負(fù)載生長(zhǎng)因子殼聚糖微球的dbm支架修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨材料的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明是一種負(fù)載生長(zhǎng)因子殼聚糖微球的DBM支架修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨材料。按以下方法制備而得：1）DBM的制備:采用豬新鮮肩胛骨，剔除骨膜、軟骨及軟組織，取其松質(zhì)骨，制備成圓餅形狀，反復(fù)流水?dāng)嚢铔_洗清除骨髓、血污及表面油脂，自來(lái)水沖洗后，置-80℃保存3d后進(jìn)行適當(dāng)處理,2）制備殼聚糖緩釋微球，3）包裹生長(zhǎng)因子微球制備、包封率與載藥量計(jì)算；4）制備DBM載生長(zhǎng)因子-殼聚糖緩釋微球復(fù)合體；通過(guò)紅外線法測(cè)定DBM支架和微球用EDC交聯(lián)后酰胺鍵連接。本發(fā)明具有良好的細(xì)胞和生物相容性、可降解性，是一種很好的軟骨組織工程支架材料。
【專利說(shuō)明】負(fù)載生長(zhǎng)因子殼聚糖微球的DBM支架修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨材料
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】 本發(fā)明涉及組織工程【技術(shù)領(lǐng)域】，是一種用于關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)的負(fù)載生長(zhǎng)因子殼聚糖 微球的DBM支架修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨材料。

【背景技術(shù)】
[0002] 臨床因創(chuàng)傷或其它原因引起的關(guān)節(jié)軟骨損傷十分常見(jiàn)，軟骨自身很難再生修復(fù)。 當(dāng)關(guān)節(jié)軟骨損傷時(shí)，由于關(guān)節(jié)軟骨缺乏直接的血液供應(yīng)、淋巴循環(huán)以及神經(jīng)支配，成熟的軟 骨細(xì)胞在損傷后不能再生，其自身修復(fù)的能力十分有限，并且關(guān)節(jié)軟骨缺損后修復(fù)過(guò)程極 為緩慢，再生組織與正常組織在結(jié)構(gòu)和功能等方面均存在著明顯的差異，關(guān)節(jié)軟骨退變常 難以避免，迄今為止尚無(wú)一種完全有效的治療方法。如何修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損一直是骨科領(lǐng) 域研究的重要問(wèn)題之一。傳統(tǒng)用于修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的方法如關(guān)節(jié)研磨成形術(shù)、軟骨下鉆 孔或微骨折術(shù)等通過(guò)將血液和骨髓中的各種祖細(xì)胞遷移至關(guān)節(jié)軟骨缺損區(qū)，產(chǎn)生纖維軟骨 修復(fù)。雖然纖維軟骨在結(jié)構(gòu)和功能上與透明軟骨均有很大差別，但這種治療方法可有效地 緩解患者疼痛，改善關(guān)節(jié)功能，仍是目前臨床治療局限性軟骨缺損的一線治療方法。骨膜、 軟骨膜、骨軟骨移植是臨床上治療軟骨缺損的另一種選擇，雖然它可以產(chǎn)生一定程度的透 明軟骨，改善患者關(guān)節(jié)功能，但仍然缺乏長(zhǎng)期療效的臨床證據(jù)，而且由于供體有限，常常限 制了其臨床應(yīng)用。自體軟骨細(xì)胞移植（autologous chondrocyte transplantation, ACT) 可以產(chǎn)生一定程度的透明軟骨，是近年來(lái)應(yīng)用于臨床的一種治療方法，歐美已有大量的患 者接受此種治療，短期臨床研究報(bào)告顯示其有較好的療效，但仍然存在細(xì)胞分布不均、易漏 出、軟骨退變、層離、纖維化導(dǎo)致移植失敗等問(wèn)題。為了解決這些問(wèn)題，很多學(xué)者進(jìn)行了以細(xì) 胞和三維支架材料為基礎(chǔ)的組織工程方法修復(fù)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究，并取得良好的結(jié)果。
