專利名稱：一種豬瘟病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豬瘟病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，屬于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)和獸用生物制 品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬瘟(ClassicalSwine Fever，CSF)是由豬癌病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的一種高度接觸性、致死性的豬傳染病，在世界上很多國家和地區(qū)均有發(fā) 生，給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將豬瘟列為法定通報(bào) 性疫病，我國將其劃為一類動(dòng)物傳染病。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)發(fā)展，RT-PCR、熒光定量PCR等檢測(cè)技術(shù)也逐漸廣泛應(yīng) 用于豬瘟病毒檢測(cè)。這類技術(shù)通過檢測(cè)病毒特異性的核酸片段來檢測(cè)豬瘟病毒，具有靈敏 性高、檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn)；但也易受試劑盒質(zhì)量、核酸提取、翻轉(zhuǎn)錄效率、核酸污染、RNA酶污 染等影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往因?yàn)樵噭┵|(zhì)量、人員的經(jīng)驗(yàn)和能力以及實(shí)驗(yàn)設(shè)施、環(huán)境的影響而存 在較大誤差，嚴(yán)重制約了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此亟需使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為客觀、公正的標(biāo) 尺，用于檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品的質(zhì)量控制、科學(xué)研究與實(shí)驗(yàn)室診斷的參照以及實(shí)驗(yàn)室之間的能 力比對(duì)。然而，由于豬瘟病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量要求很高，制備程序和檢驗(yàn)、標(biāo)定方法嚴(yán) 格，有關(guān)制備程序和標(biāo)定方法至今未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種豬瘟病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法。本發(fā)明包括以下技術(shù)方案(1)選擇豬瘟病毒基因保守區(qū)為擴(kuò)增靶區(qū)，與一般PCR或熒光PCR檢測(cè)的目標(biāo)片段 相適應(yīng)；(2)設(shè)計(jì)、合成針對(duì)該基因保守區(qū)的上下游引物；(3)目標(biāo)序列擴(kuò)增用RNA提取試劑盒提取病毒液(組織)總RNA ；用隨機(jī)引物反 轉(zhuǎn)錄，獲得總cDNA ；再用病毒特異的上下游引物擴(kuò)增目標(biāo)片段；通過核酸電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn) 物；(4)目的基因的克隆將擴(kuò)增產(chǎn)物用純化試劑盒純化、回收；將目的基因片段克隆 至載體；轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌；涂于篩選培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)12-16h ；挑取轉(zhuǎn)化成功的菌落， 接種于液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)12 16h ；用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，雙向測(cè)序鑒 定；(5)體外轉(zhuǎn)錄對(duì)提取的質(zhì)粒酶切；回收含啟動(dòng)子和目的基因的DNA片段；用轉(zhuǎn)錄 試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；加入DNase去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的DNA ；重新提取、純化RNA ；在無RNA酶 的水中重溶RNA ；(6)分裝將重溶的RNA分裝至無RNA酶的小管中，20 μ L/管，_80°C凍存；(7) RNA拷貝數(shù)測(cè)定取體外轉(zhuǎn)錄的RNA (6)，用無RNA酶滅菌水作10倍和100倍稀釋，測(cè)定其在260nm和280nm的吸光度值(OD)，根據(jù)吸光值及稀釋倍數(shù)計(jì)算體外轉(zhuǎn)錄樣品濃 度，必要時(shí)可測(cè)定多次統(tǒng)計(jì)分析；根據(jù)已知RNA核酸序列，推算單個(gè)RNA模板的分子量；根 據(jù)樣品濃度和單個(gè)RNA分子量計(jì)算RNA單位體積內(nèi)的拷貝數(shù)；(8)檢驗(yàn)1)均勻性試驗(yàn)從樣品隨機(jī)選取一定數(shù)量的樣品(根據(jù)統(tǒng)計(jì)需要)，檢測(cè)每個(gè)樣品 單位體積RNA拷貝數(shù)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，要求各樣品的檢測(cè)值之間經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析無顯著
