專利名稱：處理豬角膜以脫細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及處理豬角膜的方法，更具體而言，涉及處理豬角膜以脫細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
角膜是折射光線的器官，其占眼球最外層膜的六分之一。角膜總共由五個(gè)層構(gòu)成， 即，角膜上皮層、鮑曼氏膜(Bowman' s membrane)、角膜基質(zhì)層(也稱作固有質(zhì)層)、戴氏膜 (Descemet' s membrane)和角膜內(nèi)皮層。角膜上皮由5至6層細(xì)胞構(gòu)成。角膜上皮的基 底細(xì)胞來自邊緣的干細(xì)胞，向角膜的中心遷移并在7日內(nèi)脫落。鮑曼氏膜由非細(xì)胞的膠原 纖維構(gòu)成，并且是無色透明的。然而，鮑曼氏膜不能再生，在外科手術(shù)或外傷傷害時(shí)通常會 出現(xiàn)疤痕。角膜基質(zhì)占角膜厚度的約90%，并具有均勻排列的尺寸一致的細(xì)胞。戴氏膜由 3至4層細(xì)胞構(gòu)成，并被認(rèn)為是角膜內(nèi)皮細(xì)胞的基膜。角膜內(nèi)皮是單層細(xì)胞，由特化的內(nèi)皮 細(xì)胞構(gòu)成，在再生方面被嚴(yán)格限制，并且其細(xì)胞數(shù)量隨年齡減少。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量減少時(shí)，細(xì)胞 尺寸增加以填補(bǔ)空隙。同時(shí)，因角膜透明性喪失而導(dǎo)致的角膜盲是僅次于白內(nèi)障的引起視力喪失的主要 原因。眼外傷和角膜潰瘍每年使150萬 200萬的人們失明。對于這種失明唯一有效的治 療是移植人類供體角膜(也稱作“角膜移植術(shù)”)。供體角膜的短缺使得需要異體移植的替 代方式。關(guān)于角膜置換已經(jīng)進(jìn)行了大量研究。合成置換材料包括人工角膜和天然角膜等材 料，這些材料使用培養(yǎng)的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)進(jìn)行組織工程化。然而，目前，這些材料因與生物相容性和光學(xué)及機(jī)械性質(zhì)有關(guān)的問題而沒有得到 廣泛應(yīng)用，而利用其它動(dòng)物角膜代替人類角膜的異種移植是發(fā)展最快的方法。豬角膜是最具前景的人類角膜置換物，因?yàn)樗鼈兙哂信c人類角膜相當(dāng)?shù)恼凵渎屎?尺寸，將豬用于移植被認(rèn)為是倫理學(xué)可接受的，并且基因修飾的豬(例如，α_1，3-半乳糖 基轉(zhuǎn)移酶敲除豬和hDAF轉(zhuǎn)基因豬)已被開發(fā)并最終進(jìn)入了臨床實(shí)踐。然而，傳統(tǒng)研究報(bào)道了角膜全厚度異種移植會引發(fā)嚴(yán)重的免疫排斥。另外， 本發(fā)明人報(bào)道的研究顯示，即使在不存在角膜內(nèi)皮的情況下，板層角膜異種移植也 會遭遇免疫排斥
0這意味著角膜細(xì)胞(角膜基質(zhì)細(xì)胞)也可以引起免疫排斥。因此，本發(fā)明的發(fā)明人考慮到，對于具有正常內(nèi)皮細(xì)胞但患有基質(zhì)渾濁的患者，無 細(xì)胞的豬角膜基質(zhì)(已經(jīng)脫去細(xì)胞)可用作板層角膜異種移植的供體組織。此外，角膜移 植的新近范式已經(jīng)由置換整個(gè)區(qū)域的全厚度角膜移植改變?yōu)閮H置換病變區(qū)域的部分厚度 的角膜移植。所述方法被認(rèn)為在臨床實(shí)踐中更為有用。有大量無細(xì)胞生物材料被用于修復(fù)各種器官中的缺陷，并且研究了各種脫細(xì)胞方法。然而，關(guān)于對角膜基質(zhì)脫細(xì)胞的方法還沒有進(jìn)行深入研究，特別是關(guān)于有效處理 角膜同時(shí)減小移植后的免疫反應(yīng)及致病性并保持角膜透明的方法還沒有進(jìn)行研究。