[0003] 在以組織工程方法修復(fù)軟骨缺損的過(guò)程中，修復(fù)組織和正常組織的整合尤為重 要，其與多種因素相關(guān)，包括種子細(xì)胞、支架材料以及細(xì)胞因子，而支架材料的選擇是影響 修復(fù)質(zhì)量的一個(gè)重要因素，用于組織工程軟骨的支架材料主要分為人工合成材料(如PLA、 PGA、PLGA等）和生物衍生支架材料(如透明質(zhì)酸、膠原、藻酸、殼聚糖及脫細(xì)胞基質(zhì)等)。生 物衍生支架材料不僅具有良好的生物相容性及良好的生物降解性，而且含有可以促進(jìn)種子 細(xì)胞粘附、增殖及分化的生物活性分子，具有人工合成支架材料無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。
[0004] 脫|丐骨基質(zhì)（Demineralized bone matrix, DBM)是生物衍生支架材料中的一種， 其主要是利用同種或異種器官/組織，經(jīng)過(guò)脫細(xì)胞、去除抗原處理得到脫細(xì)胞基質(zhì)材料。該 材料具有細(xì)胞外基質(zhì)成分，含有I型膠原，膠原是細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)的良好支架，DBM又具 有三維天然孔隙結(jié)構(gòu)系統(tǒng)，故有良好的組織親和性和相容性，有利于細(xì)胞的黏附、增殖和分 化，具有人工合成支架材料無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。Kasten等對(duì)人工合成的輕基磷灰石（CDHA)、 磷酸三鈣及脫鈣骨基質(zhì)（DBM)從種子細(xì)胞的粘附率、長(zhǎng)入支架內(nèi)部的數(shù)量、增殖和分化效 率等方面作過(guò)比較，結(jié)果證明DBM為三者中最優(yōu)。van Osch等研究發(fā)現(xiàn)脫鈣骨基質(zhì)（DBM)復(fù) 合軟骨膜在兔動(dòng)物模型上具有可靠的成軟骨能力。Zhou等發(fā)現(xiàn)脫鈣骨基質(zhì)粉（DBP)可以誘 導(dǎo)體外三維培養(yǎng)的人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs)向軟骨細(xì)胞分化。Gao等將DBM和骨髓基質(zhì) 干細(xì)胞（BMSCs)復(fù)合培養(yǎng)后修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)負(fù)重區(qū)軟骨缺損，結(jié)果軟骨缺損深度的95%得到 修復(fù)。但現(xiàn)有技術(shù)中由于DBM的脫鈣強(qiáng)度和時(shí)間各異，導(dǎo)致修復(fù)骨與軟骨的作用不一致。
