)境中造成的。使用24孔板制備單細(xì)胞克隆的時(shí)間明顯低于96孔板，有利于保持細(xì)胞的活力，提高細(xì)胞的成活率，因此本方法也對操作所需時(shí)間做了限定；使用96孔板制備單細(xì)胞克隆，通常只選留含有一個(gè)細(xì)胞的板孔繼續(xù)培養(yǎng)，然而實(shí)際操作中，不含有細(xì)胞或者含有多于一個(gè)細(xì)胞的板孔不在少數(shù)，因而選擇空間有限，而使用孔口較大的24孔板時(shí)，可以對多于I個(gè)細(xì)胞的板孔進(jìn)行剔除多余細(xì)胞或者在多個(gè)細(xì)胞中選擇生長最佳的細(xì)胞，這樣做能明顯提高單克隆的形成率。[0051]除此之外，在乳腺上皮細(xì)胞分離與純化過程中，采用了 FBS和DF12以體積比1:1配制出的高濃度血清培養(yǎng)基，浸潤小組織塊后直接貼壁培養(yǎng)，分離得到乳腺上皮細(xì)胞。使用該方法不但避免了長時(shí)間酶消化可能對細(xì)胞造成的損傷，同時(shí)省去了傳統(tǒng)方法中制備膠原的步驟，獲得了組織貼壁良好，細(xì)胞生長旺盛的混合培養(yǎng)體系。純化法中采用的消化液的濃度、消化成纖維細(xì)胞的時(shí)間、溫度以及差速貼壁時(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)移的次數(shù)和轉(zhuǎn)移時(shí)間間隔均為本發(fā)明所特有，與現(xiàn)有技術(shù)有著較大的差距。本方法的特點(diǎn)是采用組織貼壁法分離細(xì)胞，低濃度胰蛋白酶快速消化分離成纖維細(xì)胞，最大限度降低了酶消化對細(xì)胞造成的不良影響，同時(shí)結(jié)合連續(xù)轉(zhuǎn)移的純化方法保證了上皮細(xì)胞的純度、活力以及其本身固有的特性。
[0052]綜上所述，本發(fā)明提供的方法省去了傳統(tǒng)方法中繁瑣的細(xì)胞計(jì)數(shù)和反復(fù)稀釋，能在短時(shí)間內(nèi)完成單細(xì)胞克隆操作，提高了單細(xì)胞克隆形成率，傳統(tǒng)方法制備單細(xì)胞克隆的克隆形成率很低，而本研究中使用的制備方法，可使克隆形成率提高至80%以上；通過本發(fā)明方法可獲得遺傳均一并保持其原有特性的山羊乳腺上皮細(xì)胞單細(xì)胞克隆細(xì)胞群體，可以應(yīng)用于研究不同世系乳腺上皮細(xì)胞的功能以及它們在泌乳過程中的相互作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0053]圖I是組織塊培養(yǎng)法獲得的第一代混合生長的乳腺細(xì)胞；
[0054]圖2是純化的第4代乳腺上皮細(xì)胞；
[0055]圖3是生長至第5天的單細(xì)胞克隆群落；
[0056]圖4是傳代培養(yǎng)的單克隆乳腺上皮細(xì)胞；
[0057]圖5是單克隆乳腺上皮細(xì)胞角蛋白免疫熒光鑒定結(jié)果圖；
【具體實(shí)施方式】
[0058]下面通過具體的制備實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但是，應(yīng)當(dāng)理解為，這些實(shí)施例和試驗(yàn)例僅僅是用于更詳細(xì)具體地說明之用，而不應(yīng)理解為用于以任何形式限制本發(fā)明。
[0059]實(shí)施例I山羊乳腺上皮細(xì)胞的取樣與處理
[0060]采用現(xiàn)有技術(shù)直接無菌采集青島奧特種羊場純種嶗山奶山羊泌乳期30天的乳腺組織；
[0061]用PBS沖洗采集的乳腺組織塊，除去其表面的血液和羊奶；沖洗干凈后浸入含有200U/mL青霉素和200 μ g/mL鏈霉素的DFl2培養(yǎng)基中，置于冰盒內(nèi)迅速帶回實(shí)驗(yàn)室處理，用含有200U/mL青霉素和200 μ g/mL鏈霉素的PBS反復(fù)沖洗乳腺組織，直到?jīng)_洗液變清亮為止，在超凈臺上分割修剪，去除脂肪組織和結(jié)締組織并沖洗至沖洗液清亮，即可得到白色顆粒狀的腺泡組織。
[0062]實(shí)施例2組織塊培養(yǎng)法分離乳腺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞
[0063]a.用眼科剪和眼科鑷將上述白色顆粒狀的腺泡組織分割成O. 5-lmm3左右的小組織塊，再用含有200U/mL青霉素和200 μ g/mL鏈霉素的PBS漂清獲得的小組織塊；
[0064]b.用FBS和DF12以體積比I: I配制出的培養(yǎng)基浸潤所述小組織塊2_4分鐘，間隔