發(fā)明內(nèi)容
因此，鑒于上述問題進(jìn)行了本發(fā)明，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供有效處理角膜同時(shí) 減小角膜移植術(shù)后的免疫反應(yīng)及致病性并保持角膜透明的方法。根據(jù)本發(fā)明，上述和其它目的可以通過提供處理豬角膜的方法而實(shí)現(xiàn)，所述方法 包括將摘出的豬角膜浸入NaCl水溶液中；將該豬角膜浸入胰蛋白酶/EDTA水溶液中；和 洗滌該豬角膜。NaCl水溶液和胰蛋白酶/EDTA水溶液的使用能夠較少免疫反應(yīng)和炎癥，有助于脫 細(xì)胞。NaCl水溶液可以含有1. OM 2. OM NaCl。將豬角膜浸入NaCl水溶液中的步驟可以在35°C 39°C的溫度進(jìn)行12小時(shí) 36 小時(shí)。胰蛋白酶/EDTA水溶液可以含有0.01% 0. 10% (w/v)的胰蛋白酶和0.01% 0. 05% (w/v)的 EDTA。將豬角膜浸入胰蛋白酶/EDTA水溶液中的步驟可以在35°C 39°C的溫度進(jìn)行36 小時(shí) 60小時(shí)。洗滌可以使用磷酸鹽緩沖液(PBS)作為洗滌液來進(jìn)行。


通過以下詳細(xì)描述并結(jié)合附圖，本發(fā)明的上述和其它目的、特征及其它優(yōu)點(diǎn)將會 得到更加清楚的理解，附圖中圖1是下述各組的豬角膜的圖像未處理的對照組(A)、3次凍融組(B)、高滲鹽水 (hypertonic saline) (C)(hyperosmolar glycerol) (D)、月夷胃白
散酶(Dispase)/SDS組(E)和DNase/RNase組(F)。3次凍融組、高滲鹽水組和高滲透甘油 組的角膜保持光學(xué)透明性，而胰蛋白酶/分散酶/SDS組和DNase/RNase組的角膜失去了光 學(xué)透明性；圖2顯示了來自下述各組的蘇木精_曙紅染色的豬角膜對照組(A)、3次凍融組 (B)、高滲鹽水組(C)、高滲透甘油組(D)、胰蛋白酶/分散酶/SDS組(E)和DNase/RNase組 (F)。3次凍融組、高滲鹽水組、高滲透甘油組和胰蛋白酶/分散酶/SDS組幾乎不具有細(xì)胞， 而DNase/RNase組具有嚴(yán)重變形的膠原，且不具任何細(xì)胞結(jié)構(gòu)；圖3顯示了下述各組的豬角膜的TUNEL測試結(jié)果對照組(A)、冷凍組(B)、3次 凍融組(C)、高滲鹽水組(D)、高滲透甘油組(E)、胰蛋白酶/分散酶/SDS組(F)和DNase/ RNase組(G)。對照組和冷凍組不具有凋亡細(xì)胞。另一方面，高滲透甘油組和胰蛋白酶/分 散酶/SDS組具有許多凋亡細(xì)胞；圖4是下述各組的豬角膜的透射電子顯微鏡(TEM)圖像對照組(A，B)、3次凍融 組(C，D)、高滲鹽水組(E，F(xiàn))、高滲透甘油組(G，H)、胰蛋白酶/分散酶/SDS組(I，J)和DNase/RNase組(K，L)。對照組具有在結(jié)構(gòu)良好的膠原束之間的正常角膜細(xì)胞。另一方面， 其它組的角膜具有嚴(yán)重受損的細(xì)胞。胰蛋白酶/分散酶/SDS組和DNase/RNase組具有過 于破碎的膠原纖維且沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)；圖5顯示了由正常角膜培養(yǎng)的豬角膜細(xì)胞(A，B，C)的形態(tài)和由凍融三次的角膜培 養(yǎng)的豬角膜細(xì)胞(D，E，F(xiàn))的形態(tài)。與正常角膜相比，3次凍融的豬角膜在術(shù)后1周(A，D)、 2周(B，E)和3周(C，F(xiàn))生長了較少的細(xì)胞；圖6是兔角膜的圖像，在所述兔角膜中板層移植了豬角膜。