[0005] 本申請(qǐng)的發(fā)明人研究后發(fā)現(xiàn)，適量脫鈣后的骨基質(zhì)有利于軟骨形成、而過(guò)量的脫 鈣骨基質(zhì)其成軟骨能力降低，其原因可能是適量的脫鈣可使骨基質(zhì)中含有的骨形態(tài)發(fā)生蛋 白（BMP)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β)等生物活性因子成分暴露，而過(guò)量的脫鈣則影響了脫 鈣骨基質(zhì)的活性，從而使脫鈣骨基質(zhì)修復(fù)軟骨的能力受到影響。此外單純基質(zhì)支架植入體 內(nèi)如能捕獲自身的信號(hào)分子和干細(xì)胞，在體內(nèi)原位誘導(dǎo)并促其細(xì)胞分化成軟骨，且并長(zhǎng)期 維持其形成的軟骨細(xì)胞的活性。這種利用體內(nèi)自身細(xì)胞歸巢、原位增殖和分化修復(fù)軟骨缺 損的方法似乎更切實(shí)際。此外，國(guó)內(nèi)外目前主要采用牛骨、兔骨、羊骨等作原材料，而這些異 種骨材料結(jié)構(gòu)與人相差甚遠(yuǎn)，而同種異體人骨材料來(lái)源有限，且易傳播肝炎、愛(ài)滋病等。如 何克服上述不足，讓脫鈣骨基質(zhì)這種新型支架材料更好地為患者服務(wù)，就成為現(xiàn)有技術(shù)中 亟待解決的問(wèn)題。
[0006] 因此，我們?cè)诖罅垦芯康幕A(chǔ)上，找到DBM支架及細(xì)胞因子復(fù)合的軟骨修復(fù)材料， 采用體內(nèi)原位誘導(dǎo)軟骨再生以修復(fù)軟骨缺損。脫鈣骨基質(zhì)（DBM)具有良好細(xì)胞組織相容 性，又有天然孔隙結(jié)構(gòu)，并且具有可塑性和一定的機(jī)械強(qiáng)度。當(dāng)前的研究表明ΒΜΡ-2生 長(zhǎng)因子是骨軟骨修復(fù)的基本物質(zhì)，其能選擇地參與低度成熟軟骨細(xì)胞的成熟過(guò)程的調(diào)節(jié)功 能，TGF-β 3生長(zhǎng)因子能促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向軟骨方向增殖、分化。但是研究表明細(xì)胞因 子局部使用很快被稀釋和代謝，故需反復(fù)大劑量使用，而且其價(jià)格非常昂貴，故建立完善的 緩釋系統(tǒng)，可使生長(zhǎng)因子更有效地作用于靶細(xì)胞，可增強(qiáng)軟骨工程化組織。殼聚糖為一種聚 合多糖，且表面帶有正電荷，易吸引負(fù)電荷的蛋白等，被廣泛應(yīng)用與藥物緩釋載體，因此，制 備并應(yīng)用殼聚糖緩釋系統(tǒng)控制生長(zhǎng)因子在組織中的持續(xù)緩慢釋放在組織工程修復(fù)軟骨損 傷的研究具有重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，為了克服生長(zhǎng)因子生物利用效率防止生 長(zhǎng)因子緩釋過(guò)快并安全載遞生長(zhǎng)因子并持續(xù)發(fā)揮其在軟骨修復(fù)過(guò)程對(duì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，該 材料不僅能較好地解決了生長(zhǎng)因子局部使用很快被稀釋和代謝的缺點(diǎn)，可在較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)持 續(xù)緩慢釋放生長(zhǎng)因子，而且能更容易與宿主的軟骨組織粘附和整合，也能容易塑造出與關(guān) 節(jié)匹配的輪廓，從而更好的修復(fù)軟骨缺損。
[0008] 本發(fā)明的負(fù)載生長(zhǎng)因子殼聚糖微球的DBM支架修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨材料的制備方法如 下： 1 )DBM的制備：采用豬新鮮肩胛骨，剔除骨膜、軟骨及軟組織，取其松質(zhì)骨，制備成圓餅 形狀，反復(fù)流水?dāng)嚢铔_洗清除骨髓、血污及表面油脂，自來(lái)水沖洗后，置_80°C保存3d，然后 依次進(jìn)行以下步驟： (1) 無(wú)水乙醇脫水2h，風(fēng)干； (2) 氯仿/甲醇（1:1，體積分?jǐn)?shù)）脫脂4h，風(fēng)干； (3) 0. 6mol/L鹽酸分別脫|丐6h (鹽酸/松質(zhì)骨：20ml/g)，風(fēng)干； (4) 無(wú)水乙醇脫水2h，風(fēng)干； (5) 氯仿/甲醇（1:1，體積分?jǐn)?shù)）脫脂4h，風(fēng)干； (6) 10%PBS，ρΗ=7· 4, 37°C浸泡3d，中間換液2次，風(fēng)干； (7) 75%醫(yī)用酒精消毒，4°C保存?zhèn)溆茫?(8) 肉眼及掃描電鏡下觀察。
