一種用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于骨?軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法，屬于生物材料技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首先制備兩份質(zhì)量分數(shù)相同的雙鍵化生物大分子預(yù)聚液，然后分別將預(yù)聚液制備成包含修復(fù)因子納米顆粒的上層軟骨修復(fù)預(yù)聚液和包含鈣磷納米顆粒的下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液，基于懸浮原理和光聚合反應(yīng)，通過納米顆粒的沉降、擴散作用形成功能隨組成、結(jié)構(gòu)的變化而變化的功能梯度水凝膠。本發(fā)明制備出的仿生水凝膠具備良好的生物可降解性、生物相容性，負載的生長因子效率高，緩釋性能好，可誘導(dǎo)軟骨、軟骨下骨的修復(fù)，實現(xiàn)骨?軟骨的雙向再生，滿足關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)。
【專利說明】
一種用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物材料技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]關(guān)節(jié)軟骨損傷是目前臨床上面臨的最具有挑戰(zhàn)性的問題之一，目前，臨床上關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的治療方法主要有微骨折法、自體軟骨移植和同種異體軟骨移植。軟骨的再生和自體修復(fù)能力極其有限，而現(xiàn)有人工軟骨假體存在生物活性差、與軟骨下骨結(jié)合性能差等問題。
[0003]水凝膠是一種具有親水基團、能夠在水中溶脹但又不溶于水的具有交聯(lián)三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚合物，是一種重要的功能高分子材料，是當(dāng)前材料科學(xué)的研究熱點之一。水凝膠含有親水性基團，可以在水中大量吸水膨脹，大都含有較高的含水量，模量較低，并能保持固體的形狀。除此之外，通過采用不同的單體，多種單體共聚，填充納米填料，在高分子鏈上接枝官能性基團等等可以獲得各種功能性水凝膠，因此，水凝膠材料在生物、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域有著重要意義。尤其因水凝膠的結(jié)構(gòu)和天然軟骨的細胞外基質(zhì)相似，已被廣泛應(yīng)用于骨軟骨缺損再生的研究。
[0004]然而，傳統(tǒng)的可降解天然高分子水凝膠具有以下不足:水凝膠的力學(xué)性能差，難以適應(yīng)關(guān)節(jié)所處的各種力學(xué)環(huán)境，限制了其作為骨軟骨替換材料的應(yīng)用;其次，軟骨層厚度有限，軟骨損傷將引起軟骨下骨的損傷，軟骨下骨的損傷又可以影響軟骨層的新陳代謝，單純的軟骨替代材料不利于軟骨形態(tài)與結(jié)構(gòu)功能的修復(fù);雙層水凝膠結(jié)構(gòu)上與關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)相似，有助于骨軟骨的修復(fù)，但是目前研究表明雙層水凝膠上下層界面結(jié)合性差，不能做到梯度性功能修復(fù)，同時上層水凝膠通過溶脹浸泡吸附因子容易造成短期釋放量高、長期活性降低等問題。
[0005]梯度功能復(fù)合材料(FGM)是指材料的組分和結(jié)構(gòu)從材料的某一方位向另一方位連續(xù)地變化，使得材料的性能和功能也呈現(xiàn)梯度變化的一種新型材料。從材料結(jié)構(gòu)來看，梯度功能材料是選擇兩種或多種性能不同的材料通過連續(xù)地改變這兩種或多種材料的組成和結(jié)構(gòu)，使其界面消失導(dǎo)致材料的性能隨著材料組成和結(jié)構(gòu)的變化而變化。