差異；2)穩(wěn)定性試驗(yàn)每隔一定時(shí)間隨機(jī)抽取樣品進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)單位體積RNA拷貝數(shù) 下降情況，計(jì)算其保存期；(9)協(xié)作標(biāo)定將樣品分發(fā)國內(nèi)相關(guān)機(jī)構(gòu)，讓各單位檢測(cè)收到的樣品單位體積RNA 拷貝數(shù)；(10)定值對(duì)所有樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析，剔除異常值；確定該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 最終的單位體積RNA拷貝數(shù)。本發(fā)明的詳細(xì)描述1.選擇豬瘟病毒基因保守區(qū)5’端非編碼區(qū)(5’ UTR)為擴(kuò)增靶區(qū)。2.設(shè)計(jì)、合成引物Al :5，-AGT ACA GGG TAG TCG TCA GTG GTT CG-3，；A2 5' -CTG CTG TAC ATG GCA CAT GGA GTT G-3'；由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，用DEPC水配成0. 25 μ Μ, -20°C保存?zhèn)溆谩?.目標(biāo)序列擴(kuò)增用TRIzol Reagent試劑盒(購自Invitrogen公司)提取病毒液(組織)總RNA ； 取 10μ1 RNA，加入 2μ1 Oligo(dT)和 8μ 1 反轉(zhuǎn)錄液(5XBuffer 4μ1，2μ1 DTT，1 μ 1 dNTP，0. 5μ 1 反轉(zhuǎn)錄酶，0. 5 μ 1 RNasin)，按 42°C 60min、70°C /15min 反轉(zhuǎn)錄，獲得總 cDNA ；取10μ1 cDNA，加入 29μ1 H20,95°C 預(yù)變性 5min，加入 11 μ 1 PCR 液(10 X Buffer 5μ 1, Al 1 μ 1, Α2 1 μ 1，dNTP 2μ 1，Taq 酶 2μ 1)，按 94 °C/lmin，57 "C /lmin, 72°C /lmin40S進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后再72°C延伸IOmin ；取5 10 μ 1擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn) 目標(biāo)條帶則表明擴(kuò)增成功(如圖1)。4.目的基因的克隆將擴(kuò)增產(chǎn)物用純化試劑盒純化、回收；將目的基因片段克隆至pGEM-T Easy載體 (購自Promega公司)；轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109 (購自Promega公司)；涂于含有X-Gal和IPTG的AMP+LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)12 16h ；隨機(jī)挑取3 4 個(gè)白色單菌落，接種于AMP+LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)12 16h ；用 Wizard Plus Minipreps DNA Purification System 試劑盒(購自 Promega 公 司)提取重組質(zhì)粒，送至北京華大中生科技發(fā)展有限公司雙向測(cè)序鑒定，結(jié)果與設(shè)計(jì)的目 的基因片段序列一致。5.體外轉(zhuǎn)錄對(duì)提取的質(zhì)粒用Pvu II酶切；用DNA片段回收試劑盒回收含T7啟動(dòng)子和目的基
4因的DNA片段；用 Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System_T7 試劑盒(購自 Promega 公司)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系如下T7 Transcription 5 X Buffer 20 μ 1, dNTP 30 μ 1, Linear DNA template 5 μ 1, Enzyme Mix (Τ7) 10 μ 1，補(bǔ)充 DEPC 水至 100 μ 1，37°C/5h ；加入DNase 37°C /15min去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的DNA ；用TRIzol Reagent試劑盒(購自Invitrogen公司)重新提取、純化RNA ；在DEPC 水中重溶RNA。