一種羥乙基殼聚糖原位水凝膠的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羥乙基殼聚糖原位水凝膠的制備方 法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 角膜位于眼球最外層，受傷概率極高，易導(dǎo)致不同程度的瘢痕，影響視力，角膜損 傷種類繁多，其中化學(xué)損傷在臨床上治療難度較大，由于化學(xué)物質(zhì)能對(duì)眼組織結(jié)構(gòu)造成嚴(yán) 重?fù)p傷，導(dǎo)致上皮壞死、脫落，角結(jié)膜融解穿孔及瞼球粘連等，預(yù)后較差；目前臨床上主要以 羊膜移植或角膜移植來治療，但前者常常發(fā)生羊膜自溶，后者又面臨供體缺乏和免疫排斥 兩大問題，所以角膜緣干細(xì)胞移植治療角膜損傷成為研宄的熱點(diǎn)。角膜堿燒傷后，由于堿 的皂化作用，首先破壞角膜的最外層一上皮層，上皮損傷后角膜緣干細(xì)胞向中央移行，形成 覆蓋創(chuàng)面的新上皮。一旦角膜緣損傷，角膜上皮再生來源缺乏，就會(huì)嚴(yán)重延遲角膜上皮的 修復(fù)，從而激發(fā)急性炎癥反應(yīng)；白細(xì)胞迅速侵入角膜，缺損區(qū)出現(xiàn)多形核白細(xì)胞（PMN)，PMN 釋放大量的蛋白酶；其中的膠原酶溶解膠原纖維，而被激活的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs)降解 角膜細(xì)胞外基質(zhì)多種成分，致使角膜組織迅速崩解，形成潰瘍；同時(shí)，暴露的角膜基質(zhì)細(xì)胞 受刺激后，為了彌補(bǔ)潰瘍面的缺損，從靜止?fàn)顟B(tài)向修復(fù)表型的成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn) 化，使得細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，光線通過時(shí)發(fā)生散射而致透明度下降；而且成肌纖維細(xì)胞 會(huì)產(chǎn)生大量的粗大且排列紊亂的膠原纖維，造成組織纖維化瘢痕的形成，嚴(yán)重影響視力的 恢復(fù)。所以，角膜嚴(yán)重?fù)p傷治療必須從兩方面著手，一是進(jìn)行角膜緣干細(xì)胞移植，為角膜上 皮及時(shí)修復(fù)提供種子細(xì)胞；二是防止角膜基質(zhì)細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制瘢痕的形成。 近年來，為了解決角膜缺損后的干細(xì)胞來源問題，研宄者嘗試在體外培養(yǎng)自體或同種異體 培養(yǎng)角膜緣干細(xì)胞（LSCs)用于角膜移植；體外培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞具有諸多優(yōu)點(diǎn)：1、所 需角膜緣組織極少，對(duì)供眼無(wú)潛在威脅；2、培養(yǎng)的細(xì)胞可凍存用于二次移植；3、能抑制眼 表急性病變的發(fā)展，迅速恢復(fù)術(shù)眼正常的眼表結(jié)構(gòu)；4、可避免異體組織移植而導(dǎo)致的免疫 排斥；5、緩解角膜供體來源不足的難題。但角膜緣干細(xì)胞移植必須借助一種安全可靠的載 體，這是決定該技術(shù)應(yīng)用效果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，若載體適宜，角膜緣干細(xì)胞移植將為角膜損傷患 者帶來新的福音；目前，臨床上應(yīng)用較多的載體是羊膜，因其作為一種基底膜，具有類似角、 結(jié)膜的成分，即IV型膠原纖維，但嚴(yán)重角膜損傷如堿燒傷后，組織中膠原酶的表達(dá)量大大增 加，易導(dǎo)致羊膜自溶，直接延緩修復(fù)過程；因此患者即使多次移植，效果仍不理想，探尋一種 安全有效的角膜緣干細(xì)胞移植載體成為當(dāng)前研宄的熱點(diǎn)。
[0003] 在現(xiàn)有技術(shù)中，水溶性的羥乙基殼聚糖（HECTS)是殼聚糖的一種重要衍生物，其 在生物體內(nèi)可被生物酶催化，緩慢降解成對(duì)人體無(wú)毒的單糖，與細(xì)胞外基質(zhì)成分相似，支持 細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)；同時(shí)能夠抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，降低創(chuàng)面轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β ) 表達(dá)水平，從而具有防粘連的作用；海藻酸鈉（SA)是從海藻中提取的天然聚陰離子多糖， 具有良好的成膠性、生物相容性和低毒性以及相對(duì)低廉的價(jià)格，被廣泛地應(yīng)用在輕工業(yè)、食 品、組織工程和醫(yī)藥等領(lǐng)域，SA具有聚陰離子羧基，可與二價(jià)離子形成離子交聯(lián)型水凝膠， 常用作酶類、蛋白質(zhì)、藥物及動(dòng)植物細(xì)胞的包埋固定化載體，但由于二價(jià)離子很容易與周圍 介質(zhì)中的離子發(fā)生交換，導(dǎo)致凝膠的降解速度不可控。