一種膠原基軟骨支架的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)用生物材料技術(shù)，尤其涉及一種膠原基軟骨支架。
【背景技術(shù)】
[0002]關(guān)節(jié)軟骨損傷是臨床常見疾病，由運動創(chuàng)傷、交通事故及各種關(guān)節(jié)炎疾病等引起。軟骨一旦損傷很難修復(fù)。目前臨床上用于治療軟骨缺損的常用方法有微骨折術(shù)、自體非負(fù)重區(qū)軟骨移植或異體軟骨移植、自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)，但是各有其缺陷，比如微骨折術(shù)形成的多為纖維軟骨組織，長期修復(fù)效果不理想；自體非負(fù)重區(qū)軟骨移植造成二次損傷，異體軟骨移植具有免疫排斥和傳播疾病風(fēng)險；自體軟骨細(xì)胞移植需二次手術(shù)，而且費用昂貴。
[0003]組織工程技術(shù)的運用和醫(yī)用生物材料的發(fā)展為關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)帶來新的希望。其中以生物支架材料為細(xì)胞載體的基質(zhì)誘導(dǎo)自體軟骨細(xì)胞移植(MACI)技術(shù)為代表，進(jìn)一步解決了臨床治療中存在的問題。此類技術(shù)均以生物支架材料為基礎(chǔ)，再復(fù)合組織工程其他要素(種子細(xì)胞、生長因子)構(gòu)成組織工程與再生治療技術(shù)用于臨床治療。
[0004]當(dāng)今應(yīng)用的多是高分子材料或是膠原海綿等支架傳遞軟骨細(xì)胞修復(fù)軟骨缺損，但醫(yī)用高分子材料生物相容性差且其降解產(chǎn)物對組織有破壞性，而單層膠原海綿力學(xué)性能差，而且修復(fù)的軟骨缺損可能會導(dǎo)致軟骨骨化，目前多層結(jié)構(gòu)的制備方法存在結(jié)構(gòu)形態(tài)不穩(wěn)定的缺陷，容易造成其植入體內(nèi)后層與層之間分離。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明提供一種膠原基軟骨支架，具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)形態(tài)，力學(xué)性能優(yōu)異，植入體內(nèi)后層與層之間不易分離，且生物相容性良好。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種膠原基軟骨支架，其特征在于，其制備方法包括以下步驟:
[0007](a)將平鋪的膠原溶液冷凍成型后經(jīng)高滲緩沖溶液浸泡脫水，擠壓成膜；
[0008](b)在該膜表面再平鋪一層膠原溶液，冷凍干燥；
[0009](c)用交聯(lián)劑整體交聯(lián)，水洗并冷凍干燥，即得所述膠原基軟骨支架。
[0010]優(yōu)選地，所述膠原溶液的濃度為5?40mg/ml。
[0011]優(yōu)選地，所述步驟(a)和所述步驟(b)中膠原溶液的平鋪厚度為2?8mm。
[0012]膠原pH偏酸性，為了調(diào)節(jié)膠原中殘留的酸性物質(zhì)而獲得結(jié)構(gòu)更優(yōu)的膠原基軟骨支架，一般可選用弱堿性的緩沖溶液，再加入中性鹽以提高離子強度，形成高滲緩沖溶液；優(yōu)選地，所述高滲緩沖溶液為含質(zhì)量濃度為50?340g/L的氯化鈉或氯化鉀，pH為7?8的緩沖溶液；進(jìn)一步地，所述緩沖溶液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液、枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液、Tris-鹽酸緩沖溶液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖溶液、磷酸氫二鈉-磷酸緩沖液或硼酸-硼砂緩沖液。需要說明的是，在上述緩沖范圍內(nèi)存在多種類型且可行的緩沖試劑，本發(fā)明在此不再窮舉。
[0013]根據(jù)膠原中水分的含量，需要調(diào)節(jié)浸泡脫水時間，優(yōu)選地，浸泡脫水時間為12?24小時。
[0014]為了快速排出膠原中的水分和鹽分，又有利于得到均勻的膠原膜，優(yōu)選地，所述步驟(a)中擠壓成膜步驟使用梯度壓力；進(jìn)一步地，所述梯度壓力為:50?lOOKg壓力維持30?60秒、100?150Kg壓力維持30?60秒、150?200Kg壓力維持30?60秒、200?500Kg壓力維持30?60秒。