新鮮的豬角膜(對照 組)至術(shù)后2周㈧仍保持透明性，但是在術(shù)后4周⑶顯示排斥反應(yīng)。冷凍的豬角膜(冷 凍組)在術(shù)后1個(gè)月(C)也顯示了排斥反應(yīng)，并且高滲透甘油處理的角膜(高滲透甘油組) 較早開始發(fā)炎且變得不透明(D)。移植后，胰蛋白酶/分散酶/SDS組和DNase/RNase組(分 別為E，F(xiàn))發(fā)生了融合。(G)和(H)分別顯示移植后1個(gè)月(G)和移植后2個(gè)月(H)的3次 凍融組的豬角膜。此外，高滲鹽水組的角膜即使在2個(gè)月(L)和6個(gè)月(I)后還保持透明 性；圖7顯示了由豬至兔的板層移植1個(gè)月后的蘇木精-曙紅的染色結(jié)果。對照組具 有炎性細(xì)胞向供體移植連接處的嚴(yán)重的浸潤(A)。在冷凍組(B)、3次凍融組(C)和高滲透 甘油組(D)中也觀察到許多炎性細(xì)胞。另一方面，高滲鹽水組的移植物沒有炎性細(xì)胞，并且 在移植后1個(gè)月(E)和移植后6個(gè)月(F)中被再細(xì)胞化(recellularized)；圖8顯示了⑶3+和Hoechst 33342免疫組織化學(xué)染色。在術(shù)后一個(gè)月顯示排斥 反應(yīng)的對照組的移植物中觀察到許多⑶3+細(xì)胞(A)，而高滲鹽水組的豬角膜移植物不具有 ⑶3+細(xì)胞(B)。術(shù)后1個(gè)月在整個(gè)高滲鹽水處理的移植物中觀察到Hoechst 33342染色的 角膜細(xì)胞(D)。在此情況中，所述角膜細(xì)胞的數(shù)量與正常的兔角膜基質(zhì)相當(dāng)；圖9是術(shù)后1個(gè)月㈧、3個(gè)月⑶和6個(gè)月(C)的兔角膜的體內(nèi)片段的圖像，所 述兔角膜中移植了高滲鹽水處理的豬角膜。觀察移植物-宿主連接處(箭頭)，其意味著豬 移植物適當(dāng)?shù)亟Y(jié)合到了受體的角膜中。在移植后6個(gè)月時(shí)，移植的角膜完全結(jié)合到基體角 膜中，并且連接處已不容易看到；并且圖10是比較總角膜厚度與所移植角膜的移植物厚度的圖(A)，和比較所移植角膜 與對側(cè)的未移植的眼球的角膜之間的總角膜厚度的圖(B)。
具體實(shí)施例方式下面將詳細(xì)闡釋本發(fā)明。用于板層移植或覆蓋移植的最適宜的角膜置換物必須表現(xiàn)出與人類角膜相似的 機(jī)械和光學(xué)性質(zhì)、不會引起免疫反應(yīng)、對于鄰近的眼組織無毒并且具有功能活性的細(xì)胞外基質(zhì)。角膜細(xì)胞外基質(zhì)重要的兩個(gè)原因如下。首先，細(xì)胞外基質(zhì)起到生物支架的作用，所述生物支架提供了角膜恢復(fù)和再生所 需的最適宜的微環(huán)境。其次，由膠原形成的占角膜干重的70%以上的細(xì)胞外基質(zhì)具有薄膠原纖維的板層 形態(tài)，因而對于角膜的透明性是不可或缺的。因此，盡管為開發(fā)角膜置換物付出了艱巨的努力，但是尚未獲得可臨床應(yīng)用的置
5換物。此外，本發(fā)明人認(rèn)為，豬角膜具有用于人類角膜的細(xì)胞外基質(zhì)的潛力，因?yàn)樗鼈兙?有與人類角膜相似的物理和折射性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明人以前的研究，盡管是前板層移植，豬角 膜還是顯示了術(shù)后4周的排斥反應(yīng)