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)，尋求設(shè)計(jì)一種羥乙基殼聚糖原位水 凝膠的制備方法，以角膜堿燒傷為研宄模型，針對(duì)角膜損傷修復(fù)制備能夠在角膜損傷原位 自主交聯(lián)快速形成凝膠的新型角膜緣干細(xì)胞移植載體。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明涉及的羥乙基殼聚糖原位水凝膠的制備工藝包括高碘 酸鈉水溶液制備、氧化海藻酸鈉制備和羥乙基殼聚糖原位水凝膠制備三個(gè)步驟：
[0006] (1)、高碘酸鈉水溶液制備：常溫下稱取高碘酸鈉（Sigma，S1878)粉末Ig并溶于 50ml去離子水中，制得質(zhì)量百分比濃度為2%的高碘酸鈉水溶液；
[0007] (2)、氧化海藻酸鈉制備：在質(zhì)量百分比濃度為2%的海藻酸鈉水溶液中按海藻酸 鈉與高碘酸鈉反應(yīng)的摩爾比為10:1加入步驟（1)制備的高碘酸鈉水溶液，在室溫下攪拌 海藻酸鈉水溶液和高碘酸鈉水溶液混合形成的混合液使其進(jìn)行氧化反應(yīng)，24h后在混合液 中加入乙二醇IOOul終止氧化反應(yīng)0. 5h，抽濾混合液并用無(wú)水乙醇脫水沉淀得到白色固形 物，低溫真空干燥白色固形物后制得氧化海藻酸鈉粗品，再將氧化海藻酸鈉粗品用蒸餾水 溶解成質(zhì)量百分比濃度為2%的氧化海藻酸鈉粗品水溶液，在4°C溫度下將氧化海藻酸鈉 粗品水溶液置于透析袋中透析，每6h換1次蒸餾水，用電導(dǎo)率儀測(cè)定氧化海藻酸鈉粗品水 溶液透析完全后進(jìn)行離心后取上清液冷凍干燥制得氧化度為10 %的氧化海藻酸鈉；
[0008] (3)、羥乙基殼聚糖原位水凝膠制備：將質(zhì)量百分比濃度為2%羥乙基殼聚糖與步 驟（2)制得的氧化海藻酸鈉按質(zhì)量比8:1等體積混合后經(jīng)過雙聯(lián)注射器交聯(lián)反應(yīng)擠推至試 管中得羥乙基殼聚糖原位水凝膠。
[0009] 本發(fā)明所述高碘酸鈉為強(qiáng)氧化劑，能氧化鄰二醇結(jié)構(gòu)，使其成為醛或酮；海藻酸 鈉的糖醛酸單元具有順式鄰二醇結(jié)構(gòu)，能在高碘酸鈉的氧化作用下打開C-C鍵生成兩個(gè)醛 基，海藻酸鈉的氧化機(jī)理如圖1所示，海藻酸鈉通過氧化引入醛基制備得到的氧化海藻酸 鈉，直接與帶有游離氨基的羥乙基殼聚糖發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)在創(chuàng)面快速形成原位水凝膠，作為 角膜緣干細(xì)胞移植載體，促進(jìn)角膜上皮重建。
[0010] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，利用海藻酸鈉具有順二醇結(jié)構(gòu)的性質(zhì)，將其適度氧化引 入一定量的醛基，制備成氧化海藻酸鈉，使其能直接與帶有游離氨基的多糖發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)， 氧化海藻酸鈉與羥乙基殼聚糖直接交聯(lián)形成原位水凝膠，作為角膜緣干細(xì)胞移植的載體并 將其用于角膜眼表嚴(yán)重?fù)p傷的修復(fù)，既無(wú)交聯(lián)劑的添加，生物安全性高，又可達(dá)到與損傷角 膜高度吻合；利用羥乙基殼聚糖原位水凝膠快速原位成膠的特性，將體外培養(yǎng)的角膜緣干 細(xì)胞與羥乙基殼聚糖混合后，與氧化海藻酸鈉經(jīng)雙聯(lián)注射器交聯(lián)成膠，將角膜緣干細(xì)胞包 封于眼表創(chuàng)面治療嚴(yán)重角膜損傷，羥乙基殼聚糖原位水凝膠與眼表曲率吻合度更高，克服 了膜片無(wú)法實(shí)現(xiàn)理想曲率的缺點(diǎn)，羥乙基殼聚糖原位水凝膠-角膜緣干細(xì)胞能夠明顯促進(jìn) 角膜上皮重建，有效防止角膜瘢痕化；通過慢病毒感染體外培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞，篩選出穩(wěn) 定表達(dá)熒光素酶的干細(xì)胞用于活體示蹤，來揭示角膜緣干細(xì)胞參與修復(fù)的動(dòng)態(tài)過程；其制 備工藝簡(jiǎn)單，原理安全可靠，制備成本低，產(chǎn)品質(zhì)量好，使用安全，衛(wèi)生，治療環(huán)境友好。
【附圖說明】：
[0011] 圖1是本發(fā)明涉及的海藻酸鈉的氧化機(jī)理示意圖。