[0009] 2 )殼聚糖緩釋微球的制備：120mg殼聚糖（分子量100K，脫乙酰度95%)，加入 4ml 2% v/v醋酸，全部溶解后，滴加到120ml正辛醇(含4% v/v司盤80)，1500rpm/min攪拌 30min，加入 10ml 10% w/v TPP 溶液，再 1500rpm/min 攬拌 30min 后，4000rpm 離心收集微球 (分3層，由上而下是正辛醇，水和微球)，在抽濾裝置中，用異丙醇和水各洗3次，冷凍干燥， 肉眼觀察及掃描電鏡； 3 )包裹生長(zhǎng)因子微球制備、包封率與載藥量計(jì)算： (1) lmg殼聚糖微球與20ng/ml生長(zhǎng)因子15 μ L，ph=7. 4時(shí)在4°C充分侵潤(rùn)、膨脹24h。
[0010] (2)收集離心上清液，上清液以PBS定容100ml，取10 μ L另加90 μ LPBS液作為待 測(cè)樣品，微球冷凍干燥備用。
[0011] (3)按生長(zhǎng)因子ELISA試劑盒說(shuō)明書，酶標(biāo)儀于495nm測(cè)定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì) 算載藥量與包封率。
[0012] 4) DBM載生長(zhǎng)因子-殼聚糖緩釋微球復(fù)合體的制備： (1) 先將DBM稱重后裝入EP管，再裝入包裹生長(zhǎng)因子聚糖微球； (2) 將裝滿微球及DBM的EP管置超聲波清洗器內(nèi)，震蕩2小時(shí)； (3) 超聲完畢，去掉DBM表面的微球，然后稱重，計(jì)算DBM所載微球的量，并且調(diào)整每個(gè) DBM含微球量相等； (4) 稱取2gEDC (Carbodiimide，碳化二亞胺)，溶于100ml雙蒸水中，配置成0· 02%濃 度的EDC溶液，取一塊六孔板，取一孔放入適量的配置好的EDC溶液，把制備好的DBM/微球 支架浸潤(rùn)在里面； (5) 放置在4°C冰箱內(nèi)反應(yīng)24h，取出后，用PBS液洗滌3次，自然風(fēng)干； (6) 將上述DBM/微球支架大體觀察并電鏡掃描，觀察形貌； (7) 通過(guò)紅外線法測(cè)定DBM支架和微球用EDC交聯(lián)后酰胺鍵連接。
[0013] 碳化二亞胺（EDC)作為連接劑，將殼聚糖微球表面的羧基與DBM中膠原蛋白的氨 基結(jié)合，形成穩(wěn)定牢固的共價(jià)鍵結(jié)合，通過(guò)紅外線可以看到單純DBM組可以吸收特征頻率 為3427. 15cm，單純微球組可以吸收特征頻率為3429. 73cm，EDC交聯(lián)組可以吸收特征頻率 為3439. 08cm，通過(guò)紅外線可見(jiàn)可吸收特征頻率EDC組和單純DBM、殼聚糖微球之間有明顯 區(qū)別、指紋區(qū)之間也有明顯區(qū)別，說(shuō)明通過(guò)EDC可以把微球和DBM通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合起來(lái)。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明具有以下有益效果 1、本發(fā)明的脫鈣松質(zhì)骨基質(zhì)（DBM)具有制備方法相對(duì)簡(jiǎn)便，并可大量獲取的特點(diǎn)，低溫 下能長(zhǎng)期保存，經(jīng)濟(jì)廉價(jià)；可按修復(fù)缺損的形狀制成不同的形狀和大小，應(yīng)用方便；DBM既 保留了豬松質(zhì)骨的天然網(wǎng)狀空隙結(jié)構(gòu)系統(tǒng)，又具有良好的細(xì)胞和生物相容性、可降解性，是 一種很好的軟骨組織工程支架材料。