[0015]優(yōu)選地，所述交聯(lián)劑為戊二醛、京尼平、1-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺-N-羥基琥珀酰亞胺或1，4- 丁二醇二縮水甘油醚。
[0016]相比于現(xiàn)有技術(shù)的致密層采用常規(guī)的冷凍干燥再壓緊方式，本發(fā)明利用蛋白在高濃度鹽溶液中物理變性和鹽析的原理，使膠原在高滲溶液作用下從溶液中析出，然后在壓力的作用下排出其中的水分，可以制備出致密的膠原膜，再通過一體化構(gòu)建技術(shù)，在致密層上形成一疏松多孔層，該技術(shù)下，兩層之間能實現(xiàn)自然過渡、無縫連接，使其雙層結(jié)構(gòu)更加完整，兩層之間連接更加緊密，不僅增加了支架的力學(xué)性能，更能有效地防止支架在植入到體內(nèi)后兩層產(chǎn)生分離。
【附圖說明】
[0017]圖1為膠原基軟骨支架示意圖，其中101為致密層，102為多孔疏松層；
[0018]圖2為實施例1的切開面掃描電鏡圖；
[0019]圖3為膠原基軟骨支架植入到經(jīng)關(guān)節(jié)軟骨缺損造模的新西蘭大白兔的膝關(guān)節(jié)軟骨缺損處6周、12周后的組織學(xué)HE、S0染色照片，a、c為6周時間點染色照片，b、d為12周時間點染色照片，a、b為組織學(xué)HE染色照片，c、d為組織學(xué)S0染色照片，放大倍數(shù)均為40倍(標(biāo)尺為20 μ m) ο
【具體實施方式】
[0020]以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明的構(gòu)思、具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。
[0021]實施例1
[0022](1)將濃度為20mg/ml的膠原溶液平鋪至尺寸為100mmX 100mmX 5mm的聚四氟乙烯凹槽模具中，放-20°C下16小時冷凍成型。
[0023](2)將冷凍后的膠原浸入含NaCl濃度為232g/L的磷酸鹽緩沖溶液(磷酸氫二鈉(Na2HP04) 2.436g/L 和磷酸二氫鉀(ΚΗ2Ρ04) 0.8g/L，pH 調(diào)至 7.4)中 24 小時。
[0024](3)將脫水后的膠原整體用梯度壓力(70?80Kg 30秒、100?llOKg 30秒、140?150Kg 30秒、200?210Kg 60秒)擠壓成膜，再在致密膜上平鋪濃度為5mg/ml的膠原溶液至5_厚度。
[0025](4)將雙層膠原整體在_30°C冷凍16小時，再在冷凍干燥機中抽干48小時。
[0026](5)將凍干后的雙層膠原用EDC-NHS (EDC和NHS濃度分別為20mg/ml和5mg/ml)交聯(lián)3小時。
[0027](6)將交聯(lián)后的雙層支架水洗3天，每天換水4次，再次在_30°C冷凍16小時，再在冷凍干燥機中抽干60小時。
[0028](7)將凍干后的支架剪切成所需的尺寸，密封包裝，經(jīng)20KGy的輻照劑量(γ射線)滅菌，即獲得所述的膠原基軟骨支架。
[0029]實施例2
[0030](1)將濃度為5mg/ml的膠原溶液平鋪至尺寸為lOOmmX 100mmX 3mm的聚四氟乙稀凹槽模具中，放-80°C下12小時冷凍成型。
[0031 ] (2)將冷凍后的膠原浸入含NaCl濃度50g/L的枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液(含枸櫞酸1.92g/L和磷酸氫二鈉25.8g/L，pH調(diào)至8.0)中12小時。
[0032](3)將脫水后的膠原整體用梯度壓力(50?70Kg 30秒、100?llOKg 30秒、150?170Kg 30秒、200?250Kg 30秒)擠壓成膜，再在致密膜上平鋪濃度為5mg/ml的膠原溶液至3_厚度。
[0033](4)將雙層膠原整體在_20°C冷凍8小時，再在冷凍干燥機中抽干12小時。
[0034](5)將凍干后的雙層膠原用濃度為0.05% (w/v)的戊二醛交聯(lián)8小時。
[0035](6)將交聯(lián)后的雙層支架水洗2天，每天換水3次，再次在_20°C冷凍12小時，再在冷凍干燥機中抽干24小時。
[0036](7)將凍干后的支架剪切成所需的尺寸，密封包裝，經(jīng)lOKGy的輻照劑量(γ射線)滅菌，即獲得所述的膠原基軟骨