[0012] 圖2是本發(fā)明涉及的兔角膜緣干細(xì)胞體外培養(yǎng)圖及細(xì)胞免疫化學(xué)染色結(jié)果 (100 X )，（a)角膜緣干細(xì)胞原代培養(yǎng)；(b)角膜緣干細(xì)胞傳代培養(yǎng)；(c) Λ Np63細(xì)胞免疫化 學(xué)染色；（d)角蛋白K3細(xì)胞免疫化學(xué)染色。
[0013] 圖3是本發(fā)明涉及的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β/Smad通路相關(guān)因子基因及蛋白水平的檢 測(cè)，A:Real-time PCR結(jié)果（*P〈0.05) ;B:Western blot結(jié)果；C-D:相關(guān)因子蛋白水平的比 較。
【具體實(shí)施方式】：
[0014] 下面通過實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。
[0015] 實(shí)施例：
[0016] 本實(shí)施例涉及的羥乙基殼聚糖原位水凝膠的制備工藝包括高碘酸鈉水溶液制備、 氧化海藻酸鈉制備和羥乙基殼聚糖原位水凝膠制備三個(gè)步驟：
[0017] (1)、高碘酸鈉水溶液制備：常溫下稱取高碘酸鈉（sigma，S1878)粉末Ig并溶于 50ml去離子水中，制得質(zhì)量百分比濃度為2%的高碘酸鈉水溶液；
[0018] (2)、氧化海藻酸鈉制備：在質(zhì)量百分比濃度為2%的海藻酸鈉水溶液中按海藻酸 鈉與高碘酸鈉反應(yīng)的摩爾比為10:1加入步驟（1)制備的高碘酸鈉水溶液，在室溫下攪拌 海藻酸鈉水溶液和高碘酸鈉水溶液混合形成的混合液使其進(jìn)行氧化反應(yīng)，24h后在混合液 中加入乙二醇IOOul終止氧化反應(yīng)0. 5h，抽濾混合液并用無(wú)水乙醇脫水沉淀得到白色固形 物，低溫真空干燥白色固形物后制得氧化海藻酸鈉粗品，再將氧化海藻酸鈉粗品用蒸餾水 溶解成質(zhì)量百分比濃度為2%的氧化海藻酸鈉粗品水溶液，在4°C溫度下將氧化海藻酸鈉 粗品水溶液置于透析袋中透析，每6h換1次蒸餾水，用電導(dǎo)率儀測(cè)定氧化海藻酸鈉粗品水 溶液透析完全后進(jìn)行離心后取上清液冷凍干燥制得氧化度為10 %的氧化海藻酸鈉；
[0019] (3)、羥乙基殼聚糖原位水凝膠制備：將質(zhì)量百分比濃度為2%羥乙基殼聚糖與步 驟（2)制得的氧化海藻酸鈉按質(zhì)量比8:1等體積混合后經(jīng)過雙聯(lián)注射器交聯(lián)反應(yīng)擠推至試 管中得羥乙基殼聚糖原位水凝膠。
[0020] 本實(shí)施例所述高碘酸鈉為強(qiáng)氧化劑，能氧化鄰二醇結(jié)構(gòu)，使其成為醛或酮；海藻酸 鈉的糖醛酸單元具有順式鄰二醇結(jié)構(gòu)，能在高碘酸鈉的氧化作用下打開C-C鍵生成兩個(gè)醛 基，海藻酸鈉的氧化機(jī)理如圖1所示，海藻酸鈉通過氧化引入醛基制備得到的氧化海藻酸 鈉，直接與帶有游離氨基的羥乙基殼聚糖發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)在創(chuàng)面快速形成原位水凝膠，作為 角膜緣干細(xì)胞移植載體，促進(jìn)角膜上皮重建。
[0021] 本實(shí)施例制備的羥乙基殼聚糖原位水凝膠的性質(zhì)測(cè)定包括細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)、皮內(nèi)刺 激試驗(yàn)、體內(nèi)降解性實(shí)驗(yàn)和生物相容性評(píng)價(jià)四個(gè)方面：
[0022] (1)、細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)：參照國(guó)標(biāo)醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)（GB/ T16886. 5-2003)標(biāo)準(zhǔn)和樣品制備與參照樣品（GB/T16886. 12-2003)標(biāo)準(zhǔn)，按200mg凝膠/ ml培養(yǎng)基的比例，于37°C浸提羥乙基殼聚糖原位水凝膠24h，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的L929成纖維細(xì) 胞常規(guī)消化，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5. 0 X 104個(gè)/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加200 μ L，培 養(yǎng)24h后，吸棄原培養(yǎng)液，分別加入凝膠浸提原液，同時(shí)設(shè)立正常、空白、和樣品對(duì)照組，每 組各設(shè)6個(gè)平行孔，分別于培養(yǎng)2d、4d、7d時(shí)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，MTT方法檢測(cè) 細(xì)胞增殖率，實(shí)驗(yàn)組的吸光值與對(duì)照組相比