因此，本發(fā)明人決定通過利用物理處理(冷凍、重復(fù)凍融過程)、化學(xué)處理(高滲 (hypertonic)、高滲透(hyperosmolar))或酶處理破壞細(xì)胞來減少豬角膜的免疫反應(yīng)。其 原因在于，膠原具有低抗原性，而細(xì)胞具有高抗原性[Dufrane，D.，Cornu, 0.，Delloye, C. , Schneider, Y.J. Physical and chemicalprocessing for a human dura mater substitute. Biomaterials 23,2979, 2002 ；Minami, A. , Usui, Μ. , Ishii, S. , Kobayashi, H. The in vivo effects of variousimmunoreactive treatments on allogeneic tendon grafts. J Hand Surg[Am]8，888，19，1983.]。作為本發(fā)明的測試結(jié)果，“1. 5mol NaCl，0· 05%胰蛋白酶和0. 02% EDTA”的實(shí)驗(yàn) 組減少了免疫反應(yīng)，最有效地保存了膠原結(jié)構(gòu)，適宜結(jié)合在宿主角膜中，并且保持了角膜透 明性，在部分移植至兔中之后6個(gè)月中沒有引起發(fā)炎或排斥反應(yīng)。此外，一個(gè)比較實(shí)驗(yàn)組(S卩“冷凍組”)沒有從豬角膜中充分地除去細(xì)胞，并且與對 照組(即新鮮豬角膜組)同時(shí)經(jīng)歷了排斥反應(yīng)。此外，另一比較實(shí)驗(yàn)組(即“3次凍融組”)因處理后留下的細(xì)胞殘留物而在移植 后2個(gè)月引發(fā)了排斥反應(yīng)。此外，又一比較實(shí)驗(yàn)組(即“高滲透甘油組”或“胰蛋白酶/分散酶/SDS組”)引 發(fā)了嚴(yán)重的細(xì)胞凋亡從而得到了死亡細(xì)胞碎片，觸發(fā)了兔眼球的免疫反應(yīng)，并經(jīng)歷了較早 的排斥反應(yīng)。此外，其它比較實(shí)驗(yàn)組(即“胰蛋白酶/分散酶/SDS組”和“Dnase/Rnase組”)嚴(yán) 重地破壞了膠原結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致豬角膜的所有膠原纖維被除去和斷裂。另外，所處理的豬角膜失 去了透明性并且被融合。此外，本發(fā)明的值得注意的問題在于，比較實(shí)驗(yàn)組(即高滲鹽水組)的脫細(xì)胞化的 豬角膜基質(zhì)在移植后與宿主角膜干細(xì)胞(sternal cell) 一起被再細(xì)胞化。高滲鹽水組的總 角膜厚度和移植物厚度增加，與對側(cè)的未移植的眼睛相似。這表明，豬角膜基質(zhì)中所再次 增殖的角膜細(xì)胞在功能上是活性的，并且產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)。脫細(xì)胞化的移植物的再細(xì)胞化 非常重要，因?yàn)榻悄ぜ?xì)胞在角膜基質(zhì)的維持和代謝中扮演了必不可少的角色[McLaughlin， C. R.，F(xiàn)agerholm，P.，Muzakare，L，Lagali，N.，F(xiàn)orrester，J. V.，Kuffova，L，Rafat，Μ. Α.， Liu, Y.，Shinozaki，N· , Vascotto, S. G.，Munger，R· ,Griffith,Μ. Regeneration of corneal cells and nerves in an implanted collagencorneal substitute. Cornea 27,580, 2008 ；Salvalaio，G.，F(xiàn)asolo，A.，Bruni，Α.，F(xiàn)rigo，A. C.，F(xiàn)avaro, Ε.，Ponzin，D. Improved preparation and preservation ofhuman keratoplasty lenticules.Ophthalmic Res 35，313，2003 ；Muller, L. J. , Pels, Ε. , Vrensen, G. F. J. M. The effects of organ-culture
