從乳汁中分離和培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的方法及專用培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種從乳汁中分離和培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的方法及專用培養(yǎng)基。本發(fā)明公開(kāi)一種從牛乳汁中分離和培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞的方法，包括如下步驟：選擇牛乳汁中體細(xì)胞數(shù)低于5×104個(gè)/ml并且處于泌乳中后期的牛，采集牛乳汁；分離并培養(yǎng)牛乳汁中的乳腺上皮細(xì)胞。本發(fā)明公開(kāi)的方法通過(guò)奶牛生產(chǎn)記錄限定適宜乳汁采樣牛只的條件以及確定收集期為泌乳中后期，通過(guò)人工擠奶方法，簡(jiǎn)便、快速，經(jīng)濟(jì)的獲得牛奶樣品，并分離、培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞，結(jié)果可靠、穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單，適合常規(guī)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)需要，成本低、細(xì)胞狀態(tài)好，同時(shí)與組織塊培養(yǎng)法相比，僅需獲得牛乳樣品，對(duì)牛只沒(méi)有損傷，操作簡(jiǎn)單，適用范圍更廣。
【專利說(shuō)明】從乳汁中分離和培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的方法及專用培養(yǎng)基

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從乳汁中分離和培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的方法及專用培養(yǎng)基，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]乳房是母畜特有的哺育器官，泌乳期乳腺內(nèi)充滿豐富的腺泡和導(dǎo)管(崔立莉，2006)。乳腺是由外層肌上皮和內(nèi)層分泌上皮細(xì)胞圍成的球形結(jié)構(gòu)，與導(dǎo)管相連，其中分泌上皮是腺泡內(nèi)合成乳成分的基本單元，是其行使泌乳功能的基礎(chǔ)。因此，它是研究乳成分合成和變動(dòng)機(jī)制、乳腺發(fā)育和變化以及乳腺腫瘤形成、癌變的相關(guān)因子和基因的不可或缺的實(shí)驗(yàn)材料(杜鵑等，2007)。
[0003]目前，乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)歷史已有100多年，作為一種高度分化的成體細(xì)胞，其在離體培養(yǎng)一段時(shí)間后往往出現(xiàn)形態(tài)和特性的脫分化，趨向變?yōu)槌衫w維樣的狀態(tài)(Ebner等，1961)。有限二倍體細(xì)胞由于脫離正常的體內(nèi)環(huán)境，原代培養(yǎng)后逐漸脫分化的現(xiàn)象是很常見(jiàn)的。面對(duì)這種問(wèn)題，研究人員用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將SV40、原癌基因和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因等外源基因整合到有限細(xì)胞內(nèi)，可獲得永生性的轉(zhuǎn)化細(xì)胞(陶謙等，2001)。永生性細(xì)胞在保持著部分與起源細(xì)胞相似的生物特性和表型的同時(shí)，也表現(xiàn)出一些轉(zhuǎn)化和純化培養(yǎng)后的新特點(diǎn)。外源基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組的位置不確定，其插入位點(diǎn)可能影響到細(xì)胞原有基因的功能，克隆細(xì)胞由于缺少細(xì)胞互作的影響也表現(xiàn)出新的特征。已有的永生化乳腺上皮細(xì)胞系對(duì)因子刺激的反應(yīng)和乳成分的表達(dá)存在差異，這些不確定性使其應(yīng)用受到限制。
