本發(fā)明涉及一種脫細胞組織膜的制備方法,它是一種以哺乳動物組織膜為原料加工成醫(yī)用材料的方法，該材料可用于組織工程支架、組織膜修補材料和醫(yī)用敷料等的制備。
背景技術(shù)：
：脫細胞組織膜材料作為醫(yī)療器械在醫(yī)療領(lǐng)域廣泛應用，例如生物補片、創(chuàng)面敷料、創(chuàng)口修復材料、組織修復支架等。用于制備脫細胞組織的原材料來源廣泛，比如人體皮膚、動物皮膚、腹腔膜、體腔膜、肌腱、小腸粘膜、羊膜、血管、心包膜等。脫細胞組織膜制備大致方法是將新鮮的組織通過物理、化學或者生物的方法脫除組織的細胞成分（如dna、蛋白質(zhì)、多糖），降低材料的免疫原性，保留下組織的胞外基質(zhì)，主要由膠原、氨基聚糖、蛋白聚糖、彈性蛋白等組成，對細胞組織起支持、保護、提供營養(yǎng)、細胞分化、細胞運動遷移、細胞識別、細胞黏著和通信聯(lián)絡等作用，甚至有報道稱其中可以保留一定含量的生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子、血小板源性生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子和成纖維細胞生長因子，使其在組織的修復和重建過程中發(fā)揮重要作用。脫細胞組織制備方法有很多種。中國專利cn103191466b公開的脫細胞組織操作方法簡單，但其中組織保存步驟所需時間長達1～12個月，導致整個加工藝耗時太長。cn103432627b采用堿泡、核糖核酸酶消化、α-半乳糖苷酶、病毒滅活、滅菌等步驟，能很好地去除細胞成分和α-gal抗原，但其中的核糖核酸酶和α-半乳糖苷酶等酶制劑價格昂貴，處理起來成本高。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種脫細胞組織膜的制備方法，采用常規(guī)的一些試劑材料，經(jīng)簡單的加工步驟得到脫細胞組織。本加工工藝具有抗原去除徹底，加工周期短的特點，所用試劑價格便宜易獲得，組織結(jié)構(gòu)破壞小，具有有利于組織細胞生長的孔隙，有助于提升細胞貼附生長，在臨床上有利于組織再生。本發(fā)明提供的脫細胞組織膜的制備方法具體包括以下步驟：1)組織修剪：去除組織膜上脂肪組織，沖洗干凈血漬。2)堿液浸泡：將修剪后的組織放入堿液浸泡裂解細胞，然后取出用酸中和后清洗干凈。3)表面活性劑溶液浸泡：將中和清洗后的組織放入表面活性劑溶液中，以充分浸出雜蛋白。4)蛋白復性溶液浸泡：將組織膜放入蛋白復性溶液中浸泡進一步去除雜蛋白，然后清洗干凈。5)有機溶劑浸泡：將組織膜放入有機溶劑中浸泡去除脂質(zhì)，然后通過水或親水性有機溶劑與水組合清洗掉有機溶劑。6)組織孔隙制備：將組織膜放入堿溶液中浸泡以產(chǎn)生空隙，然后進行中和。7)交聯(lián)：利用交聯(lián)劑與抗原位點的氨基、羥基、羥基等發(fā)生反應，進一步降低脫細胞組織的抗原性，或提升脫細胞組織的降解周期，或提升脫細胞組織的拉伸強度。8)滅菌：將上述步驟的得到的組織膜片，以（通常的方法）濕性狀態(tài)進行輻射滅菌；或者以凍干的形式（通常的方法）進行輻射滅菌或eo滅菌。本方法沒有使用一些價格昂貴的酶去除細胞和α-gal抗原，大大降低成本，也可達到很好的去除效果。步驟1)中所采用的組織包括來人類、哺乳動物（豬、牛、羊等）的真皮組織、血管、消化腔道、臟器膜、體腔膜等。步驟2)中所用堿包括但不限于氫氧化鈉，氫氧化鉀，氫氧化鈣等，所用的濃度為0.001m～5m，優(yōu)選0.01m～1m，浸泡時間5min～5h，優(yōu)選10min～2h。步驟2)中所用的酸包括但不限于磷酸、醋酸、檸檬酸、鹽酸、硫酸、硫酸氫鹽、草酸、苯甲酸、苯乙酸，甲酸等。步驟3)中所用表面活性劑溶液成分包括表面活性劑、緩沖鹽、無機鹽、巰基化合物等中一種或多種成分。其中表面活性劑包括但不限于十二烷基硫酸鈉、十二烷基磺酸鈉、吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60、吐溫-80、tritonx-100等中的一種或多種，濃度為0.1%～5%，優(yōu)選為0.5%～4%。