6on the density ofkeratocytes and collagen fibers in human corneas. Cornea 20,80, 2004]。下面將提供實(shí)例以便進(jìn)一步理解本發(fā)明。以下實(shí)例僅處于說明性目的，因而不用 于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例和比較例本發(fā)明的實(shí)施例(實(shí)驗(yàn)組)和比較例(比較實(shí)驗(yàn)組)的樣品制 備豬角膜獲自剛死的兄妹交配的小型成年豬(12月齡)。使用乙醇處理上皮并隨后 將其剝下。然后，在攪拌下每隔30分鐘使用磷酸鹽緩沖液(PBS)和抗生素處理角膜3次。 使用直徑為 8. Omm 的環(huán)鉆(Tr印hine) (Kaiindustries Cp. Ltd, Seki city，東京)由豬角 膜獲得250 μ m厚的前板層。如下表1中所示，將角膜分為7組，并按照以下程序進(jìn)行處理。每組包括5只眼睛 (η = 5)(1)未處理的新鮮角膜(對照組)，(2)在_20°C冷凍1周4然后在室溫解凍的角 膜(冷凍組)，(3)通過在含有液氮的50ml的試管中冷凍15分鐘，迅速在37°C解凍，并重 復(fù)該凍融過程3次而獲得的角膜(3次凍融組)，(4)通過浸入1. 5M NaCl溶液，在37°C保 持24小時(shí)，浸入37°C的0. 05%胰蛋白酶/0. 02% EDTA水溶液48小時(shí)，并使用PBS洗滌3 次而獲得的角膜(高滲鹽水組)，(5)通過在4°C的98%甘油溶液中儲存21天，使用PBS洗 滌，在37°C的0. 05%胰蛋白酶/0. 02% EDTA溶液中保持48小時(shí)，并使用PBS洗滌3次而獲 得的角膜(高滲透甘油組)，(6)通過浸入4°C的0. 25%胰蛋白酶溶液24小時(shí)，浸入室溫的 0. 十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液6小時(shí)，使用4°C的560單位/1的分散酶溶液處理12小 時(shí)，使用室溫的0. 1% SDS溶液處理6小時(shí)，并使用PBS洗滌三次而獲得的角膜(胰蛋白酶 /分散酶/SDS組)，(7)通過浸入25°C的0. IM NaOH溶液2小時(shí)，在攪拌下使用40U/mL的 Dnase和RNase處理并使用PBS徹底洗滌而獲得的角膜(Dnase/RNase組)。在用于各組之前，將角膜在4°C儲存。表 1
7 實(shí)驗(yàn)例1 根據(jù)上表1中所示的方法脫細(xì)胞化的角膜基質(zhì)的體外評價(jià)1.宏觀分析宏觀分析揭示，對照組、冷凍組、3次凍融組、高滲鹽水處理組和高滲透甘油處理組 的角膜保持透明，而胰蛋白酶/分散酶/SDS處理組和DNase/RNase處理組的角膜變得不透 明(圖1)。2.微觀分析首先，將各組的豬角膜切片并以蘇木精和曙紅(H&E)染色法染色。然后，在光學(xué)顯 微鏡(Olympus Optical Co. Ltd.，日本東京)下觀察H&E-染色的切片。H&E染色的3次凍融組、高滲鹽水組、高滲透甘油組和胰蛋白酶/分散酶/SDS組 幾乎沒有細(xì)胞。另一方面，對照組和冷凍組具有許多遍布于角膜基質(zhì)中的細(xì)胞核(圖2)。 Dnase/Rnase組不具有細(xì)胞并且膠原結(jié)構(gòu)發(fā)生了嚴(yán)重的變形，這是在宏觀分析中所觀察到 的角膜不透明的內(nèi)在原因。此外，使用ApOpTag Plus Fluorescein原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Chemicon international,Billerica,MA,USA)通過TUNEL測試來分析豬角膜的脫細(xì)胞化機(jī)理。