[0006]軟骨-骨、肌腱-骨、韌帶-骨等骨界面組織在解剖結(jié)構(gòu)和組織成分上是不均一的，而且骨界面具備結(jié)構(gòu)和組成連續(xù)梯度變化的特征，所以為了實現(xiàn)界面組織的良好修復(fù)，需要與關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)相似的仿生梯度功能化的水凝膠結(jié)構(gòu)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法。本發(fā)明制備的功能梯度水凝膠具備良好的生物可降解性、生物相容性，負載的生長因子效率高，緩釋性能好，可誘導(dǎo)軟骨、軟骨下骨的修復(fù)，實現(xiàn)骨-軟骨的雙向再生，滿足關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)。
[0008]—種用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法，具體步驟如下:
[0009]步驟A:通過甲基丙烯酸酐化在生物大分子上引入雙鍵得到雙鍵化生物大分子，將所述雙鍵化生物大分子作為單體配制成兩份質(zhì)量分數(shù)相同的水溶液I與水溶液Π，并在兩份水溶液中加入等量的光引發(fā)劑；
[0010]步驟B:將步驟A中所述水溶液I和將水溶液Π分別制備成上層軟骨修復(fù)預(yù)聚液和下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液;所述上層軟骨修復(fù)預(yù)聚液含有負載軟骨生長因子的蛋白納米顆粒，所述下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液含有鈣磷納米顆粒；
[0011]步驟C:將步驟B中上層軟骨修復(fù)預(yù)聚液緩慢加入下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液使其界面互溶，通過光聚合反應(yīng)形成功能梯度水凝膠。
[0012]本技術(shù)方案中，步驟A通過以下技術(shù)手段實現(xiàn):
[0013]本發(fā)明的用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法，其所述步驟A中雙鍵化生物大分子的制備步驟具體為:
[0014]Al:稱取生物大分子溶解于磷酸鹽緩沖液中，在水浴條件下配制成溶液；
[0015]A2:以0.5?3ml/min的速度將甲基丙烯酸酐滴加到生物大分子溶液中，然后攪拌反應(yīng)2?24小時；
[0016]A3:向生物大分子與甲基丙烯酸酐的反應(yīng)液中加入磷酸鹽緩沖液稀釋以終止反應(yīng)；
[0017]A4:將步驟A3中稀釋后溶液置于截留分子量為12?14kDa的透析袋中，用去離子水透析后冷凍干燥得到雙鍵化生物大分子。
[0018]其中，所述步驟A中的生物大分子是膠原、明膠、海藻酸鈉、硫酸軟骨素、殼聚糖和透明質(zhì)酸或絲素蛋白中任一種。
[0019]其中，所述步驟A所述水溶液I和水溶液Π的質(zhì)量分數(shù)均為5?20%。
[0020]其中，所述步驟A所述光引發(fā)劑質(zhì)量占所述單體質(zhì)量的百分比為0.05?0.5%。
[0021 ]本技術(shù)方案中，步驟B通過以下技術(shù)手段實現(xiàn):
[0022]本發(fā)明的用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法，其所述步驟B中上層軟骨修復(fù)預(yù)聚液的制備在于向水溶液I中加入軟骨生長因子混合均勻形成上層軟骨修復(fù)預(yù)聚液;優(yōu)選地，在水溶液I中加入包裹軟骨生長因子的蛋白納米顆粒，所述蛋白納米顆粒負載生長因子的方式可以是物理吸附也可以是化學(xué)鍵結(jié)合。以蛋白納米顆粒作為載體不僅有利于保護生長因子的活性而且能夠控制其釋放速率，從而調(diào)控細胞分化與組織生長過程。