緩沖鹽包括tris-hcl、氨鹽、磷酸鹽、醋酸鹽等中的一種或多種，濃度為1mm～1m，優(yōu)先5mm～500mm。無機鹽包括但不限于氯化物、硫酸鹽、硝酸鹽等一種或多種，濃度為1mm～100mm，優(yōu)選2mm～50mm。巰基化合物包括但不限于β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇等，濃度為0.5mm～20mm，優(yōu)選1mm～5mm。表面活性劑溶液的ph值在5～9之間，優(yōu)選為6～8。浸泡時間為0.5d～7d，優(yōu)選1d～5d。浸泡溫度為10℃～40℃，優(yōu)選為18℃～30℃。步驟4）中蛋白復性溶液成分包括但不限于尿素、鹽酸胍中至少一種。所用尿素濃度為4m～10m，優(yōu)選濃度為6m～8m；浸泡時長為1h～5h，優(yōu)選2h～4h；浸泡溫度為4℃～40℃，優(yōu)選為20℃～30℃。所用鹽酸胍濃度為1m～5m，優(yōu)選濃度為2m～4m；浸泡時長為1h～5h，優(yōu)選2h～4h；浸泡溫度為4℃～40℃，優(yōu)選為20℃～30℃。步驟5）中所用的有機溶劑包括但不限于親水性和親油性有機溶劑中一種或多種。親水性有機溶劑包括但不限于甲醇，乙醇，乙二醇，丙酮，正丙醇，異丙醇，丙二醇，丙三醇，丁醇等，親油性有機溶劑包括但不限于乙酸乙酯，甲苯，石油醚，丁酸乙酯、醋酸戊酯、丁酸戊脂、乳酸乙酯等。步驟6）中所用的堿為氫氧化鈉，氫氧化鉀，氫氧化鈣等，所用堿的濃度為0.01m～5m，優(yōu)選為0.5m～2m，浸泡時間為5min～10h，優(yōu)選為10min～5h。不同堿濃度和浸泡時間調(diào)節(jié)孔隙大小，孔隙大小范圍為10μm～400μm，優(yōu)選為50μm～200μm。步驟7）中所用交聯(lián)劑包括但不限于環(huán)氧類化合物，醛類，二酰二胺，二異氰酸酯，碳化二亞胺，酸酐等。所用濃度為0.1%～10%，優(yōu)選為1%～5%。交聯(lián)時長2h～48h，優(yōu)選12h～30h。步驟2），3），6）和8）可以單獨或組合作為病毒滅活步驟。上述的方法得到的脫細胞組織膜；其拉伸強度大于0.1mpa。該脫細胞組織膜的孔隙大小范圍為10μm～400μm，優(yōu)選為50μm～200μm。本發(fā)明提供了一種脫細胞組織膜的制備方法，采用常規(guī)的一些試劑材料，經(jīng)簡單的加工步驟得到脫細胞組織。該方法可以將人源或動物源組織膜中細胞、脂質(zhì)、雜蛋白等抗原物質(zhì)去除干凈，同時又保留細胞外基質(zhì)并產(chǎn)生合適的孔隙。本加工工藝具有抗原去除徹底，加工周期短的特點，所用試劑價格便宜易獲得，組織結(jié)構(gòu)破壞小，具有有利于組織細胞生長的孔隙，有助于提升細胞貼附生長，在臨床上有利于組織再生。該方法制備的脫細胞組織膜可以作為組織工程支架、組織膜破損的修補材料以及創(chuàng)面敷料。附圖說明圖1表面結(jié)構(gòu)的電鏡掃描圖。圖2h&e染色和免疫組化檢測結(jié)果。圖3組織孔隙對細胞粘附生長的影響。具體實施方式以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，這并不限制本發(fā)明的保護范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件以及手冊中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件；所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可由商業(yè)途徑獲得。實施例1一種脫細胞組織膜的制備方法：(1)取出6個月齡牛的腹腔膜，進行清洗；(2)組織修剪：以腹腔膜為原材料，用剪刀剪除脂肪組織等殘留組織碎片，用純化水沖洗干凈血漬。(3)堿液浸泡：取上述清洗后的膜組織稱取10g，加入100ml濃度為0.1mol/l的氫氧化鈉溶液中浸泡20min；取上述步驟浸泡后的膜組織加入質(zhì)量濃度為4%的醋酸溶液中浸泡10min，然后將膜取放入純化水清洗3次，每次5min。