使用 熒光顯微鏡(BX 61，Olympus, Shinjuku，日本東京)觀察凋亡細(xì)胞。作為TUNEL測試的結(jié)果，高滲透甘油組和胰蛋白酶/分散酶/SDS組具有相當(dāng)多的 陽性染色細(xì)胞核，3次凍融組局部具有陽性染色細(xì)胞核，高滲鹽水組幾乎不具有細(xì)胞核(圖 3)。作為TUNEL測試的結(jié)果，對照組和冷凍組的細(xì)胞核沒有被陽性染色。這就是這些 組沒有經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的原因。 此外，Dnase/Rnase組經(jīng)過H&E和TUNEL染色而未染色的原因在于，Dnase和Rnase 是在不存在細(xì)胞碎片或細(xì)胞核碎片下處理的。
此外，為評價(jià)對于角膜細(xì)胞和膠原的細(xì)微傷害，將角膜在2. 5%的戊二醛PBS(pH 7. 2)中固定，保持4°C過夜，并在四氧化鋨中固定1小時(shí)。再次洗滌樣品，并使用連續(xù)稀釋的 乙醇對樣品脫水。將樣品安裝在基棒(stub)上，濺射涂覆金，然后通過TEM(JEM-1400JE0L， 日本東京)觀察。從TEM觀察結(jié)果可以看出，對照組(即新鮮的角膜)具有位于結(jié)構(gòu)良好的膠原薄 片之間的正常角膜細(xì)胞。然而，3次凍融組和高滲透甘油組因凋亡的角膜細(xì)胞殘留物而承受 了顯著的細(xì)胞損傷(圖4)。特別是，高滲鹽水組的角膜不具有可見的細(xì)胞或其殘留物，但是 具有正常保存和排列的膠原束。另一方面，胰蛋白酶/分散酶/SDS組和Dnase/RNase組的 角膜因受到嚴(yán)重破壞的細(xì)胞質(zhì)而只有空洞，不具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)。另外，對于這兩個(gè)組，膠原纖 維消失或嚴(yán)重片段化，表明了膠原薄片形態(tài)的破壞。3.角膜細(xì)胞活力的評價(jià)為評價(jià)角膜細(xì)胞活力，將角膜破碎并在用于角膜細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基(DMEM/F-12， 10% FBS和青霉素-鏈霉素(Lonza，BaselJi^i))中溫育。與對照組中的角膜細(xì)胞相比，3次凍融組的角膜細(xì)胞生長非常緩慢(圖5)。然而， 盡管培養(yǎng)了 21天，但高滲鹽水組、高滲透甘油組、胰蛋白酶/分散酶/SDS組和Dnase/Rnase 組的角膜細(xì)胞沒有生長。實(shí)驗(yàn)例2 關(guān)于異種移植模型的脫細(xì)胞化角膜基質(zhì)的體內(nèi)效率的鑒定1.對于角膜異種移植的臨床過程的評價(jià)使用2kg 3kg的成年新西蘭白兔(Orient Bio Inc.，Seoungnam，韓國)作為本 實(shí)驗(yàn)例2中的角膜移植術(shù)的受體動(dòng)物。通過肌肉內(nèi)施用lOmg/kg的唑拉西泮(Zoletil ， Yuhan Corp.，韓國首爾)和6. 8mg/kg的鹽酸賽拉嗪(Rompun ，Bayer,德國法蘭克福) 麻醉所述兔。為移植豬角膜，使用直徑為8. Omm的環(huán)鉆標(biāo)記豬角膜的250 μ m厚的前板層移植 物，并使用彎月形刀(crescent knife) (Alcon Surgical, Fortfforth, TX, USA)將其手工 分離。使用10-0尼龍縫合線(Ethicon，Somerville, NJ, USA)通過間斷縫合，用8針將豬 角膜的前板層移植物(各組N= 7)縫入兔的受體角膜中。一周時(shí)拆除所有縫合線。進(jìn)行 全部厚度的眼瞼縫合并保持1周。對于手術(shù)的兔每日施用兩次左氧氟沙星抗生素眼藥水 (Cravit , Santen Pharmaceutical Co.