一種以寡聚亞胺作為交聯(lián)劑制備水凝膠的方法
【專利摘要】一種以寡聚亞胺作為交聯(lián)劑制備水凝膠的方法，屬于醫(yī)用高分子材料技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首先利用二醛(或多醛)和脂肪族二胺(或多胺)間的亞胺反應(yīng)(又稱為席夫堿反應(yīng))制備寡聚亞胺交聯(lián)劑，再進(jìn)一步通過交聯(lián)劑和高分子之間的亞胺反應(yīng)形成水凝膠。其中，脂肪族二胺(或多胺)包括生物體內(nèi)廣泛存在的活性分子，如可防止細(xì)胞凋亡的亞精胺；二醛(或多醛)可以是生物相容性較好的二醛(或多醛)分子；高分子可以是含有多個氨基或醛基的高分子。由于亞胺反應(yīng)具有速度快，反應(yīng)條件溫和的優(yōu)點，本制備方法操作簡單，成形迅速，且成本較低，可以在保證水凝膠具有較好機械性能的同時，避免引入小分子或不必要的成分所帶來的生物毒性。
【專利說明】
一種以寡聚亞胺作為交聯(lián)劑制備水凝膠的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)用高分子材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以含有生物活性分子的寡聚亞胺為交聯(lián)劑，交聯(lián)高分子制備水凝膠的方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]在制備殼聚糖水凝膠中常用的雙官能化的小分子交聯(lián)劑包括戊二醛、二環(huán)氧甘油醚、二異氰酸酯、丙烯酸酯等。跟物理凝膠相比，這些通過小分子交聯(lián)的水凝膠的機械性能通常有所提高，但是這些小分子交聯(lián)的的生物相容性往往較差，其中有一些甚至是有毒性的。有研究報道京尼平(Genipin)是一種具有生物相容性的小分子交聯(lián)劑，它能高效地同含有氨基的聚合物交聯(lián)，毒性也遠(yuǎn)小于戊二醛，但京尼平本身容易發(fā)生自聚。
[0003]為了不在反應(yīng)中引入小分子交聯(lián)劑，有研究者首先將參加反應(yīng)的聚合物官能化， 聚合物與聚合物之間的官能團通過共價交聯(lián)形成水凝膠。當(dāng)氨基琥珀?；臍ぞ厶?_ succinylated chitosan)與末端醛基化的透明質(zhì)酸在生理酸性條件下共混，通過聚合物-聚合物官能化反應(yīng)四分鐘內(nèi)即可形成水凝膠，但是此種方法操作步驟復(fù)雜，反應(yīng)時間較長。 光交聯(lián)反應(yīng)類似于聚合物-聚合物交聯(lián)反應(yīng)，是將帶有光敏感基團的聚合物共混，在光照條件下聚合物之間原位反應(yīng)形成水凝膠。〇no等人通過將聚合物疊氮化，原位反應(yīng)制得光敏感型殼聚糖水凝膠。光交聯(lián)反應(yīng)需要光敏劑和長時間的輻照，這會導(dǎo)致局部溫度升高，使周圍的組織或細(xì)胞受到損傷。
[0004]亞胺鍵廣泛存在于生物體內(nèi)，具有可逆交換快、條件溫和、可控的特點，因此本發(fā)明以亞胺鍵作為水凝膠的主要交聯(lián)方式。為避免小分子交聯(lián)劑的毒性問題，本發(fā)明設(shè)計了一種富含亞胺鍵的寡聚亞胺交聯(lián)劑，從而延緩小分子的釋放，降低局部濃度，減輕毒副作用。同時，可在寡聚亞胺交聯(lián)劑中引入生物活性分子，如亞精胺或抗腫瘤藥物阿霉素，從而實現(xiàn)多種效果。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種通過生物活性分子形成寡聚亞胺交聯(lián)劑，再利用交聯(lián)劑連接高分子化合物制備水凝膠的方法。本方法制備的水凝膠具有良好的生物相容性并能夠負(fù)載生物活性分子。