[0004]由于永生化細(xì)胞的諸多不確定性，原代細(xì)胞系更能代表體內(nèi)的器官特異性功能和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。一般體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞可以穩(wěn)定培養(yǎng)幾個(gè)月，能滿足細(xì)胞實(shí)驗(yàn)周期的需要。因此，多數(shù)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)還是首選原代培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞(Pantsckenko等，2000)。原代細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次傳代后丟掉一些原始的受限制的特性，在生長(zhǎng)率、乳汁合成、對(duì)因子刺激的反應(yīng)和敏感性上與體內(nèi)細(xì)胞存在差異。不過(guò)，這個(gè)問(wèn)題可以通過(guò)低溫貯存新鮮分離的細(xì)胞來(lái)解決，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞運(yùn)用冷凍解凍技術(shù)(Bramley等，1982)，以保持其原有細(xì)胞特性，讓符合研究需求的原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞能夠得到長(zhǎng)久保存，使在不同實(shí)驗(yàn)條件下分析同一原始特性細(xì)胞的特征成為可能。同時(shí)，可通過(guò)添加一些生物活性因子(胰島素，氫化可的松，表皮生長(zhǎng)因子，轉(zhuǎn)鐵蛋白等)促進(jìn)細(xì)胞增殖和維持細(xì)胞特性，延緩細(xì)胞脫分化。
[0005]目前國(guó)內(nèi)培養(yǎng)原代乳腺上皮細(xì)胞通常采用的方法為組織塊培養(yǎng)法，這種方法通過(guò)活體穿刺或屠宰獲得活體組織，一方面對(duì)牛體的損害較大、購(gòu)買健康成體牛的成本高；另一方面，多獲得的是淘汰牛的活體組織，難以獲得高產(chǎn)牛的組織樣品。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種從乳汁中分離和培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的方法及專用培養(yǎng)基。
[0007]本發(fā)明提供一種從牛乳汁中分離和培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞的方法，包括如下步驟:選擇牛乳汁中體細(xì)胞數(shù)低于5X 14個(gè)/ml并且處于泌乳中后期的牛，采集牛乳汁；分離并培養(yǎng)牛乳汁中的乳腺上皮細(xì)胞；
[0008]所述泌乳中后期為產(chǎn)犢后150-250d ；
[0009]所述采集牛乳汁時(shí)前50_100ml牛乳汁不收集。
[0010]上述方法中，所述分離并培養(yǎng)牛乳汁中的乳腺上皮細(xì)胞包括分離并培養(yǎng)原代牛乳腺上皮細(xì)胞，再將原代牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到傳代的牛乳腺上皮細(xì)胞。
[0011]上述任一所述的方法中，所述原代牛乳腺上皮細(xì)胞和傳代的牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)使用的培養(yǎng)基按照如下方法制備:將DMEM/DF12培養(yǎng)基和FBS按照體積比為9:1混勻，加入終濃度為IX的青霉素，終濃度為IX的鏈霉素，終濃度為5ug/mL的胰島素,終濃度為5ug/mL的轉(zhuǎn)鐵蛋白，終濃度為5ug/mL的氫化可的松，終濃度為10ng/mL的表皮生長(zhǎng)因子，終濃度為lug/mL的孕酮，終濃度為10ng/mL的重組牛胎盤催乳素；
[0012]所述DMEM/DF12培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco，產(chǎn)品目錄號(hào)為C11330500BT ；
[0013]所述終濃度為IX的青霉素和終濃度為IX的鏈霉素的母液是濃度為100X的青霉素/鏈霉素雙抗溶液；
[0014]所述濃度為100X的青霉素/鏈霉素雙抗溶液的商品名稱為青霉素/鏈霉素雙抗溶液(100X)，購(gòu)自Gibco，產(chǎn)品目錄號(hào)為15140-122 ；
[0015]所述重組牛胎盤催乳素購(gòu)自Prospec，產(chǎn)品目錄號(hào)為CYT-511。
[0016]上述任一所述的方法中，所述牛為奶牛。
[0017]上述任一所述的方法中，所述奶牛為荷斯坦牛。