O.5cm接種于培養(yǎng)皿底，置于37°C、5vt%濃度CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)4小時(shí)；
[0065]c.向上述培養(yǎng)皿中加入培養(yǎng)液，使其剛好覆蓋培養(yǎng)皿底，置于37°C、5vt%濃度CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，12小時(shí)后補(bǔ)加培養(yǎng)液至完全浸沒組織塊為止，2天后更換半量培養(yǎng)液，以后每2天更換半量培養(yǎng)液，5天左右可以看到組織塊周圍有細(xì)胞遷出，8天左右可以看到混合生長的乳腺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。
[0066]將原代細(xì)胞消化傳代，即可得到更為明顯的混合生長的乳腺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。如圖I所示，島嶼狀聚集生長的橢圓形或鋪路石狀細(xì)胞為乳腺上皮細(xì)胞，乳腺上皮細(xì)胞周圍游離生長的長形或梭形細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。
[0067]上述培養(yǎng)液為體積比FBS ：DF12為1:9的溶液，其中還含有5mg/L牛胰島素、5mg/L氫化可的松、10 μ g/L表皮生長因子和10萬IU/L青鏈霉素雙抗。
[0068]實(shí)施例3
[0069]速消化法結(jié)合差速貼壁法除去成纖維細(xì)胞，得到純化的乳腺上皮細(xì)胞，具體步驟如下：
[0070]a.差速消化法：向上述混合其他細(xì)胞生長的乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)物中加入消化液消化細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，待成纖維細(xì)胞脫離培養(yǎng)皿底壁時(shí)，吸棄消化液去除成纖維細(xì)胞，利用殘留的消化液繼續(xù)消化1-2分鐘，加入培養(yǎng)液終止消化，將剩余的細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液；
[0071]其中所述消化液為等體積混合的不含鈣鎂離子的PBS和O. 25%Trypsin-EDTA溶液，消化條件為室溫25°C，成纖維細(xì)胞消化時(shí)間為I. 5-2分鐘；
[0072]所述的培養(yǎng)液為體積比FBS ：DF12為1:9的溶液，其中還含有5mg/L牛胰島素、5mg/L氫化可的松、10 μ g/L表皮生長因子和10萬IU/L青鏈霉素雙抗；
[0073]b.差速貼壁法：將上述的單細(xì)胞懸液移入新的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)20分鐘，待成纖維細(xì)胞貼壁后，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)液至另一個(gè)新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，20分鐘后再次轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中，如此轉(zhuǎn)移3次，原培養(yǎng)皿添 加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，12小時(shí)后更換培養(yǎng)液，以后每2天換液一次，直至貼壁生長的細(xì)胞占據(jù)培養(yǎng)皿底面積的90%左右，時(shí)間一般為3-4天；
[0074]選擇步驟b中純化程度和生長密度最好的培養(yǎng)皿，重復(fù)步驟a和步驟b進(jìn)行傳代純化，如此傳至第4代即得到純化的乳腺上皮細(xì)胞。如圖2所示，細(xì)胞形態(tài)整齊，呈橢圓形或鋪路石狀，為典型的上皮細(xì)胞形態(tài)。
[0075]實(shí)施例4單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基的制備，具體包括如下步驟：
[0076]a.細(xì)胞培養(yǎng)基的配制：配制體積比FBS ：DF12為1:9的溶液，其中還含有5mg/L牛胰島素、5mg/L氫化可的松、10 μ g/L表皮生長因子和10萬IU/L青鏈霉素雙抗；