，Ltd.，Osaka,日本)，并通過肌肉內(nèi)注射對其施 用全身抗生素(.Gentamicin ，40mg/kg 體重；AbbottLaboratories, North Chicago, IL, USA)。每月使用裂隙燈顯微鏡觀察移植的角膜三次。此處，排斥反應(yīng)被定義為移植物完 全失去透明性的狀況(即，角膜周邊及虹膜結(jié)構(gòu)被移植物完全遮蔽的狀況)。作為觀察結(jié)果，對照組、冷凍組、3次凍融組、高滲鹽水組和高滲透甘油組的角膜被 適當(dāng)?shù)夭⑷胍浦驳耐媒悄ぶ?，并且在一周后被宿主上皮完全再上皮化。對照組和冷凍組的 豬角膜基質(zhì)在移植到兔中2周內(nèi)都是透明的。然而，之后角膜變得不透明并且在移植后4周中所有移植的角膜完全不透明。3次 凍融組的移植物透明了 1個(gè)月，但是在術(shù)后2個(gè)月顯示了排斥反應(yīng)。高滲鹽水組的豬角膜 在移植后6個(gè)月都保持光學(xué)透明，且無排斥反應(yīng)或炎癥。
9的兔眼發(fā)生了炎癥和新生血管形 成，于是變得完全不透明。此外，胰蛋白酶/分散酶/SDS組和Dnase/Rnase組的豬角膜板層在移植到兔中后 馬上融合，移植物失去透明性。各組的移植物的存活時(shí)段和角膜圖像分別如下表2和圖6所示。表2
組別數(shù)量存活時(shí)段(天)對照組720，20，28，28，30，30，34冷凍組720，20，20，24，24，28，283次凍融組743,43,47,47,60,60,60高滲鹽水(NaCl)組7> 30，> 60，> 180，> 180，> 180，> 180，> 180高滲透甘油組716，18，18，18,20,20,20胰蛋白酶/分散酶/SDS組70,0,0,0,0,0,0Dnase/RNase 70,0,0,0,0,0,02.角膜異種移植的組織學(xué)觀察在術(shù)后1、2和6個(gè)月，殺死各組的兔并從其上取出角膜。使用H&E染色或免疫熒光染色來染色角膜片段。在CD3+細(xì)胞存在下對角膜進(jìn)行 免疫熒光染色。將獲得的角膜在10%的中性緩沖甲醛中固定并在4°C溫育過夜。將角膜切 為5 μ m厚，于60°C干燥2小時(shí)，并在二甲苯中脫蠟。然后，將獲得的角膜部分順序使用蛋白 Sl K(20 μ g/ml, Sigma, St. Louis, Missouri, USA) ,5% H2O2 和 0. 3% triton X-100 處理，并 補(bǔ)充的血清。使用抗兔CD3+的單克隆抗體作為一抗，并使用PBS作為陰性對照。使用 FITC-偶聯(lián)的山羊抗兔 IgG(l 1000, Southernbiotech, Birmingham, AL, USA)作為二抗， 并且使用Hoechst 33342 (Sigma)進(jìn)行對比染色。然后，使用熒光顯微鏡觀察染色的⑶3+細(xì) 胞。觀察結(jié)果確認(rèn)，與臨床檢驗(yàn)相似，H&E染色顯示出排斥反應(yīng)和炎性細(xì)胞的嚴(yán)重浸 潤。除了高滲鹽水組之外的組顯示了在供體-移植物連接處中并向移植物中生長的內(nèi)源的 角膜新生血管形成(圖7)。然而，高滲鹽水組的豬角膜在術(shù)后6個(gè)月間沒有發(fā)炎和新生血 管形成。此外，經(jīng)免疫組織化學(xué)染色，高滲鹽水組的豬角膜移植物不具有⑶3+陽性細(xì)胞，而 對照組的豬角膜移植物具有許多⑶3+陽性淋巴細(xì)胞(圖8)。此外，在使用Hoechst 33342 染色并移植到兔中一個(gè)月后，高滲鹽水組的脫細(xì)胞化的豬角膜移植物再次增殖。這表示移