(4)表面活性劑溶液浸泡：表面活性劑溶液的配方為1%十二烷基硫酸鈉、50mm醋酸鈉、20mm氯化鉀、10mm氯化鎂、10mm氯化鈉、5mm的β-巰基乙醇，用醋酸調(diào)節(jié)ph值至7.0；將上一步的膜放入100ml表面活性劑溶液中，浸泡2d，浸泡溫度為26℃；然后更換浸泡液，再浸泡2d，浸泡溫度為26℃。將膜取放入純化水清洗3次，每次5min。(5)鹽酸胍溶液浸泡：配制2m的鹽酸胍水溶液100ml，將上一步驟的膜放入鹽酸胍溶液中，于25℃條件下浸泡2h。取出膜，放入純化水清洗3次，每次5min。(6)脫脂處理:將上述步驟膜放入50%乙醇中浸泡1h；放入60%乙醇中浸泡1h；放入70%乙醇中浸泡1h；放入80%乙醇中浸泡1h；放入90%乙醇中浸泡1h；放入100%乙醇中浸泡1h；然后放入石油醚中浸泡2h；再更換100%乙醇浸泡1h；更換90%乙醇浸泡1h；更換80%乙醇浸泡1h；更換70%乙醇浸泡1h；將膜取放入純化水清洗3次，每次5min。(7)交聯(lián)：取上一步浸泡后的膜組織加入體積濃度為1％丁二醇縮水甘油醚的0.1m碳酸鈉溶液中浸泡24h，溫度控制為25℃。將膜取放入純化水清洗3次，每次5min。(8)滅菌：將膜放入復合塑料袋中，加入30ml生理鹽水進行封裝，用15kgy的劑量進行鈷-60輻射滅菌。實施例2(1)取膜：取出6個月齡牛的腹腔膜，進行清洗；(2)組織修剪：以腹腔膜為原材料，用剪刀剪除脂肪組織等殘留組織碎片，用純化水沖洗干凈血漬。(3)堿液浸泡：取上述清洗后的膜組織稱取10g，加入100ml濃度為1mol/l的氫氧化鈉溶液中浸泡1h；取上述步驟浸泡后的膜組織加入質(zhì)量濃度為4%的醋酸溶液中浸泡10min，然后將膜取放入純化水清洗3次，每次5min。(4)表面活性劑溶液浸泡：表面活性劑溶液的配方為1%十二烷基硫酸鈉、50mm醋酸鈉、20mm氯化鉀、10mm氯化鎂、10mm氯化鈉、5mm的β-巰基乙醇，用醋酸調(diào)節(jié)ph值至7.0；將上一步的膜放入100ml表面活性劑溶液中，浸泡2d，浸泡溫度為26℃；然后更換浸泡液，再浸泡2d，浸泡溫度為26℃。將膜取放入純化水清洗3次，每次5min。(5)鹽酸胍溶液浸泡：配制2m的鹽酸胍水溶液100ml，將上一步驟的膜放鹽酸胍溶液中，于25℃條件下浸泡2h。取出膜，放入純化水清洗3次，每次5min。(6)脫脂處理:將上述步驟膜放入50%乙醇中浸泡1h；放入60%乙醇中浸泡1h；放入70%乙醇中浸泡1h；放入80%乙醇中浸泡1h；放入90%乙醇中浸泡1h；放入100%乙醇中浸泡1h；然后放入石油醚中浸泡2h；再更換100%乙醇浸泡1h；更換90%乙醇浸泡1h；更換80%乙醇浸泡1h；更換70%乙醇浸泡1h；將膜取放入純化水清洗3次，每次5min。(7)組織孔隙處理：將制備的膜放入1m的氫氧化鈉，浸泡時間為1h。(8)交聯(lián)：取上面浸泡后的膜組織加入體積濃度為1％乙醛的磷酸鹽緩沖溶液（ph=7.0）中進行，反應溫度為25℃，交聯(lián)24h。將膜取出放入純化水清洗3次，每次5min。(9)凍干與滅菌：將上述得到的組織膜在-40℃～-5℃范圍內(nèi)冷凍真空干燥，凍干結(jié)束后將膜放入透析紙袋進行eo滅菌。對照例1:本實施例與實施例1的制備方法相比，其區(qū)別僅在于沒有經(jīng)過鹽酸胍溶液浸泡的步驟。對照例2:本實施例與實施例1的制備方法相比，其區(qū)別在于沒有經(jīng)過脫脂處理的步驟。對照例3:本實施例與實施例2相比，其區(qū)別僅在于沒有組織孔隙處理的步驟。對照例4:本實施例與實施例2相比，其區(qū)別僅在于組織孔隙處理步驟中浸泡時間為4h。效果例：通過實驗例來考察本發(fā)明下述相關(guān)實施例及對照例制備的脫細胞組織膜各項性能：1.降解性能將實施例2，對照例3和對照例4制備的樣品，放入于1m氫氧化鈉溶液，在37℃條件下觀察其降解情況，每隔1h觀察其是否完全降解。降解情況見表1。表1體外降解情況組別降解時間實施例25h對照例38h對照例41h結(jié)論：組織孔隙制備處理過程所用時間越久，其體外降解的時間就越短。