[0018]—種培養(yǎng)基也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，按照如下方法制備:將DMEM/DF12培養(yǎng)基和FBS按照體積比為9:1混勻，加入終濃度為I X的青霉素，終濃度為I X的鏈霉素，終濃度為5ug/mL的胰島素,終濃度為5ug/mL的轉(zhuǎn)鐵蛋白，終濃度為5ug/mL的氫化可的松,終濃度為10ng/mL的表皮生長(zhǎng)因子，終濃度為lug/mL的孕酮，終濃度為10ng/mL的重組牛胎盤催乳素；
[0019]所述DMEM/DF12培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco，產(chǎn)品目錄號(hào)為C11330500BT ；
[0020]所述終濃度為IX的青霉素和終濃度為IX的鏈霉素的母液是濃度為100X的青霉素/鏈霉素雙抗溶液；
[0021]所述濃度為100X的青霉素/鏈霉素雙抗溶液的商品名稱為青霉素/鏈霉素雙抗溶液(100X)，購(gòu)自Gibco，產(chǎn)品目錄號(hào)為15140-122 ；
[0022]所述重組牛胎盤催乳素購(gòu)自Prospec，產(chǎn)品目錄號(hào)為CYT-511。
[0023] 本發(fā)明提供的方法通過(guò)奶牛生產(chǎn)記錄限定適宜乳汁采樣牛只的條件以及確定收集期為泌乳中后期，通過(guò)人工擠奶的方法，簡(jiǎn)便、快速，經(jīng)濟(jì)的獲得牛奶樣品，并分離、培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞，結(jié)果可靠、穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單，適合常規(guī)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)需要，成本低、獲得的細(xì)胞狀態(tài)好。本發(fā)明的方法與組織塊培養(yǎng)法相比，僅需獲得牛乳樣品，對(duì)牛只沒(méi)有損傷，操作簡(jiǎn)單，適用范圍更廣。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1為從乳汁中分離的原代乳腺上皮細(xì)胞的形態(tài)。
[0025]圖2為牛乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
[0026]圖3為乳腺上皮細(xì)胞的角蛋白18染色結(jié)果。
[0027]圖4為乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)乳成分相關(guān)基因的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0028]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0029]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0030]DMEM/DF12培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco，產(chǎn)品目錄號(hào)為C11330500BT。
[0031]胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco，產(chǎn)品目錄號(hào)為10099-141。
[0032]青霉素/鏈霉素雙抗溶液(100X)購(gòu)自Gibco，產(chǎn)品目錄號(hào)為15140-122。
[0033]胰島素(牛，細(xì)胞級(jí))購(gòu)自Sigma，產(chǎn)品目錄號(hào)為15500。
[0034]轉(zhuǎn)鐵蛋白購(gòu)自Sigma，產(chǎn)品目錄號(hào)為G7250。
[0035]氫化可的松購(gòu)自Sigma,產(chǎn)品目錄號(hào)為H0888-1G。
[0036]表皮生長(zhǎng)因子購(gòu)自Gibco，產(chǎn)品目錄號(hào)為PHG6045。
[0037]孕酮購(gòu)自Sigma，產(chǎn)品目錄號(hào)為P8783。
[0038]重組牛胎盤催乳素購(gòu)自Prospec，產(chǎn)品目錄號(hào)為CYT-511。
[0039]下述實(shí)施例中的所用的完全培養(yǎng)基的配制:將DMEM/DF12和FBS按照體積比為9:I混勻，加入青霉素/鏈霉素雙抗溶液至抗生素的終濃度均為IX，添加終濃度如下的各因子:胰島素(5ug/mL),轉(zhuǎn)鐵蛋白(5ug/mL),氫化可的松(5ug/mL),表皮生長(zhǎng)因子(10ng/mL),孕酮(lug/mL)，重組牛胎盤催乳素(10ng/mL)，該培養(yǎng)基用于乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)。