[0023]其中，所述步驟B中的軟骨生長因子是TGF-m、TGF-02、TGF-03或IGF。
[0024]其中，所述步驟B中負載軟骨生長因子的蛋白納米顆粒可以是牛血清蛋白納米顆粒、人血清蛋白納米顆?；蚵寻椎鞍准{米顆粒。
[0025]本發(fā)明的用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法，其所述步驟B中下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液的制備在于向水溶液Π中加入利于軟骨下骨修復(fù)、再生的納米顆粒形成下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液;優(yōu)選地，采用鈣磷納米顆粒，具體操作如下:將水溶液Π分為兩份，其中一份加入鈣鹽使其鈣離子濃度為0.05?1.5mol/L，另一份加入磷酸鹽使其磷酸根離子濃度為0.05?1.2mol/L，然后將含有磷酸鹽的預(yù)聚液滴入含有|丐鹽的預(yù)聚液中，快速攪拌制得含有鈣磷納米顆粒的下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液。
[0026]其中，步驟B中的鈣鹽是硝酸鈣、氟化鈣和碳酸鈣中任一種，所述磷酸鹽是磷酸氫二銨、磷酸二氫銨和磷酸氫二鈉中任一種。
[0027]本技術(shù)方案中，步驟C通過以下技術(shù)手段實現(xiàn):
[0028]本發(fā)明的用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法，其所述步驟C中上層軟骨修復(fù)預(yù)聚液與下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液密度不同，兩種液體在界面處梯度擴散，由于納米顆粒密度與成分的差異，兩種納米顆粒的擴散與沉降速度不同，基于懸浮原理和光聚合反應(yīng)形成納米顆粒在水凝膠中梯度分布。水凝膠上部分主要包含軟骨修復(fù)納米顆粒，水凝膠下部分主要包含軟骨下骨修復(fù)納米顆粒，混合時共溶界面通過擴散和光聚合反應(yīng)后不存在分界，與人體骨-軟骨在結(jié)構(gòu)和組成分上相似，從而形成具備結(jié)構(gòu)和組成連續(xù)梯度變化特征的功能梯度水凝膠。水凝膠制備中所述的光聚合反應(yīng)是在步驟A中通過引入甲基丙烯酸結(jié)構(gòu)在生物大分子側(cè)鏈上接枝碳碳雙鍵，從而可以實現(xiàn)光引發(fā)自由基聚合成生物大分子水凝膠。
[0029]本發(fā)明的創(chuàng)新點在于:
[0030]1.本發(fā)明的用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法，基于懸浮原理和光聚合反應(yīng)，通過納米顆粒的沉降、擴散作用形成功能隨組成、結(jié)構(gòu)的變化而變化的功能梯度水凝膠。所述納米顆粒在水凝膠中梯度分布，水凝膠上部分主要包含軟骨修復(fù)納米顆粒，水凝膠下部分主要包含軟骨下骨修復(fù)納米顆粒，混合時共溶界面通過擴散和光聚合反應(yīng)后不存在分界，突破了雙層水凝膠結(jié)合力弱的問題，形成功能梯度水凝膠;又由于納米顆粒的增強作用，使得水凝膠具有良好的力學(xué)性能。
[0031]2.本發(fā)明的用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠可通過調(diào)節(jié)生物大分子水凝膠的組成成分，從而控制水凝膠的降解速率。通過水凝膠的降解，實現(xiàn)藥物逐步釋放;更進一步地，本發(fā)明采用蛋白納米顆粒包裹生長因子，有利于保護生長因子的活性且能夠控制其釋放速率，從而調(diào)控細胞分化與組織再生。
[0032]相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于:
[0033]1.本發(fā)明制備的水凝膠仿生模擬自然骨/軟骨結(jié)構(gòu)與功能，具有梯度結(jié)構(gòu)，上層添加包裹有轉(zhuǎn)化生長因子的納米顆粒，下層添加誘導(dǎo)成骨的鈣磷納米顆粒，形成納米復(fù)合增強水凝膠，提高力學(xué)性能，同時混合時共溶界面通過擴散和光聚合反應(yīng)后不存在分界，突破了雙層水凝膠結(jié)合力弱的問題，實現(xiàn)受損傷骨的一體化修復(fù)和雙向生長。
[0034]2.本發(fā)明制備的功能梯度水凝膠避免了傳統(tǒng)技術(shù)操作中將因子直接聚合到水凝膠中而使得因子失活以及因子突釋的問題;并可實現(xiàn)隨著水凝膠的降解實現(xiàn)因子的緩釋，有利于因子生物作用的表達。
[0035]3.本發(fā)明制備的功能梯度水凝膠主體成份具有良好的降解性與生物相容性，有利于細胞的粘附、富集，鈣磷顆?？烧T導(dǎo)成骨，生物活性因子能夠誘導(dǎo)細胞分化，從而有利于骨軟骨組織的再生和修復(fù)。
【附圖說明】
[0036]圖1為本發(fā)明功能梯度水凝膠的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實施方式】
[0037]以下結(jié)合說明書附圖對本發(fā)明制備出的功能梯度水凝膠作進一步闡述:如圖1所示為本發(fā)明功能梯度水凝膠的結(jié)構(gòu)示意圖，其中，混合液體在混合時鈣磷納米顆粒因其質(zhì)量較重主要位于水凝膠下部，負載軟骨修復(fù)因子的蛋白質(zhì)納米顆粒主要位于水凝膠上部，兩種納米顆粒相互擴散，含有質(zhì)量較大的顆粒的液體(稱為重液)受到向上的擴散力和地心引力使其不能無限制向上擴散，同時，含有質(zhì)量較小的顆粒的液體(稱為輕液)受到地心引力和重液的托浮作用使其不能無限制向下擴散，同時生物大分子溶液進行光聚合反應(yīng)，故形成納米顆粒在水凝膠中呈梯度連續(xù)分布，水凝膠上部分主要包含軟骨修復(fù)納米顆粒，水凝膠下部分主要包含軟骨下骨修復(fù)納米顆粒，與人體骨界面組織在解剖結(jié)構(gòu)和組織成分相似。
[0038]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細的描述:
[0039]實施例1:
[0040]—種用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法，具體步驟如下:
[0041]步驟A:通過甲基丙烯酸酐化在明膠上引入雙鍵得到雙鍵化明膠，具體步驟如下:
[0042]Al:稱取明膠溶解于磷酸鹽緩沖液中，在水浴條件下配制成質(zhì)量分數(shù)為5%的溶液；
[0043]A2:以lml/min的速度將0.1倍質(zhì)量的甲基丙烯酸酐滴加在明膠溶液中，然后攪拌反應(yīng)3小時；
[0044]A3:向明膠與甲基丙烯酸酐的反應(yīng)液中加入磷酸鹽緩沖液稀釋以終止反應(yīng)；
[0045]A4:將步驟A3中稀釋后溶液置于截留分子量為12kDa的透析袋中，用去離子水透析后冷凍干燥得到雙鍵化明膠。
[0046]將所述雙鍵化明膠作為單體配制成兩份質(zhì)量分數(shù)為10%的水溶液I與水溶液Π，并在兩份水溶液中加入質(zhì)量占單體質(zhì)量百分比為0.2%的光引發(fā)劑1作3(:11^2959;
[0047]步驟B:將步驟A中所述水溶液I和將水溶液Π分別制備成上層軟骨修復(fù)預(yù)聚液和下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液;具體步驟如下:
[0048]B1:在水溶液I中加入包裹軟骨生長因子TGF-βΙ的蛋白納米顆粒，
[0049]B2:將水溶液Π分為兩份，其中一份加入碳酸鈣使其鈣離子濃度為0.lmol/L，另一份加入磷酸氫二銨使其磷酸根離子濃度為0.08mol/L,然后將含有磷酸鹽的預(yù)聚液滴入含有鈣鹽的預(yù)聚液中，快速攪拌制得含有鈣磷納米顆粒的下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液。
[0050]步驟C:將步驟B中上層軟骨修復(fù)預(yù)聚液緩慢加入下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液使其界面互溶，通過光聚合反應(yīng)形成功能梯度水凝膠。