[0006]本發(fā)明首先利用二醛(或多醛)和脂肪族二胺(或多胺)間的亞胺反應(yīng)(又稱為席夫堿反應(yīng))制備寡聚亞胺交聯(lián)劑，再進(jìn)一步通過交聯(lián)劑和高分子之間的亞胺反應(yīng)形成水凝膠。 其中，脂肪族二胺(或多胺)包括生物體內(nèi)廣泛存在的活性分子，如可防止細(xì)胞凋亡的亞精胺;二醛(或多醛)可以是生物相容性較好的二醛(或多醛)分子;高分子可以是含有多個氨基或酸基的尚分子。
[0007]由于亞胺反應(yīng)具有速度快，反應(yīng)條件溫和的優(yōu)點，本制備方法操作簡單，成形迅速，且成本較低，可以在保證水凝膠具有較好機械性能的同時，避免引入小分子或不必要的成分所帶來的生物毒性。
[0008]一種以寡聚亞胺作為交聯(lián)劑制備水凝膠的方法，其步驟如下:
[0009]1)配制二醛或多醛溶液
[0010]在室溫條件下將二醛或多醛溶于無水乙醇，溶液中醛類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% ?25%，室溫下混勻備用；
[0011]2)制備交聯(lián)劑
[0012]取脂肪族二胺或多胺，滴加到步驟1)制備得到的二醛或多醛的無水乙醇溶液中， 混勻至澄清，二醛或多醛中醛基與脂肪族二胺或多胺中氨基的摩爾用量比為0.5?2:1，在室溫條件下反應(yīng)20?40秒，制備得到寡聚亞胺交聯(lián)劑；[〇〇13]3)制備水凝膠
[0014]在室溫條件下，將步驟2)制備得到的寡聚亞胺交聯(lián)劑逐滴加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% ?3%的高分子溶液中，寡聚亞胺交聯(lián)劑中自由基團(醛基或氨基)與高分子中自由基團(氨基或醛基)的摩爾量比例范圍為0.2?3:1000，反應(yīng)30秒?2小時，從而制備得到水凝膠； [〇〇15]或在室溫條件下，將藥物配制成溶液(如溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.7%的生理鹽水中配制成濃度為1?3mg/mL的藥物溶液)后加入到步驟2)制備得到的寡聚亞胺交聯(lián)劑中混勻，再逐滴加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%?3%的高分子溶液中，反應(yīng)30秒?2小時，從而制備得到載藥水凝膠;高分子中自由基團(氨基或醛基)、藥物中自由基團(醛基或氨基)與交聯(lián)劑中自由基團 (氨基或醛基)的摩爾比例為12000:1:2.4?36;[〇〇16] 二醛為乙二醛、丙二醛、丁二醛、戊二醛、對苯二甲醛、鄰苯二甲醛；多醛為鹽酸吡哆醛、磷酸吡哆醛、苯三甲醛、丙三醛等。[〇〇17]二胺為亞精胺、精胺、腐胺、二乙烯基三胺等；多胺為三(2-氨基乙基)胺或精氨酸等。
[0018]高分子為殼聚糖、聚乙烯亞胺等含有伯胺基的天然或氨基修飾過的高分子化合物以及醛基修飾過的高分子化合物。
[0019]高分子溶液為高分子的酸性溶液或堿性溶液。用于溶解高分子的酸是醋酸水溶液，用于溶解高分子的堿是由氫氧化鋰、氫氧化鉀、尿素組成的水溶液，醋酸水溶液中醋酸的體積分?jǐn)?shù)為1 %?2 %，堿液中氫氧化鋰、氫氧化鉀、尿素和水的質(zhì)量比為4.5:7:8?0: 80.5?88.5(溶液總質(zhì)量為100% )。
[0020]藥物為阿霉素、紅霉素、氧氟沙星等?！靖綀D說明】[〇〇21 ]圖1:寡聚亞胺交聯(lián)的水凝膠合成過程示意圖；[〇〇22]如圖1所示，提供醛基的對苯二甲醛與提供氨基的亞精胺首先通過亞胺鍵鍵合形成寡聚亞胺交聯(lián)劑，其中醛基與氨基的摩爾比例為1.2:1，然后寡聚亞胺交聯(lián)劑與富含氨基的高分子物質(zhì)殼聚糖交聯(lián)，形成水凝膠。