[0040]非免疫山羊血清購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。
[0041]Ant1-cytokeratin 18 抗體購(gòu)自 abeam,產(chǎn)品目錄號(hào)為 ab668。
[0042]突光標(biāo)記的二抗(alexaFluor? 488goat ant1-mouse IgG(H+L))購(gòu)Proteintech(PTG)，產(chǎn)品目錄號(hào)為 SA00006-1。
[0043]BSA抗體稀釋液購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為CW2340。
[0044]實(shí)施例1、適宜采樣的牛的選擇和乳汁樣品的采集和保存
[0045]一、根據(jù)生產(chǎn)記錄選擇牛乳中體細(xì)胞數(shù)低于5X 14個(gè)/ml (避免隱性乳房炎)的乳房健康的處于泌乳中后期(產(chǎn)犢后150~250d)的荷斯坦牛，一天采兩次奶，一次早上，一次下午，每次只收一次奶。于早上第一次采奶時(shí)手工擠奶，一般收集150mL左右的乳汁到無(wú)菌離心管(采集前，用大塊酒精棉球擦拭被采集的牛只乳頭，前三把奶大約50-100ml去除不收，以減少外源細(xì)菌在乳頭處對(duì)牛奶的污染))，同時(shí)更換牛只的時(shí)候，更換一次性手套，避免對(duì)牛奶形成外源性污染。
[0046]二、牛奶收集后，用酒精棉球擦拭完離心管口和蓋子后，用封口膜密封后，做好標(biāo)記，將牛奶的溫度保持在4_37°C之間，保證樣品在2h左右?guī)Щ貙?shí)驗(yàn)室，以便進(jìn)行后續(xù)處理。
[0047]實(shí)施例2、牛乳中原代乳腺上皮細(xì)胞的分離和收集
[0048]一、將實(shí)施例1得到的牛奶在常溫離心機(jī)中1000r/min離心20min，離心后牛奶分為兩層，上層為粘稠的乳脂，下層為渾濁的液體。此時(shí)細(xì)胞集中在離心管底部，盡量去除上層乳脂，保留1mL底層渾濁液體，盡量減少底部液體晃動(dòng)。
[0049]二、在底層渾濁液體中加入等量的無(wú)菌PBS，混勻后，1000r/min離心10min，去除上層液體，繼續(xù)保留1mL底部液體。重復(fù)該步驟3~5次，直至底部液體澄清。
[0050]三、將步驟二得到的底部液體轉(zhuǎn)入15mL離心管，15000r/min離心1min,吸棄上清，保留ImL上清。
[0051]四、用移液器混勻保留的上清和離心管底部沉淀，移至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞。
[0052]五、隔天換新的完全培養(yǎng)基。換液前，吸出舊培養(yǎng)基后，將培養(yǎng)瓶?jī)A斜，在瓶口處緩慢加入PBS，使PBS沿傾斜面慢慢過(guò)細(xì)胞表面，然后去除清洗液PBS，重復(fù)I~2次該操作，清除培養(yǎng)瓶中不貼壁的非細(xì)胞成分，加入新的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
[0053]實(shí)施例3、乳腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)、傳代、凍存和復(fù)蘇
[0054]一、將實(shí)施例2培養(yǎng)的細(xì)胞每隔3天換新的完全培養(yǎng)基一次，直至較大的細(xì)胞克隆形成。
[0055]從乳汁中分離的原代乳腺上皮細(xì)胞的形態(tài)如圖1所示。
[0056]圖1中，Al為培養(yǎng)到第5天，單個(gè)原代乳腺上皮細(xì)胞貼壁后的形態(tài);A2為培養(yǎng)到第5天，單個(gè)原代乳腺上皮細(xì)胞增殖后形成約為10個(gè)細(xì)胞的克隆(100X)。BI和B2為培養(yǎng)到第14天，單克隆形成的大的細(xì)胞集落(100X)。C為培養(yǎng)20天以后，部分細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)滴狀物(100X)。D為培養(yǎng)20天以后，細(xì)胞集落中出現(xiàn)的部分細(xì)胞圍成的空腔(100X)。