[0015] 2、選用適宜移植的豬松質(zhì)骨為原材料，而國(guó)外多采用牛骨為原材料。由于豬的解 剖生理與人類相近，豬與人MHC-DR基因在同源性高的區(qū)域有約60%的相同性，是器官移 植供體動(dòng)物中較能接受的對(duì)象，研究發(fā)現(xiàn)，新鮮豬骨和正常人骨的無(wú)機(jī)成份含量比較接近， 因此采用豬骨為原材料進(jìn)行理化加工處理，更易制備出類似人體骨組織天然結(jié)構(gòu)和性能的 材料。
[0016] 3、豬松質(zhì)骨在經(jīng)過(guò)脫脂、脫鈣、脫蛋白等一系列理化處理后，其主要成分是膠原纖 維，外觀為多孔的海綿樣結(jié)構(gòu)，孔隙相互交通，可提供寬大的內(nèi)表面積和空間，有利于種子 細(xì)胞的黏附、增殖和分化、生長(zhǎng)的空間，有細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，氣體和養(yǎng)分的交換，同時(shí)具有 良好的生物相容性。
[0017] 4、該產(chǎn)品具有極低的免疫原性，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DBM移植后免疫排斥反應(yīng)低，DBM 具有良好的細(xì)胞及組織相容性的同時(shí)，還具有消毒后保持其軟骨誘導(dǎo)能力的特性，其保存 了具有誘導(dǎo)成軟骨能力的骨形態(tài)形成蛋白（BMP)是骨組織中的一種蛋白分子，主要誘導(dǎo)血 管周圍游離的和未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞和纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為不可逆的骨系細(xì)胞，也可在骨骼 以外部位產(chǎn)生軟骨和骨組織，最終成骨，是一種典型的軟骨成骨過(guò)程。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1是本發(fā)明的DBM支架材料大體觀；肉眼觀DBM支架材料外觀均呈白色海綿狀， 吸水時(shí)用鑷子夾持彈性好可擠出水分并能復(fù)原，具有一定的韌性，干燥時(shí)維持原有形態(tài)并 有一定的強(qiáng)度，表面見(jiàn)有疏松的多孔結(jié)構(gòu)，表面空隙與深層空隙相連通，空隙大小不等。
[0019] 圖2是本發(fā)明的DBM掃描電鏡形貌特征；SEM觀察DBM布滿大小不等的孔隙呈天 然的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，各孔隙相互交通。
[0020] 圖3是本發(fā)明的殼聚糖微球制作離心收集微球(分3層，由上而下是正辛醇，水和 微球)。圖4是本發(fā)明的殼聚糖微球大體觀；殼聚糖微球肉眼觀察呈黃色粉末。
[0021] 圖5是本發(fā)明的殼聚糖微球掃描電鏡形貌特征；SEM觀察殼聚糖微球觀察球形良 好，球體表面光滑，粒徑分布較集中。
[0022] 圖6是本發(fā)明的超聲波下殼聚糖微球灌注于DBM支架材料內(nèi)。
[0023] 圖7是本發(fā)明的超聲波下殼聚糖微球灌注與DBM支架材料內(nèi)大體觀；經(jīng)過(guò)超聲波 灌注肉眼觀可見(jiàn)DBM支架間隙內(nèi)充滿黃色微球。
[0024] 圖8是本發(fā)明的超聲波下殼聚糖微球灌注與DBM支架材料內(nèi)掃描電鏡形貌特征； 掃描電鏡觀察DBM微球復(fù)合支架，可見(jiàn)微球均勻分布于DBM間隙內(nèi)。
[0025] 圖9是本發(fā)明的殼聚糖微球灌注與DBM支架材料內(nèi)的紅外線譜的單純DBM紅外線 譜。
[0026] 圖10單純殼聚糖微球紅外線譜。
[0027] 圖11 DBM和殼聚糖微球通過(guò)EDC交聯(lián)譜。