10植物針對宿主角膜細(xì)胞的再次增殖(圖8)。3.角膜異種移植的體內(nèi)片段圖像研究、角膜厚度測量和組織學(xué)結(jié)果利用前部光學(xué)相干斷層成像(opticalcoherence tomography) (OCT ；Visante OCT Model 1000,Carl Zeiss Meditec Inc. ,Dublin,CA,USA)每月獲得全厚度角膜的橫截 面的前部和后部圖像。作為斷層成像的結(jié)果，豬角膜被移植到兔角膜中的組織片段完全結(jié)合在高滲鹽水 組的移植物中，并成功地重構(gòu)在兔角膜中(圖9)。此外，對于角膜厚度的測量，在體內(nèi)使用前部OCT測量總角膜厚度和移植的角膜 基質(zhì)厚度。通過測量角膜上皮與角膜內(nèi)皮之間的距離和角膜內(nèi)皮與移植位點(diǎn)之間的距離來 計(jì)算角膜厚度。使用超聲波測厚儀(Pachymeter,Quantel Medical, Clermont-Ferrand, ^ 國)測量總角膜厚度。作為角膜厚度的順序測量的結(jié)果，顯示移植的豬角膜板層的厚度隨著總角膜厚度 的增加而增加(圖10A)。另外，移植的兔角膜就像對側(cè)的未移植的眼睛那樣正常生長。從上述描述中可以明顯看出，本發(fā)明提供了既不引發(fā)炎癥又不引發(fā)免疫反應(yīng)的處 理豬角膜的方法。通過所述方法脫細(xì)胞化的豬角膜基質(zhì)可以在移植后與角膜細(xì)胞一起再細(xì) 胞化。因此，脫細(xì)胞化的豬角膜基質(zhì)可用于通過體外培養(yǎng)和組織工程化人類角膜細(xì)胞而制 備的角膜置換物。雖然出于說明性目的公開了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道， 可以進(jìn)行各種修改、添加和替代，而不偏離所附權(quán)利要求中公開的本發(fā)明的范圍和精神。
1權(quán)利要求
一種處理豬角膜的方法，所述方法包括將摘出的豬角膜浸入NaCl水溶液中；將所述豬角膜浸入胰蛋白酶/EDTA水溶液中；和洗滌所述豬角膜。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述NaCl水溶液含有1.OM 2. OM的NaCl。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，將所述豬角膜浸入NaCl水溶液中的步驟在35°C 39°C的溫度進(jìn)行12小時(shí) 36小時(shí)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述胰蛋白酶/EDTA水溶液含有0.01% 0. 10% (w/v)胰蛋白酶和 0. 01% 0. 05% (w/v)EDTA0
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，將所述豬角膜浸入胰蛋白酶/EDTA水溶液中的步驟 在35°C 39°C的溫度進(jìn)行36小時(shí) 60小時(shí)。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，洗滌步驟使用磷酸鹽緩沖液(PBS)作為洗滌液來進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于處理豬角膜的方法，所述方法使用NaCl水溶液和胰蛋白酶/EDTA水溶液對摘出的豬角膜脫細(xì)胞化。通過所述方法處理的豬角膜既不會引起炎癥也不會引起免疫排斥。通過所述方法脫細(xì)胞化的豬角膜基質(zhì)可以在移植后與宿主角膜細(xì)胞一起再細(xì)胞化。
文檔編號A61F2/14GK101917932SQ200980100884
公開日2010年12月15日 申請日期2009年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月4日
發(fā)明者吳周娟, 金美昑, 魏元良 申請人:首爾大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)