專利名稱：一種注射用軟骨組織工程支架材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種注射用軟骨組織工程支架材料。
背景技術(shù)：
軟骨等組織的復(fù)合性和多發(fā)性創(chuàng)傷是平戰(zhàn)時(shí)常見(jiàn)的疾患，其創(chuàng)傷的穩(wěn)定 和便捷修復(fù)對(duì)于提高患者的生存質(zhì)量至關(guān)重要。組織工程技術(shù)是解決軟骨等 組織缺損的理想途徑，但其種子細(xì)胞支架的選材問(wèn)題仍未很好地解決?，F(xiàn)常
用細(xì)胞支架材料如人工合成的可降解聚合物聚羥基乙酸(PGA)和生物陶瓷等， 存在親水性差、細(xì)胞吸附力弱、降解慢、免疫反應(yīng)較大及價(jià)格昂貴等問(wèn)題。 如何解決好這些難題成為組織工程技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵。
羥丙基甲基纖維素(HPMC)為一種對(duì)溫度變化敏感的材料，其特點(diǎn)是在 轉(zhuǎn)入人或動(dòng)物體作用部位之前(如25'C室溫)或在貯藏溫度(4'C)，為粘度 很低的流體狀態(tài)，當(dāng)注射入人或動(dòng)物體在局部體溫(〉33°C)作用下，粘度迅 速上升，可形成凝固態(tài)的凝膠。HPMC最大的優(yōu)點(diǎn)是其水溶性，不需有機(jī)溶劑， 操作安全、方便，其商品化產(chǎn)品已在臨床上作為滴眼劑的增稠劑及藥物的緩 釋劑等廣泛應(yīng)用，足以說(shuō)明其安全性和無(wú)細(xì)胞毒性。.實(shí)踐證明，HPMC與機(jī)體 .相容性很好，不誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)，在組織修復(fù)后于體內(nèi)逐漸降解吸收，并 通過(guò)腎臟排泄，降解時(shí)間約為6周左右，其降解速度適當(dāng)，與組織生長(zhǎng)速度 相匹配。因此，不失為一種理想的組織工程生物支架材料。由于其可注射性 及溫度敏感性，為創(chuàng)傷修復(fù)治療和重建手術(shù)的應(yīng)用提供了一種新的思路，根 據(jù)申請(qǐng)人進(jìn)行的資料檢索，還沒(méi)有將HPMC作為可塑型而微創(chuàng)的可注射性生物 治療材料的相關(guān)報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種注射用軟骨組織工程支架材料，本發(fā)明選 擇不同濃度的羥丙甲纖維素，在不同溫度條件下，對(duì)其物理特性變化進(jìn)行觀
察，遴選出其可作為細(xì)胞支架材料的理想濃度，然后將濃度為5X107ml軟骨 種子細(xì)胞與所選理想濃度的HPMC凝膠混合后制成注射劑。 為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案
一種注射用軟骨組織工程支架材料，其特征在于，該注射用軟骨組織工 程支架材料中含有10% 15%的羥丙基甲基纖維素和濃度為5X107ml軟骨種 子細(xì)胞。
上述軟骨種子細(xì)胞為兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。
根據(jù)申請(qǐng)人所作的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的注射用軟骨組織工程支架材料具 有以下優(yōu)點(diǎn)
① 具有熱敏水溶性和可注射性，不需有機(jī)溶劑，操作安全、方便、快捷；
② 安全性和無(wú)細(xì)胞毒性；
③ 與機(jī)體相容性很好，不誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)； 其降解速度適當(dāng)，與組織生長(zhǎng)速度相匹配；
石蠟切片組織學(xué)染色顯示，軟骨種子細(xì)胞與熱敏性水凝膠HPMC的復(fù) 合物注射入裸鼠背部皮下組織后，可于體內(nèi)形成組織工程軟骨，所形成軟骨 具有軟骨組織特征。因此，HPMC不失為一種新型的、理想的可注射性軟骨組 織工程生物支架材料。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合申請(qǐng)人的具體實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。 1.觀察不同粘度系數(shù)及濃度的羥丙甲纖維素(HPMC)在不同溫度下形成 熱敏性凝膠情況