[0057]從牛乳汁中離心獲取的原代乳腺上皮細(xì)胞初次接種過(guò)夜后活的乳腺上皮細(xì)胞即貼壁，此時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮著大量的蛋白、脂類以及死細(xì)胞等雜質(zhì)，細(xì)胞培養(yǎng)基在顯微鏡下觀察懸浮成分較多，因此過(guò)夜后應(yīng)及時(shí)換液，清除不貼壁成分，防止雜質(zhì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)。乳汁中獲得的細(xì)胞數(shù)量較少，頭一天一般不易看出貼壁細(xì)胞，待培養(yǎng)3~5d后，單細(xì)胞貼壁鋪展后，形態(tài)清晰并開(kāi)始增殖，能夠觀察到單個(gè)細(xì)胞或少數(shù)細(xì)胞構(gòu)成的小的克隆集落，細(xì)胞成圓餅狀、短梭形或多角形(如圖1中Al和A2)。繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞開(kāi)始大量增殖，細(xì)胞集落增大(如圖1中BI和B2)并相互匯集。隨后，部分細(xì)胞中會(huì)出現(xiàn)滴狀結(jié)構(gòu)(如圖1中C箭頭所示)，密集的細(xì)胞集落中出現(xiàn)細(xì)胞圍成的空腔(如圖1中D箭頭所示)。
[0058]從乳汁中分離的細(xì)胞為上皮類型，沒(méi)有成纖維細(xì)胞的污染。
[0059]二、待較大細(xì)胞克隆形成后(初次接種培養(yǎng)的21d左右)，可進(jìn)行乳腺上皮細(xì)胞的傳代、凍存和復(fù)蘇的實(shí)驗(yàn)。
[0060](一)細(xì)胞傳代，操作如下:用0.25%胰酶/EDTA消化液在37°C下消化細(xì)胞3-5min后，加樣槍吸取消化液反復(fù)吹洗單層細(xì)胞表面，收集消化液到含有等量完全培養(yǎng)基的離心管中終止消化，重復(fù)上述操作I次，收集剩余貼壁細(xì)胞。將收集的細(xì)胞在1000r/min離心5min，保留沉淀， 將其接種到新的培養(yǎng)皿中，添加新的完全培養(yǎng)基，接種密度按24h能形成40%匯集率的細(xì)胞量計(jì)算(保持傳代時(shí)適宜的細(xì)胞密度，細(xì)胞密度過(guò)低時(shí)細(xì)胞增殖速度明顯變慢)，過(guò)夜培養(yǎng)后換液，此后每3天更換一次培養(yǎng)基。
[0061]( 二)細(xì)胞凍存，操作如下:用0.25%胰酶/EDTA消化液收集步驟(一)得到的傳代的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單層細(xì)胞，離心沉淀，加入ImL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取少量重懸液適當(dāng)稀釋后，進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)，用凍存保護(hù)液(DMEM/F12:FBS:DMS0體積比為7:2:1)稀釋細(xì)胞至合適的數(shù)量級(jí)，每ImL分裝到2mL的凍存管中，一般1cm2平皿收獲的細(xì)胞可以凍存3_5管。凍存細(xì)胞采用梯度降溫法:4°C 1min, -20°C 30min, _80°C過(guò)夜，細(xì)胞在超低溫冰箱過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮罐長(zhǎng)期凍存。
[0062](三)細(xì)胞復(fù)蘇:從液氮罐中取出凍存的傳代細(xì)胞，在37°C的水浴鍋中振搖，促使細(xì)胞迅速解凍，將細(xì)胞懸液在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)入離心管，1000r/min離心5min，保留細(xì)胞沉淀，ImL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種到T25培養(yǎng)瓶中，37°C恒溫培養(yǎng)，過(guò)夜換培養(yǎng)基。此后每3天換I次新的培養(yǎng)基。
[0063]實(shí)施例4、乳腺上皮細(xì)胞性質(zhì)鑒定
[0064]一、生長(zhǎng)特性鑒定
[0065]細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制:將傳代培養(yǎng)至第五代的細(xì)胞接種到24孔培養(yǎng)板中，每孔加入
5X 14個(gè)細(xì)胞。共設(shè)置14組，每組3個(gè)重復(fù)，接種后I~14天每天消化收集I組細(xì)胞，將每組的3孔細(xì)胞混在一起,離心沉淀后加入400 μ L PBS混勻,用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板重復(fù)計(jì)數(shù)5-6次。以培養(yǎng)時(shí)間作為橫坐標(biāo)，以每天計(jì)算的每孔細(xì)胞的平均數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制14天的牛乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，如圖2所示。