2.拉伸強度將實施例2、對照例3和對照例4的制備的樣品裁剪為用啞鈴型模具制成待檢測的樣品條，中間窄處寬度為5mm(w)，兩端寬處寬度為10mm。將啞鈴型樣品的兩端分別固定于拉力機的兩個夾具上，測量補片的中間窄處的厚度(t)，然后開動拉力試驗機，以500mm/min的速度拉伸直至待測樣品斷裂。記錄斷裂力（f）。拉伸強度=f/(wt)。表2拉伸強度測量結(jié)果組別拉伸強度mpa實施例22.3±0.3對照例34.8±0.4對照例40.4±0.2結(jié)果分析：組織孔隙處理過程所用堿時間越長，樣品的拉伸強度，這一結(jié)果與降解性能具有相關(guān)性。3.材料孔徑大小及對細胞粘附效果的影響。將實施例2和對照例3制得的樣品孔徑用掃描電鏡進行表面掃描，測量表面孔徑大小。結(jié)果見表3。實施例2和對照例3的電鏡結(jié)果見圖1。表3孔徑測量結(jié)果組別孔徑（μm）孔徑范圍（μm）實施例286.2±23.631-184對照例3未觀察到明顯孔徑/結(jié)果分析：從結(jié)果上看，組織孔隙處理步驟有助于組織孔隙的生成。4.脂肪含量將實施例1和對照例2制備得到的樣品進行脂肪含量檢測。脂肪含量的按下列步驟進行：準確稱取兩組樣品1.00g并置具塞錐形瓶中，同時設置空白對照組加乙醚10ml密塞，不定時振蕩，放置約2小時后，將乙醚液傾倒至用乙醚潤濕的濾紙上，濾過,殘渣用乙醚10ml照上法處理，再用乙醚5ml洗滌殘渣，合并濾液及洗液至已恒重的蒸發(fā)皿中，使乙醚自然揮散后，在105°c干燥2小時，精密稱定遺留脂肪量。脂肪含量計算方法如下：表4脂肪含量測量結(jié)果組別脂肪含量實施例10.04%對照例20.52%結(jié)果分析：從結(jié)果來看，通過脫脂處理步驟，脂肪含量有了很大的降低。5.體外細胞毒檢測結(jié)果將實施例1、實施例2制備的樣品加入細胞培養(yǎng)基，按6cm2/ml于37℃條件下浸提24h，制備浸提液；將l929細胞消化后，分散在96孔板中，2000個/孔。置于37℃，5%二氧化碳條件下培養(yǎng)過夜（14-16）小時。第二天，棄掉96孔板中的培養(yǎng)基，加入浸提液或?qū)φ諛悠贰Ｖ糜?7℃，5%二氧化碳條件下培養(yǎng)48h。待細胞匯合率為80%時，每孔加mtt20μl，置37℃孵育3小時，棄上清后加dmso150μl/孔。避光震蕩10min后，酶標儀測量570nm和630nm的吸光度，計算各組細胞的相對增殖率，相對增殖率=實驗組吸光度均值（od570-od630）/陰性對照組吸光度均值（od570-od630）×100%。結(jié)果見表5。表5體外細胞毒測量結(jié)果組別細胞增殖情況實施例1106%實施例294%結(jié)果分析：經(jīng)過實施例1和實施例2制備得到的樣品對細胞增殖沒有明顯的影響，沒有明顯的細胞毒性。6.抗原去除效果將未經(jīng)過處理的牛腹腔膜、實施例1和對照例1制備的樣品，制備出石蠟切片，然后進行he染色和免疫組化染色，其中免疫組化染色觀察了兩種常見抗原mch-ⅰ和α-gal的殘留情況。結(jié)果見圖2。結(jié)果分析：從h&e染色結(jié)果來看，經(jīng)過加工工藝的處理，膜內(nèi)組織結(jié)構(gòu)條理整齊清晰，結(jié)構(gòu)未受到破壞，未見到細胞結(jié)構(gòu)。實施例1和對照例1相比，在抗原去除效果上更佳。實施例1工藝中雖然沒有用到α-半乳糖苷酶，但α-gal去除效果良好。7.組織孔隙對細胞粘生長的作用將實施例2和對照例3中的樣品用細胞培養(yǎng)基浸漬后，種入l929成纖維細胞，培養(yǎng)72h小時。取出膜組織用4%多聚甲醛固定1天后凍干，用掃描電鏡觀察l929細胞在表面微孔內(nèi)的生長情況，結(jié)果見圖3。結(jié)果分析：通過組織孔隙制備工藝后得到樣品中的空隙有大量的成纖維細胞生長，沒有孔隙的樣品中細胞生長較少。而成纖維細胞的生長有助創(chuàng)面?zhèn)诘男迯?，因此具有合適孔徑的脫細胞組織膜更適合臨床應用。當前第1頁12