[0077]b.細(xì)胞培養(yǎng)基處理：
[0078]在進(jìn)行第四代傳代培養(yǎng)的時(shí)候，在細(xì)胞傳代24小時(shí)后，將培養(yǎng)基更換成上述全新的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6-8小時(shí)后收獲培養(yǎng)基，離心除去雜質(zhì)、微孔濾膜過濾除菌，分裝后置于_20°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0079]其中所述的濾膜孔徑大小為O. 20 μ m ;
[0080]c.單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基的配制：將上述處理獲得的培養(yǎng)基與步驟a配制的細(xì)胞培養(yǎng)基等體積混合，再加入0.05倍體積的FBS，分裝后置于_20°C冰箱保存?zhèn)溆茫贿@樣就可以獲得細(xì)胞生長產(chǎn)生的有益因子，以幫助單細(xì)胞的生長。
[0081]實(shí)施例5單細(xì)胞克隆的制備，
[0082]a.消化細(xì)胞：消化第四代山羊乳腺上皮細(xì)胞并吹打成單細(xì)胞懸液；
[0083]b.稀釋細(xì)胞懸液：移取201^細(xì)胞懸液稀釋于含有51^、371：預(yù)熱后的單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基的60mm培養(yǎng)皿中，吹打均勻，使其在40倍視野下觀察到細(xì)胞之間有較大間距；
[0084]c.單細(xì)胞顯微操作：在40倍視野下用IOyL微量移液器吸取單個(gè)細(xì)胞，接種于含有37°C預(yù)熱后的單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基的24孔板中；
[0085]上述a步驟中，所采用的消化方式為胰蛋白酶常規(guī)消化方式，采用常用的實(shí)驗(yàn)用O. 25%胰蛋白酶、37°C、2-5分鐘即可完成；
[0086]上述操作過程在25分鐘之內(nèi)完成，其主要原因在于：操作時(shí)間過長會明顯降低細(xì)胞的成活率，控制縮短操作時(shí)間有利于減少細(xì)胞在不良外界環(huán)境中的暴露時(shí)間，提高單細(xì)胞克隆形成率。
[0087]d.傳代培養(yǎng)：培養(yǎng)觀察并選取合適的單細(xì)胞克隆群落。
[0088]將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，24小時(shí)后在倒置顯微鏡下觀察,標(biāo)記含有1-3個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)孔并補(bǔ)加500 μ L單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基；總共培養(yǎng)48-72小時(shí)后，在顯微鏡下用無菌槍頭剔除多余的細(xì)胞，使得選定的每孔含有一個(gè)細(xì)胞，更換單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。以后每48小時(shí)更換一半培養(yǎng)液并觀察，4-5天后即可得到單細(xì)胞克隆群落，如附圖3所示，單細(xì)胞分裂增殖形成近似圓形的單克隆群落。傳代后得到形態(tài)一致的乳腺上皮細(xì)胞，如附圖4所示，細(xì)胞呈橢圓形，為典型的上皮細(xì)胞形態(tài)。
[0089]實(shí)施例6上皮細(xì)胞角蛋白免疫熒光鑒定
[0090]對傳代培養(yǎng)的單細(xì)胞克隆山羊乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行角蛋白18免疫熒光鑒定，所用方法參照武漢博士德生物工程有限公司免疫熒光試劑盒說明書，操作完成后用Hoechst33342復(fù)染細(xì)胞核，倒置熒光顯微鏡觀察并拍照，其結(jié)果如圖5所示。圖中紅色熒光部分為表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中的角蛋白18，藍(lán)色部分為Hoechst33342染色的細(xì)胞核，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明了本發(fā)明通過單細(xì)胞克隆法獲得的細(xì)胞類型為奶山羊乳腺上皮細(xì)胞。