[0023]圖2:酸性體系下不同醛基和氨基比例時得到的殼聚糖水凝膠照片。殼聚糖的醋酸水溶液中殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% (醋酸水溶液中醋酸的體積分?jǐn)?shù)為1 % )，體積用量lmL，寡聚亞胺交聯(lián)劑的添加量為20此。醛基與氨基的摩爾比例:C13比例為1:1 ;C14比例為1.05:1; C15比例為1.1:1 ;C16比例為1.2:1 ;C17比例為1.5:1 ;C17比例為2:1。將第一組中相應(yīng)的凝膠倒置得第二組凝膠照片，可以發(fā)現(xiàn)不同對苯二甲醛與亞精胺的摩爾比例的交聯(lián)劑均能與殼聚糖反應(yīng)形成均一透明狀的膠體，并能將反應(yīng)中所有液體包涵于水凝膠中。
[0024]圖3:堿性體系下不同濃度殼聚糖在不同交聯(lián)度下得到的殼聚糖水凝膠照片。
[0025]由圖3可見，交聯(lián)度(交聯(lián)劑中自由醛基占?xì)ぞ厶侵凶杂砂被谋壤?在I%?3.2%，殼聚糖濃度為1.5%或2%時，都能較好成膠。而當(dāng)殼聚糖濃度為2.5%，交聯(lián)度為2.5%,3.2%時不能較好的成膠。當(dāng)交聯(lián)度在I %和1.74%時膠的形態(tài)良好，增加交聯(lián)度到
3.2%時，一方面膠體不能很好地成形，另一方面成形的膠體比較脆，容易被折斷?？梢姴⒎侵挥袣ぞ厶菨舛刃枰幸粋€適當(dāng)?shù)娜≈捣秶?，交?lián)度取值同樣需要有一個適當(dāng)?shù)姆秶?br>[0026]圖4:水凝膠中性紅活細(xì)胞染料染色圖及細(xì)胞凋亡檢測試劑盒染色圖；殼聚糖濃度為2%，交聯(lián)度為1.74%。
[0027]左圖為水凝膠中性紅活細(xì)胞染料染色圖(中性紅同時也是一種pH指示劑，核酸和溶酶體呈酸性，會被染成紅色)，本圖經(jīng)過黑白處理，其中白色部分是凝膠顏色，黑色圓點為長在凝膠中的細(xì)胞，可以看出有大量的細(xì)胞長在凝膠中，說明凝膠具有良好的生物相容性。
[0028]右圖為Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒染色圖(碘化丙啶可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色熒光，Annexin V-FITC可以進(jìn)入到細(xì)胞漿內(nèi)，使壞死細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。)其中整塊圓形白色部分為凝膠，凝膠上黑點為被著色長在凝膠中的細(xì)胞，整塊黑色部分為觀察背景，背景中的白點為長在凝膠外的細(xì)胞。凝膠上的細(xì)胞說明細(xì)胞能夠較好的長在水凝膠中，水凝膠具有良好的生物相容性。
【具體實施方式】
[0029]實施例1
[0030](I)配制二醛溶液
[0031]在室溫條件下將對苯二甲醛0.103g溶于ImL無水乙醇中，醛類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.4%，室溫下混勻備用；
[0032](2)制備寡聚亞胺交聯(lián)劑
[0033]取亞精胺lOOyL，滴加到對苯二甲醛乙醇溶液中，混勻至澄清，對苯二甲醛中醛基與亞精胺中氨基的摩爾比例為1.2:1，在室溫條件下反應(yīng)30s，制備得到寡聚亞胺交聯(lián)劑。
[0034](3)寡聚亞胺交聯(lián)的水凝膠