分別將0. 02g、 0. 04g、 0. 06g、 0. 08g、 0. 10g、 0. 12g、 0. 14g、 0. 16g、0. 18g、 0. 20g、 0. 22g、 0. 24g、 0. 26g、 0. 28g、 0. 30g、 0. 32g、 0. 34g、 0. 36g、 0.38g、 0. 40g的HPMC粉末與2ml DMEM培養(yǎng)液混合，配制成1%、 2%、 3%、 4%、 5%、 6%、 7Q/。、 8%、 9%、 10%、 11%、 12%、 13%、 14%、 15%、 16%、 17%、 18%、 19% 和20%等不同濃度的凝膠，觀察其在4-C、 25°C (室溫)及37。C溫度下粘度變 化情況，并對(duì)其形成熱敏性凝膠的能力進(jìn)行比較，最終選出10。/。 159&的HPMC 為形成的熱敏性凝膠理想濃度，將HPMC干粉用C輻照滅菌備用。
2. 制備軟骨種子細(xì)胞
軟骨種子細(xì)胞為兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(雌雄不限)，去除表面軟組織，切取關(guān) 節(jié)面軟骨片，磷酸鹽緩沖液(PBS，含青霉素及鏈霉素各100U/mL)沖洗2遍， 切成lmmXlmmXlmm大小的軟骨碎片，移入離心管，加約2倍體積O. 3%的II型 膠原酶，37"C孵箱內(nèi)階段消化10h (每隔lh收集一次細(xì)胞，然后放入含10%血 清的DMEM培養(yǎng)液中保護(hù))，IOO目不銹鋼細(xì)胞篩過(guò)濾，800r/min離心8min， DMEM 洗滌2次。按每毫升1乂105個(gè)細(xì)胞的密度接種于培養(yǎng)瓶中，加入含20%小牛血清 DMEM培養(yǎng)液(含青霉素100U/mL，鏈霉素100U/mL，維生素C 50mg/L) ， 37°C、 中孵育，隔日換液一次，在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，收集第3代的 軟骨細(xì)胞用MEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)染色檢査活 力，軟骨細(xì)胞活力大于85%即可。
3. 軟骨種子細(xì)胞和羥丙甲纖維素?zé)崦粜运z復(fù)合物將其注射入動(dòng)物體 內(nèi)形成工程化軟骨 .
先將已制備的濃度為5X107ml軟骨種子細(xì)胞與已滅菌的10% 15%的羥 丙甲纖維素(HPMC)混合，制成混合物，置于37'C、 02孵箱中培養(yǎng)24h， 然后將制備的軟骨種子細(xì)胞與不同濃度的熱敏性水凝膠(HPMC)的復(fù)合物注 射入裸鼠背部皮下組織處(每個(gè)注射點(diǎn)約注射0.3ml)，定期取材以組織學(xué)方 法觀察局部形成工程軟骨情況。具體實(shí)驗(yàn)分組如下①單純軟骨種子細(xì)胞組；②軟骨種子細(xì)胞+HPMC凝 膠載體組；③單純凝膠組；④不使用任何處理的對(duì)照組。
結(jié)果表明，僅軟骨種子細(xì)胞加HPMC凝膠載體組可于裸鼠皮下形成組織工 程軟骨，經(jīng)組織學(xué)觀察證實(shí)，所形成軟骨具有軟骨組織特征。
權(quán)利要求
1.一種注射用軟骨組織工程支架材料，其特征在于，該注射用軟骨組織工程支架材料中含有10％～15％的羥丙基甲基纖維素和濃度為5×106/ml軟骨種子細(xì)胞。
2. 如權(quán)利要求1所述的注射用軟骨組織工程支架材料，其特征在于，所 述的軟骨種子細(xì)胞為兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種注射用軟骨組織工程支架材料，該注射用軟骨組織工程支架材料中含有10％～15％的羥丙基甲基纖維素和濃度為5×10⁶/ml軟骨種子細(xì)胞。本發(fā)明通過(guò)對(duì)不同濃度的HPMC，在不同溫度條件下，其物理特性變化的觀察，遴選出10％～15％為其形成凝膠的最佳濃度；應(yīng)用中將軟骨種子細(xì)胞與HPMC的復(fù)合物注射入裸鼠背部皮下組織后，可于體內(nèi)形成組織工程軟骨，經(jīng)組織學(xué)證實(shí)所形成軟骨具有軟骨組織特征。
文檔編號(hào)A61L27/20GK101314056SQ20081015013
公開(kāi)日2008年12月3日 申請(qǐng)日期2008年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月25日
發(fā)明者青 李, 李亞非, 趙大慶, 鈺 馬 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)