[0028] 碳二亞胺（EDC)作為連接劑，將殼聚糖微球表面的羧基與DBM中膠原蛋白的氨基 結(jié)合，形成穩(wěn)定牢固的共價(jià)鍵結(jié)合，通過(guò)紅外線普可以看到單純DBM組可以吸收特征頻率 為3427. 15cm，單純微球組可以吸收特征頻率為3429. 73cm，EDC交聯(lián)組可以吸收特征頻率 為3439. 08cm，通過(guò)紅外線譜可見(jiàn)可吸收特征頻率EDC組和單純DBM、殼聚糖微球之間有明 顯區(qū)另I」、指紋區(qū)之間也有明顯區(qū)別，說(shuō)明通過(guò)EDC可以把微球和DBM通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合起來(lái)。
[0029] 圖12是本發(fā)明的DBM以Adobe Photoshop CS4軟件直方圖功能計(jì)算孔隙率。
[0030] 圖13是本發(fā)明的DBM以Image J軟件測(cè)量孔徑大小。
[0031] 圖14、15、16是本發(fā)明的了6?-3 3、81^-2殼聚糖微球體外誘導(dǎo)81^〇8分別2(1、14(1、 21d倒置相差顯微鏡下觀察。
[0032] 圖17是本發(fā)明的TGF-β 3、BMP-2殼聚糖微球體外誘導(dǎo)BMSCs II型膠原免疫組化 染色。
[0033] 圖18是本發(fā)明的TGF- β 3、BMP-2殼聚糖微球體外誘導(dǎo)BMSCs II型膠原 Western-blot 檢測(cè)。
[0034] 圖19是本發(fā)明的TGF- β 3、BMP-2殼聚糖微球體外誘導(dǎo)BMSCs生長(zhǎng)曲線繪制。
[0035] 圖20是本發(fā)明本發(fā)明的TGF- β 3、BMP-2殼聚糖微球體外誘導(dǎo)BMSCs聯(lián)合培養(yǎng)8 天時(shí)的掃描電鏡特征。
[0036] 圖21是本發(fā)明的雙因子殼聚糖微球/DBM材料植入膝關(guān)節(jié)軟骨缺損動(dòng)物模型情 況。
[0037] 圖22是本發(fā)明的雙因子殼聚糖微球/DBM材料植入膝關(guān)節(jié)軟骨缺損2周時(shí)的大體 觀察。
[0038] 圖23是本發(fā)明的雙因子殼聚糖微球/DBM材料植入膝關(guān)節(jié)軟骨缺損4周時(shí)的大體 觀察。
[0039] 圖24是本發(fā)明的雙因子殼聚糖微球/DBM材料植入膝關(guān)節(jié)軟骨缺損8周時(shí)的大體 觀察。
[0040] 圖25是本發(fā)明的雙因子殼聚糖微球/DBM材料植入膝關(guān)節(jié)軟骨缺損12周時(shí)的大 體觀察。
[0041] 圖26是本發(fā)明的雙因子殼聚糖微球/DBM材料植入膝關(guān)節(jié)軟骨缺損12周時(shí)HE染 色的組織學(xué)表現(xiàn)。
[0042] 圖27是本發(fā)明的雙因子殼聚糖微球/DBM材料植入膝關(guān)節(jié)軟骨缺損12周時(shí)番紅 0染色的組織學(xué)表現(xiàn)。

【具體實(shí)施方式】
[0043] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但它們并不是對(duì)本發(fā)明的 限定。
[0044] 實(shí)驗(yàn)例1 : 1、 DBM的制備 (1) 采用豬新鮮肩胛骨，剔除骨膜、軟骨及軟組織，取其松質(zhì)骨，制備成直徑為7. 0mm 厚為3. 0mm的圓餅形狀，反復(fù)流水?dāng)嚢铔_洗清除骨髓、血污及表面油脂，自來(lái)水沖洗后， 置-80°C保存3d，在依次行； (2) 無(wú)水乙醇脫水2h，風(fēng)干； (3 )氯仿/甲醇（1:1，體積分?jǐn)?shù)）脫脂4h，風(fēng)干； (4) 0. 6mol/L鹽酸分別脫|丐6h (鹽酸/松質(zhì)骨：20ml/g)，風(fēng)干； (5) 無(wú)水乙醇脫水2h，風(fēng)干； (6) 氯仿/甲醇（1:1，體積分?jǐn)?shù)）脫脂4h，風(fēng)干； (7) 10%PBS (pH=7. 