6.分裝將重溶的RNA分裝至DEPC水處理過的小管中，20 μ L/管，_80°C凍存。7. RNA拷貝數(shù)測(cè)定制備的RNA樣品經(jīng)10倍和100倍稀釋，吸光光度值測(cè)定結(jié)果是10倍稀釋，0D260 =0. 44406，濃度為 35. 5248 μ g/ml ； 100 倍稀釋，0D260 = 0. 03481，濃度為 3. 4827 μ g/ml ； 根據(jù)核酸序列推算出單鏈模板的分子量MW = 669. 40kDa ；經(jīng)計(jì)算，得出每管RNA分子的拷 貝數(shù)為3. 11 X IO12拷貝/20 μ L·8.豬瘟病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢驗(yàn)和定值(1)均勻性試驗(yàn)從樣品隨機(jī)選取10支樣品，檢測(cè)每個(gè)樣品單位體積RNA拷貝數(shù)， 結(jié)果見表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，各樣品之間無顯著差異，表明該批樣品均勻性良好。(2)穩(wěn)定性試驗(yàn)每隔1周隨機(jī)抽取樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果11周后檢測(cè)結(jié)果與第1個(gè) 月檢測(cè)結(jié)果無顯著差異，說明該樣品穩(wěn)定性良好，經(jīng)推測(cè)，其穩(wěn)定保存期在5年以上。(3)協(xié)作標(biāo)定將樣品分發(fā)國內(nèi)相關(guān)機(jī)構(gòu)，讓各單位檢測(cè)收到的樣品單位體積RNA 拷貝數(shù)；結(jié)果見表2。(4)定值對(duì)所有樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析，剔除異常值；確定該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 最終單位體積RNA拷貝數(shù)為3. 11 士0. 027 X IO12拷貝/20 μ 1。本發(fā)明的積極意義本發(fā)明涉及一種豬瘟病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法。應(yīng)用本發(fā)明制備的豬瘟病毒 核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有以下優(yōu)點(diǎn)和用途(1)以豬瘟病毒基因序列的高度保守區(qū)為擴(kuò)增靶區(qū)，與一般PCR或熒光PCR檢測(cè)的 目標(biāo)片段相適應(yīng)，特異性好，適用范圍廣，并且不會(huì)泄露我國豬瘟病毒特有的基因信息；(2)利用本發(fā)明制備的豬瘟病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)無感染性，沒有生物安全風(fēng)險(xiǎn)，可以 廣范應(yīng)用，適用范圍廣、安全性高；(3)利用本發(fā)明制備的豬瘟病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是RNA片段而不是DNA片段或質(zhì)粒， 與豬瘟病毒原有核酸種類保持了一致，可以充分控制受試者的實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)過程；(4)利用本發(fā)明制備的豬瘟病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)測(cè)定和計(jì)算得出的拷貝數(shù)定值準(zhǔn) 確，而且經(jīng)過協(xié)作標(biāo)定定值，更增加了其可信度；(5)利用本發(fā)明制備的豬瘟病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以根據(jù)已知的拷貝數(shù)稀釋成單位 體積含有不同拷貝數(shù)的一系列樣品，用于RT-PCR或熒光定量PCR診斷試劑的質(zhì)量控制、科 學(xué)研究與實(shí)驗(yàn)室診斷的對(duì)照以及實(shí)驗(yàn)室之間的能力比對(duì)。


圖ICSFV 5’ UTR擴(kuò)增結(jié)果 圖中所示M_DL2000marker 病毒培養(yǎng)液擴(kuò)增產(chǎn)物；2_未接種病毒培養(yǎng)液擴(kuò)增產(chǎn)物 實(shí)施例實(shí)施例11.選擇豬瘟病毒基因保守區(qū)5’端非編碼區(qū)(5’ UTR)為擴(kuò)增靶區(qū)。2.設(shè)計(jì)、合成引物:A1 5'-AGT ACA GGG TAG TCG TCA GTG GTT CG_3，;A2 5'-CTG CTG TAC ATG GCA CAT GGA GTT G_3，；由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，用DEPC水配成 0. 25 μ M，_20°C保存?zhèn)溆谩?.