[0035]將制得的寡聚亞胺交聯(lián)劑逐滴加入到lmL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的殼聚糖的醋酸水溶液中(醋酸水溶液中醋酸的體積分?jǐn)?shù)為I % )，交聯(lián)劑與高分子通過亞胺鍵鍵合形成水凝膠，反應(yīng)時間30s。
[0036]實施例2
[0037](I)配制二醛溶液
[0038]在室溫條件下將對苯二甲醛0.103g溶于ImL無水乙醇中，醛類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.4%，室溫下混勻備用；
[0039](2)制備寡聚亞胺交聯(lián)劑
[0040]取亞精胺lOOyL，滴加到對苯二甲醛乙醇溶液中，混勻至澄清，對苯二甲醛中醛基與亞精胺中氨基的摩爾比例為1.2:1，在室溫條件下反應(yīng)30s，制備得到寡聚亞胺交聯(lián)劑。[0041 ] (3)寡聚亞胺交聯(lián)的水凝膠
[0042]將制得的寡聚亞胺交聯(lián)劑逐滴加入到lmL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的殼聚糖的氫氧化鋰/氫氧化鉀/尿素溶液中(10g堿溶液中氫氧化鋰、氫氧化鉀、尿素、水的質(zhì)量分別為4.5g: 7g:8g: 80.5g)，交聯(lián)劑與高分子通過亞胺鍵鍵合形成水凝膠，反應(yīng)時間2h。
[0043]實施例3
[0044](I)配制二醛溶液
[0045]在室溫條件下將對苯二甲醛0.128g溶于ImL無水乙醇中，醛類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.92%，室溫下混勻備用；
[0046](2)制備寡聚亞胺交聯(lián)劑
[0047]取亞精胺lOOyL，滴加到對苯二甲醛乙醇溶液中，混勻至澄清，對苯二甲醛中醛基與亞精胺中氨基的摩爾比例為1.5:1，在室溫條件下反應(yīng)30s，制備得到寡聚亞胺交聯(lián)劑。
[0048](3)寡聚亞胺交聯(lián)的水凝膠
[0049]將制得的寡聚亞胺交聯(lián)劑逐滴加入到lmL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的殼聚糖的醋酸水溶液中(醋酸水溶液中醋酸的體積分?jǐn)?shù)為I % )，交聯(lián)劑與高分子通過亞胺鍵鍵合形成水凝膠，反應(yīng)時間30s。
[0050]實施例4
[0051](I)配制二醛溶液
[0052]在室溫條件下將對苯二甲醛0.128g溶于ImL無水乙醇中，醛類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.92%，室溫下混勻備用；
[0053](2)制備寡聚亞胺交聯(lián)劑
[0054]取亞精胺lOOyL，滴加到對苯二甲醛乙醇溶液中，混勻至澄清，對苯二甲醛中醛基與亞精胺中氨基的摩爾比例為1.5:1，在室溫條件下反應(yīng)30s，制備得到寡聚亞胺交聯(lián)劑。
[0055](3)寡聚亞胺交聯(lián)的水凝膠負(fù)載藥物
[0056]在室溫條件下，將5mg阿霉素溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.7%的生理鹽水中配制成濃度為Img/HiL的藥物溶液，量取200yL加入到上述制得的寡聚亞胺交聯(lián)劑中混勻，混勻后的上述產(chǎn)物投入到lmL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的殼聚糖的醋酸水溶液中(醋酸水溶液中醋酸的體積分?jǐn)?shù)為1%)，結(jié)合藥物的寡聚亞胺交聯(lián)劑與高分子通過亞胺鍵鍵合形成載藥水凝膠，反應(yīng)時間30s。
【主權(quán)項】