[0066]細(xì)胞生長(zhǎng)曲線常用于衡量細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖能力。傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)要經(jīng)歷潛伏期(細(xì)胞緩慢增殖)，指數(shù)生長(zhǎng)期(細(xì)胞快速增殖)，平臺(tái)期(細(xì)胞數(shù)量恒定)及衰亡期(細(xì)胞死亡)4個(gè)部分。
[0067]圖2表明，體外培養(yǎng)的牛乳腺上皮細(xì)胞在前7d內(nèi)處于平臺(tái)期，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，以適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境，從第8開(kāi)始進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，第13d后進(jìn)入增殖減緩的平臺(tái)期，結(jié)果表明，乳腺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線為典型的S型。
[0068]二、免疫熒光(IF)染色鑒定細(xì)胞角蛋白18
[0069]角蛋白是上皮細(xì)胞特有的細(xì)胞骨架蛋白，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)角蛋白18的表達(dá)，以判定細(xì)胞的上皮特性。具體操作如下:
[0070](一 )將乳腺上皮細(xì)胞按適宜數(shù)量接種，隔天吸棄培養(yǎng)液，PBS沖洗三次后用體積百分含量2%~4%甲醛的PBS溶液固定15min，得到固定好的細(xì)胞；
[0071]( 二)將固定好的細(xì)胞用PBS洗滌3次，每次5分鐘，滴加非免疫山羊血清(內(nèi)含體積百分含量為0.3% Triton X-100)，覆蓋細(xì)胞液面2~3mm，室溫放置60min，甩去多余液體；
[0072](三)滴加CK18的一抗Ant1-cytokeratin18抗體(用BSA抗體稀釋液按照體積比1:500稀釋)50μ L，4°C過(guò)夜。
[0073](四)過(guò)夜后，用PBS洗3次，每次5min,滴加突光標(biāo)記的二抗alexaFIUor*488goat ant1-mouse IgG (H+L)(用BSA抗體稀釋液按照體積比1:200稀釋)，室溫孵育60min ；
[0074](五)PBS沖洗3次，去除二抗，加入DAPI染色15min以上；
[0075](六)用含體積百分含量0.1 %的Tween-20的PBS漂洗3次，每次1min ；
[0076](七)在熒光顯微鏡下觀察。
[0077]乳腺上皮細(xì)胞的角蛋白18染色結(jié)果如圖3所示。
[0078]圖3中，A為乳腺上皮細(xì)胞的DAPI核染以定位細(xì)胞，圖中藍(lán)色圓形和橢圓形為單個(gè)細(xì)胞核(400X)。B為乳腺上皮細(xì)胞的骨架蛋白-角蛋白18免疫熒光染色結(jié)果，綠色代表細(xì)胞抗原-抗體反應(yīng)呈陽(yáng)性，分離的乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)角蛋白18(400X)。C為A與B的重疊圖，顯示所檢測(cè)細(xì)胞為角蛋白18陽(yáng)性細(xì)胞。
[0079]角蛋白18是乳腺上皮細(xì)胞特異性表達(dá)的骨架蛋白，以上結(jié)果表明，采用免疫熒光方法對(duì)角蛋白18進(jìn)行免疫熒光染色后，觀察到核周圍出現(xiàn)綠色陽(yáng)性反應(yīng)，說(shuō)明角蛋白18分布于細(xì)胞核外。藍(lán)色部分為DAPI染色的細(xì)胞核，呈橢圓形，用于細(xì)胞定位。結(jié)合細(xì)胞形態(tài)特征，證明培養(yǎng)和純化后所得的細(xì)胞為乳腺上皮細(xì)胞。
[0080]三、細(xì)胞乳成分相關(guān)基因表達(dá)特性鑒定
[0081]乳中的主要成分:乳蛋白，乳糖和乳脂，是細(xì)胞從血液中獲得前體物質(zhì)，在乳腺上皮細(xì)胞中合成后，釋放到乳腺腺泡的。
[0082]選擇乳蛋白基因CSNlSl，CSN2，LGB，持家基因GAPDH，根據(jù)GenBank的基因序列，設(shè)計(jì)上述基因的特異性引物，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增，分析體外培養(yǎng)細(xì)胞的分泌特性和目的基因的表達(dá)情況，步驟如下:
[0083]將傳至5代的乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)至其鋪滿平皿后，用TRizol裂解細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，采用 TaKaRa Taq? Vers1n 2.0 (購(gòu)自 TaKaRa，產(chǎn)品目錄號(hào)為 R004A)進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)乳成分相關(guān)基因的表達(dá)。
[0084]RT-PCR檢測(cè)的基因以及對(duì)應(yīng)的引物如表1所示。
[0085]RT-PCR反應(yīng)體系和程序分別如表2和3所示。
[0086]表1 RT-PCR擴(kuò)增特異弓丨物
[0087]

【權(quán)利要求】
1.一種從牛乳汁中分離和培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞的方法，包括如下步驟:選擇牛乳汁中體細(xì)胞數(shù)低于5X 14個(gè)/ml并且處于泌乳中后期的牛，采集牛乳汁；分離并培養(yǎng)牛乳汁中的乳腺上皮細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述分離并培養(yǎng)牛乳汁中的乳腺上皮細(xì)胞包括分離并培養(yǎng)原代牛乳腺上皮細(xì)胞，再將原代牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到傳代的牛乳腺上皮細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述原代牛乳腺上皮細(xì)胞和傳代的牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)使用的培養(yǎng)基按照如下方法制備:將DMEM/DF12培養(yǎng)基和FBS按照體積比為9:1混勻,加入終濃度為IX的青霉素，終濃度為IX的鏈霉素，終濃度為5ug/mL的胰島素，終濃度為5ug/mL的轉(zhuǎn)鐵蛋白，終濃度為5ug/mL的氫化可的松，終濃度為10ng/mL的表皮生長(zhǎng)因子，終濃度為lug/mL的孕酮，終濃度為10ng/mL的重組牛胎盤催乳素； 所述DMEM/DF12培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco，產(chǎn)品目錄號(hào)為C11330500BT ； 所述終濃度為IX的青霉素和終濃度為IX的鏈霉素的母液是濃度為100X的青霉素/鏈霉素雙抗溶液； 所述濃度為100X的青霉素/鏈霉素雙抗溶液的商品名稱為青霉素/鏈霉素雙抗溶液(100X)，購(gòu)自Gibco，產(chǎn)品目錄號(hào)為15140-122 ； 所述重組牛胎盤催乳素購(gòu)自Prospec，產(chǎn)品目錄號(hào)為CYT-511。
4.根據(jù)權(quán)利要 求1-3任一所述的方法，其特征在于:所述牛為奶牛。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于:所述奶牛為荷斯坦牛。
6.一種培養(yǎng)基，按照如下方法制備:將DMEM/DF12培養(yǎng)基和FBS按照體積比為9:1混勻，加入終濃度為IX的青霉素，終濃度為IX的鏈霉素，終濃度為5ug/mL的胰島素，終濃度為5ug/mL的轉(zhuǎn)鐵蛋白，終濃度為5ug/mL的氫化可的松，終濃度為10ng/mL的表皮生長(zhǎng)因子，終濃度為lug/mL的孕酮，終濃度為10ng/mL的重組牛胎盤催乳素； 所述DMEM/DF12培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco，產(chǎn)品目錄號(hào)為C11330500BT ； 所述終濃度為IX的青霉素和終濃度為IX的鏈霉素的母液是濃度為100X的青霉素/鏈霉素雙抗溶液； 所述濃度為100X的青霉素/鏈霉素雙抗溶液的商品名稱為青霉素/鏈霉素雙抗溶液(100X)，購(gòu)自Gibco，產(chǎn)品目錄號(hào)為15140-122 ； 所述重組牛胎盤催乳素購(gòu)自Prospec，產(chǎn)品目錄號(hào)為CYT-511。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK104178451SQ201410412690
【公開(kāi)日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年8月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月20日
【發(fā)明者】孫東曉, 謝巖, 楊少華, 崔曉鋼 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)