4) 37°C浸泡3d，中間換液2次，風(fēng)干； (8) 75%醫(yī)用酒精消毒，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0045] ( 9 )肉眼及掃描電鏡下觀察（圖1、2) 2、 殼聚糖緩釋微球的制備： 120mg殼聚糖(分子量100K，脫乙酰度95%)，加入4ml 2% v/v醋酸，全部溶解后，滴加到 120ml 正辛醇(含 4% v/v 司盤 80)，1500rpm/min 攬拌 30min，加入 10ml 10% w/v TPP 溶液，再 1500rpm/min攪拌30min后，4000rpm離心收集微球(分3層，由上而下是正辛醇，水和微球） (圖3)，在抽濾裝置中，用異丙醇和水各洗3次，冷凍干燥，肉眼觀察及掃描電鏡（圖4、5)。
[0046] 3、包裹生長(zhǎng)因子微球制備、包封率與載藥量計(jì)算： ① lmg殼聚糖微球與20ng/ml生長(zhǎng)因子15 μ L，ph=7. 4時(shí)在4°C充分侵潤(rùn)、膨脹24h。
[0047] ②收集離心上清液，上清液以PBS定容100ml，取10 μ L另加90 μ LPBS液作為待 測(cè)樣品，微球冷凍干燥備用。
[0048] ③按生長(zhǎng)因子ELISA試劑盒說(shuō)明書，酶標(biāo)儀于495nm測(cè)定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算 載藥量與包封率。
[0049] 4、DBM載生長(zhǎng)因子-殼聚糖緩釋微球復(fù)合體的制備： (1)先將DBM稱重后裝入EP管，再裝如包裹生長(zhǎng)因子聚糖微球。
[0050] (2)將裝滿微球及DBM的EP管置超聲波清洗器內(nèi)，震蕩2小時(shí)（圖6)。
[0051] (3)超聲完畢，去掉DBM表面的微球，然后稱重，計(jì)算DBM所載微球的量，并且調(diào)整 每個(gè)DBM含微球量相等。
[0052] (4)稱取2gEDC(Carbodiimide，碳化二亞胺），溶于100ml雙蒸水中，配置成0· 02% 溶液，取一塊六孔板，取一孔放入適量的配置好的EDC溶液，把制備好的DBM/微球支架浸潤(rùn) 在里面。
[0053] (5)放置在4°C冰箱內(nèi)反應(yīng)24h，取出后，用PBS液洗滌3次，自然風(fēng)干。
[0054] (6)將上述DBM/微球支架大體觀察（圖7)并電鏡掃描，觀察形貌（圖8)。
[0055] (7)通過(guò)紅外線法測(cè)定DBM支架和微球用EDC交聯(lián)后酰胺鍵連接（圖9、10、11)。
[0056] DBM的肉眼及SEM觀察： 肉眼觀DBM支架材料外觀均呈白色海綿狀，吸水時(shí)用鑷子夾持彈性好，可擠出水分并 能復(fù)原，具有一定的韌性，干燥時(shí)維持原有形態(tài)并有一定的強(qiáng)度，表面見(jiàn)有疏松的多孔結(jié) 構(gòu)，表面孔隙與深層孔隙相連通，孔隙大小不等（圖1)。取制得的DBM 10塊，向黏附于載物 臺(tái)上，真空噴金后，上機(jī)觀察。用掃描電鏡觀察DSBM的表面結(jié)構(gòu)。SEM觀察DBM布滿大小不 等的孔隙呈天然的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，各孔隙相互交通（圖2)。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取10幅照片，計(jì)算平均 孔徑大小和孔隙率。孔徑大小通過(guò)Image J軟件的Measure功能計(jì)算（圖13);孔隙率通過(guò) Adobe Photoshop CS4軟件的直方圖（histogram)功能計(jì)算，以象素（pixel)代表孔隙面積 (圖12)，孔隙率=(整個(gè)照片的像素-骨小梁所占的像素）+整個(gè)照片的像素。測(cè)得的DBM 的平均孔徑大小為74. 25 ± 5. 23 μ m及孔隙率71. 05 ±4. 25% (見(jiàn)表1)。