目標(biāo)序列擴(kuò)增用TRIzol Reagent試劑盒(購自Invitrogen公司)提取病 毒液(組織)總RNA ；取10 μ 1 RNA,加入2 μ 1 Oligo (dT)和8 μ 1反轉(zhuǎn)錄液(5XBuffer 4μ1，2μ1 DTT, 1 μ 1 dNTP，0. 5 μ 1 反轉(zhuǎn)錄酶，0. 5 μ 1 RNasin)，按 42°C 60min、70°C/15min 反轉(zhuǎn)錄，獲得總cDNA ；取10 μ IcDNA,加入29 μ 1 H20,95°C預(yù)變性5min,加入11 μ 1 PCR液 (10 X Buffer 5μ1，Α1 1 μ 1,Α2 1 μ l,dNTP 2 μ 1，Taq酶 2 μ 1)，按 94°C/lmin, 57°C/lmin， 72°C /lmin40S進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后再72°C延伸IOmin ；取5 10 μ 1擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行0. 8% 瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)目標(biāo)條帶則表明擴(kuò)增成功(如圖1)。4.目的基因的克隆將擴(kuò)增產(chǎn)物用純化試劑盒純化、回收；將目的基因片段克隆 至pGEM-T Easy載體(購自Promega公司)；轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109 (購自Promega公 司)；涂于含有X-Gal和IPTG的AMP+LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)12 16h ；隨機(jī)挑取3_4個(gè)白 色單菌落，接種于AMP+LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)12 16h ；用Wizard Plus Minipreps DNAPurification System試劑盒(購自Promega公司)提取重組質(zhì)粒，送至北京華大中生 科技發(fā)展有限公司雙向測(cè)序鑒定，結(jié)果與設(shè)計(jì)的目的基因片段序列一致。5.體外轉(zhuǎn)錄對(duì)提取的質(zhì)粒用Pvu II酶切；用DNA片段回收試劑盒回收含T7啟 動(dòng)子和目的基因的 DNA 片段；用 Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System_T7 試 劑盒(購自Promega公司)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系如下T7 Transcription 5 X Buffer 20 μ 1, dNTP 30 μ 1, Linear DNA template 5 μ 1, Enzyme Mix (Τ7) 10 μ 1，_卜胃 DEPC m 100 μ 1，37°C /5h ；加入 DNase37°C /15min 去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的 DNA ；用 TRIzol Reagent 試劑 盒(購自Invitrogen公司)重新提取、純化RNA ；在DEPC水中重溶RNA。6.分裝將重溶的RNA分裝至DEPC水處理過的小管中，20 μ L/管，_80°C凍存。實(shí)施例2RNA拷貝數(shù)測(cè)定制備的RNA樣品經(jīng)10倍和100倍稀釋，吸光光度值測(cè)定結(jié)果是10倍稀釋，0D260 =0. 44406，濃度為 35. 5248 μ g/ml ；100 倍稀釋，0D260 = 0. 03481，濃度為 3. 4827 μ g/ml ； 根據(jù)核酸序列推算出單鏈模板的分子量MW = 669. 40kDa ；經(jīng)計(jì)算，得出每管RNA分子的拷 貝數(shù)為3. 11 X IO12拷貝/20 μ L·實(shí)施例3豬瘟病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢驗(yàn)和定值1.均勻性試驗(yàn)從樣品隨機(jī)選取10支樣品，檢測(cè)每個(gè)樣品單位體積RNA拷貝數(shù)， 結(jié)果見表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，各樣品之間無顯著差異，表明該批樣品均勻性良好。表IRNA樣品拷貝數(shù)(X IO12拷貝/20 μ 1)
6

3.13 3.11 3.09 3.07 3.12 3.07 3.08 3.14 3.12 3. 09 3.10±0.0252.穩(wěn)定性試驗(yàn)每隔1周隨機(jī)抽取樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果11周后檢測(cè)結(jié)果與第1個(gè) 月檢測(cè)結(jié)果無顯著差異，說明該樣品穩(wěn)定性良好，經(jīng)推測(cè)，其穩(wěn)定保存期在5年以上。3.協(xié)作標(biāo)定將樣品分發(fā)國內(nèi)相關(guān)機(jī)構(gòu)，讓各單位檢測(cè)收到的樣品單位體積RNA 拷貝數(shù)；結(jié)果見表2。表2各協(xié)作單位測(cè)定的RNA樣品拷貝數(shù)(X1012拷貝/20 μ 1) 4.定值對(duì)所有樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析，剔除異常值；確定該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)最 終單位體積RNA拷貝數(shù)為3. 11 ±0. 027X IO12拷貝/20 μ 1。