1.一種以寡聚亞胺作為交聯(lián)劑制備水凝膠的方法，其步驟如下:1)配制二醛或多醛溶液在室溫條件下將二醛或多醛溶于無水乙醇，溶液中醛類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%? 25%，室溫下混勻備用；2)制備交聯(lián)劑取脂肪族二胺或多胺，滴加到步驟1)制備得到的二醛或多醛的無水乙醇溶液中，混勻 至澄清，二醛或多醛中醛基與脂肪族二胺或多胺中氨基的摩爾用量比為0.5?2:1，在室溫 條件下反應(yīng)20?40秒，制備得到寡聚亞胺交聯(lián)劑；3)制備水凝膠在室溫條件下，將步驟2)制備得到的寡聚亞胺交聯(lián)劑逐滴加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%?3% 的高分子溶液中，寡聚亞胺交聯(lián)劑中自由基團醛基或氨基與高分子中自由基團氨基或醛基 的摩爾量比例范圍為0.2?3:1000，反應(yīng)30秒?2小時，從而制備得到水凝膠；或在室溫條件下，將藥物配制成溶液后加入到步驟2)制備得到的寡聚亞胺交聯(lián)劑中混 勻，再逐滴加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %?3 %的高分子溶液中，反應(yīng)30秒?2小時，從而制備得到 載藥水凝膠;高分子中自由基團氨基或醛基、藥物中自由基團醛基或氨基與交聯(lián)劑中自由 基團氨基或醛基的摩爾比例為12000:1:2.4?36。2.如權(quán)利要求1所述的一種以寡聚亞胺作為交聯(lián)劑制備水凝膠的方法，其特征在于:二 醛為乙二醛、丙二醛、丁二醛、戊二醛、對苯二甲醛或鄰苯二甲醛；多醛為鹽酸吡哆醛、磷酸 吡哆醛、苯三甲醛或丙三醛。3.如權(quán)利要求1所述的一種以寡聚亞胺作為交聯(lián)劑制備水凝膠的方法，其特征在于:二 胺為亞精胺、精胺、腐胺或二乙烯基三胺;多胺為三(2-氨基乙基)胺或精氨酸。4.如權(quán)利要求1所述的一種以寡聚亞胺作為交聯(lián)劑制備水凝膠的方法，其特征在于:高 分子為殼聚糖或聚乙烯亞胺。5.如權(quán)利要求1所述的一種以寡聚亞胺作為交聯(lián)劑制備水凝膠的方法，其特征在于:高 分子溶液為高分子的酸性溶液或堿性溶液。6.如權(quán)利要求5所述的一種以寡聚亞胺作為交聯(lián)劑制備水凝膠的方法，其特征在于:用 于溶解高分子的酸性溶液是醋酸水溶液，用于溶解高分子的堿性溶液是由氫氧化鋰、氫氧 化鉀和尿素組成的水溶液。7.如權(quán)利要求6所述的一種以寡聚亞胺作為交聯(lián)劑制備水凝膠的方法，其特征在于:醋 酸水溶液中醋酸的體積分?jǐn)?shù)為1 %?2%。8.如權(quán)利要求6所述的一種以寡聚亞胺作為交聯(lián)劑制備水凝膠的方法，其特征在于:由 氫氧化鋰、氫氧化鉀和尿素組成的水溶液中，氫氧化鋰、氫氧化鉀、尿素和水的質(zhì)量比為 4.5:7:8?0:80.5?88.5〇9.如權(quán)利要求1所述的一種以寡聚亞胺作為交聯(lián)劑制備水凝膠的方法，其特征在于:藥 物為阿霉素、紅霉素或氧氟沙星。
【文檔編號】C08L5/08GK106084254SQ201610416093
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月13日 公開號201610416093.5, CN 106084254 A, CN 106084254A, CN 201610416093, CN-A-106084254, CN106084254 A, CN106084254A, CN201610416093, CN201610416093.5
【發(fā)明人】劉鎮(zhèn)寧, 梁嵩, 李瑞潔, 魯博, 呂燕婷, 孫航, 李家億, 盧國龍
【申請人】吉林大學(xué)