【權(quán)利要求】
1.一種獲得山羊乳腺上皮細(xì)胞單細(xì)胞克隆的方法，包括以下步驟： 1)山羊乳腺上皮細(xì)胞的分離和純化； 2)單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基的制備； 3)單細(xì)胞克隆的制備； 其特征在于： 所述步驟2單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基的制備，具體包括如下步驟： a.細(xì)胞培養(yǎng)基的配制：配制體積比FBS：DF12為1:9的溶液，其中還含有5mg/L牛胰島素、5mg/L氫化可的松、10μ g/L表皮生長因子和10萬IU/L青鏈霉素雙抗； b.細(xì)胞培養(yǎng)基處理： 在進(jìn)行第四代傳代培養(yǎng)的時(shí)候，在細(xì)胞傳代24小時(shí)后，將培養(yǎng)基更換成上述全新的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6-8小時(shí)后收獲培養(yǎng)基，離心除去雜質(zhì)、微孔濾膜過濾除菌，分裝后置于_20°C冰箱保存?zhèn)溆茫? c.單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基的配制：將上述處理獲得的培養(yǎng)基與步驟a配制的細(xì)胞培養(yǎng)基等體積混合，再加入0.05倍體積的FBS，分裝后置于_20°C冰箱保存?zhèn)溆茫? 所述步驟3單細(xì)胞克隆的制備，具體步驟如下： a.消化細(xì)胞：消化第四代山羊乳腺上皮細(xì)胞并吹打成單細(xì)胞懸液； b.稀釋細(xì)胞懸液：移取2(^1^細(xì)胞懸液稀釋于含有51^、371：預(yù)熱后的單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基的60mm培養(yǎng)皿中，吹打均勻； c.單細(xì)胞顯微操作：在40倍視野下用IOyL微量移液器吸取單個(gè)細(xì)胞，接種于含有37°C預(yù)熱后的單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基的24孔板中； 上述a步驟中，所采用的消化方式為胰蛋白酶常規(guī)消化方式，采用常用的實(shí)驗(yàn)用O. 25%胰蛋白酶、37°C、2-5分鐘即可完成； d.傳代培養(yǎng)：培養(yǎng)觀察并選取合適的單細(xì)胞克隆群落： 將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，24小時(shí)后在倒置顯微鏡下觀察，標(biāo)記含有1-3個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)孔并補(bǔ)加500 μ L單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基；總共培養(yǎng)48-72小時(shí)后，在顯微鏡下用無菌槍頭剔除多余的細(xì)胞，使得選定的每孔含有一個(gè)細(xì)胞，更換單細(xì)胞克隆培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)；以后每48小時(shí)更換一半培養(yǎng)基并觀察，4-5天后即可得到單細(xì)胞克隆群落。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲得山羊乳腺上皮細(xì)胞單細(xì)胞克隆的方法，其特征在于：所述步驟（I)山羊乳腺上皮細(xì)胞的分離和純化主要包括以下步驟： O組織取樣：無菌采集山羊乳腺腺泡組織； 2)分離細(xì)胞：組織塊培養(yǎng)法分離乳腺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞； 3)純化細(xì)胞：差速消化法結(jié)合差速貼壁法除去成纖維細(xì)胞即可得到純化的乳腺上皮細(xì)胞。
【文檔編號】C12N5/071GK103484424SQ201310430440
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月10日
【發(fā)明者】王建民, 陳存仙, 董飛, 王桂芝, 張賽賽, 秦孜娟 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)