權(quán)利要求
一種豬瘟病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，其特征在于包括以下技術(shù)步驟(1)選擇豬瘟病毒基因保守區(qū)為擴(kuò)增靶區(qū)；(2)設(shè)計(jì)、合成針對(duì)該基因保守區(qū)的上下游引物；(3)目標(biāo)序列擴(kuò)增提取病毒液或組織的總RNA；用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA；再用上下游引物擴(kuò)增目標(biāo)片段；電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物；(4)目的基因的克隆將擴(kuò)增產(chǎn)物純化、回收；將目的基因片段克隆至載體；轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；挑取轉(zhuǎn)化成功的菌落，大量培養(yǎng)；提取重組質(zhì)粒，雙向測(cè)序鑒定；(5)體外轉(zhuǎn)錄對(duì)提取的質(zhì)粒酶切；回收含啟動(dòng)子和目的基因的DNA片段；用轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；加入DNase去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的DNA；重新提取、純化RNA；在無RNA酶的水中重溶RNA；(6)分裝將重溶的RNA分裝至無RNA酶的小管中，20μL/管， 80℃凍存；(7)RNA拷貝數(shù)測(cè)定取體外轉(zhuǎn)錄的RNA，用無RNA酶滅菌水作10倍和100倍稀釋，測(cè)定其在260nm和280nm的OD值，計(jì)算體外轉(zhuǎn)錄樣品濃度；根據(jù)已知RNA核酸序列，推算單個(gè)RNA模板的分子量，計(jì)算RNA單位體積內(nèi)的拷貝數(shù)；(8)檢驗(yàn)1)均勻性試驗(yàn)從樣品隨機(jī)選取一定數(shù)量的樣品，檢測(cè)每個(gè)樣品單位體積RNA拷貝數(shù)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，要求各檢測(cè)值之間無顯著差異；2)穩(wěn)定性試驗(yàn)每隔一定時(shí)間隨機(jī)抽取樣品進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)單位體積RNA拷貝數(shù)下降情況，計(jì)算其保存期；(9)協(xié)作標(biāo)定將樣品分發(fā)國內(nèi)相關(guān)機(jī)構(gòu)，檢測(cè)單位體積RNA拷貝數(shù)；(10)定值對(duì)所有測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析，剔除異常值；確定該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)最終的單位體積RNA拷貝數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬瘟病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法。本發(fā)明所涉及的豬瘟病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是通過以下技術(shù)步驟制備的(1)選擇基因保守區(qū)為擴(kuò)增靶區(qū)；(2)引物設(shè)計(jì)、合成；(3)序列擴(kuò)增；(4)克隆、鑒定；(5)體外轉(zhuǎn)錄；(6)分裝；(7)RNA拷貝數(shù)測(cè)定；(8)檢驗(yàn)；(9)協(xié)作標(biāo)定；(10)定值。利用本發(fā)明制備的豬瘟病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)無感染性、適用范圍廣、均勻性好、穩(wěn)定性高、拷貝數(shù)定值準(zhǔn)確，可用于RT-PCR或熒光定量PCR診斷試劑的質(zhì)量控制、科學(xué)研究與實(shí)驗(yàn)室診斷的對(duì)照以及實(shí)驗(yàn)室之間的能力比對(duì)。
文檔編號(hào)C12R1/93GK101906487SQ20101024513
公開日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2010年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月5日
發(fā)明者關(guān)孚時(shí), 戴志紅, 李翠, 王在時(shí), 蔣卉 申請(qǐng)人:中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所