[0057] 表1 DBM掃描電鏡圖像測(cè)量平均孔隙率及平均孔徑大?。╪=10)

【權(quán)利要求】
1. 一種負(fù)載生長(zhǎng)因子殼聚糖微球的DBM支架修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨材料，其特征在于按以下方 法制備而得： 1 )DBM的制備：采用豬新鮮肩胛骨，剔除骨膜、軟骨及軟組織，取其松質(zhì)骨，制備成圓餅 形狀，反復(fù)流水?dāng)嚢铔_洗清除骨髓、血污及表面油脂，自來(lái)水沖洗后，置_80°C保存3d，然后 依次進(jìn)行以下步驟： (1) 無(wú)水乙醇脫水2h，風(fēng)干； (2) 氯仿/甲醇1:1，體積分?jǐn)?shù)，脫脂4h，風(fēng)干； (3) 0. 6mol/L鹽酸分別脫|丐6h，鹽酸/松質(zhì)骨：20ml/g，風(fēng)干； (4) 無(wú)水乙醇脫水2h，風(fēng)干； (5) 氯仿/甲醇1:1，體積分?jǐn)?shù)，脫脂4h，風(fēng)干； (6) 10%PBS，ρΗ=7· 4, 37°C浸泡3d，中間換液2次，風(fēng)干； (7) 75%醫(yī)用酒精消毒，4°C保存?zhèn)溆茫? (8) 肉眼及掃描電鏡下觀察； 2 )殼聚糖緩釋微球的制備：分子量100K、脫乙酰度95%的殼聚糖120mg，加入4ml 2% v/ v醋酸，全部溶解后，滴加到120ml含4% v/v司盤80的正辛醇，1500rpm/min攪拌30min，加 入10ml 10% w/v TPP溶液，再1500rpm/min攬拌30min后，4000rpm離心收集微球，分3層， 由上而下是正辛醇，水和微球，在抽濾裝置中，用異丙醇和水各洗3次，冷凍干燥，肉眼觀察 及掃描電鏡； 3 )包裹生長(zhǎng)因子微球制備、包封率與載藥量計(jì)算： (1) lmg殼聚糖微球與20ng/ml生長(zhǎng)因子15 μ L，ph=7. 4時(shí)在4°C充分侵潤(rùn)、膨脹24h ; (2) 收集離心上清液，上清液以PBS定容100ml，取10 μ L另加90 μ LPBS液作為待測(cè)樣 品，微球冷凍干燥備用； (3) 按生長(zhǎng)因子ELISA試劑盒說(shuō)明書，酶標(biāo)儀于495nm測(cè)定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算載 藥量與包封率； 4. DBM載生長(zhǎng)因子-殼聚糖緩釋微球復(fù)合體的制備： (1) 先將DBM稱重后裝入EP管，再裝入包裹生長(zhǎng)因子聚糖微球； (2) 將裝滿微球及DBM的EP管置超聲波清洗器內(nèi)，震蕩2小時(shí)； (3) 超聲完畢，去掉DBM表面的微球，然后稱重，計(jì)算DBM所載微球的量，并且調(diào)整每個(gè) DBM含微球量相等； (4) 稱取2gEDC (Carbodiimide，碳化二亞胺)，溶于100ml雙蒸水中，配置成0· 02%濃 度的EDC溶液，取一塊六孔板，取一孔放入適量的配置好的EDC溶液，把制備好的DBM/微球 支架浸潤(rùn)在里面； (5) 放置在4°C冰箱內(nèi)反應(yīng)24h，取出后，用PBS液洗滌3次，自然風(fēng)干； (6) 將上述DBM/微球支架大體觀察并電鏡掃描，觀察形貌； (7) 通過(guò)紅外線法測(cè)定DBM支架和微球用EDC交聯(lián)后酰胺鍵連接。
【文檔編號(hào)】A61L27/54GK104056304SQ201410311370
【公開日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月2日
【發(fā)明者】李彥林, 韓睿, 王慧建, 王國(guó)梁, 何川, 王鑫 申請(qǐng)人:昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院