[0051 ] 實施例2:
[0052]一種用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法，具體步驟如下:
[0053]步驟A:通過甲基丙烯酸酐化在明膠上引入雙鍵得到雙鍵化明膠，具體步驟如下:
[0054]Al:稱取明膠溶解于磷酸鹽緩沖液中，在水浴條件下配制成質(zhì)量分數(shù)為5%的溶液；
[0055]A2:以lml/min的速度將0.1倍質(zhì)量的甲基丙烯酸酐滴加在明膠溶液中，然后攪拌反應(yīng)3小時；
[0056]A3:向明膠與甲基丙烯酸酐的反應(yīng)液中加入磷酸鹽緩沖液稀釋以終止反應(yīng)；
[0057]A4:將步驟A3中稀釋后溶液置于截留分子量為14kDa的透析袋中，用去離子水透析后冷凍干燥得到雙鍵化明膠。
[0058]將所述雙鍵化明膠配制成兩份質(zhì)量分數(shù)為10%的水溶液I與水溶液Π，并在兩份水溶液中加入質(zhì)量占單體質(zhì)量百分比為0.2%的光引發(fā)劑1作3(:11^500;
[0059]步驟B:將步驟A中所述水溶液I和將水溶液Π分別制備成上層軟骨修復(fù)預(yù)聚液和下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液;具體步驟如下:
[0060]BI:在水溶液I中加入包裹軟骨生長因子TGF-02的蛋白納米顆粒，
[0061]Β2:將水溶液Π分為兩份，其中一份加入硝酸鈣使其鈣離子濃度為0.lmol/L，另一份加入磷酸氫二銨使其磷酸根離子濃度為0.05mol/L,然后將含有磷酸鹽的預(yù)聚液滴入含有鈣鹽的預(yù)聚液中，快速攪拌制得含有鈣磷納米顆粒的下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液。
[0062]步驟C:將步驟B中上層軟骨修復(fù)預(yù)聚液緩慢加入下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液使其界面互溶，通過光聚合反應(yīng)形成功能梯度水凝膠。
[0063]實施例3:
[0064]—種用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法，具體步驟如下:
[0065]步驟A:通過甲基丙烯酸酐化在明膠上引入雙鍵得到雙鍵化明膠，具體步驟如下:
[0066]Al:稱取明膠溶解于磷酸鹽緩沖液中，在水浴條件下配制成質(zhì)量分數(shù)為10%的溶液；
[0067]A2:以0.5ml/min的速度將0.1倍質(zhì)量的甲基丙烯酸酐滴加在明膠溶液中，然后攪拌反應(yīng)3小時；
[0068]A3:向明膠與甲基丙烯酸酐的反應(yīng)液中加入磷酸鹽緩沖液稀釋以終止反應(yīng)；
[0069]A4:將步驟A3中稀釋后溶液置于截留分子量為12kDa的透析袋中，用去離子水透析后冷凍干燥得到雙鍵化明膠。
[0070]將所述雙鍵化明膠作為單體配制成兩份質(zhì)量分數(shù)為10%的水溶液I與水溶液Π，并在兩份水溶液中加入質(zhì)量占單體質(zhì)量的百分比為0.2%的光引發(fā)劑1作3(:11^2959;
[0071 ]步驟B:將步驟A中所述水溶液I和將水溶液Π分別制備成上層軟骨修復(fù)預(yù)聚液和下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液;具體步驟如下:
[0072]BI:在水溶液I中加入包裹軟骨生長因子TGF-03的蛋白納米顆粒，
[0073]B2:將水溶液Π分為兩份，其中一份加入硝酸鈣使其鈣離子濃度為0.2mol/L，另一份加入磷酸二氫銨使其磷酸根離子濃度為0.lmol/L,然后將含有磷酸鹽的預(yù)聚液滴入含有鈣鹽的預(yù)聚液中，快速攪拌制得含有鈣磷納米顆粒的下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液。
[0074]步驟C:將步驟B中上層軟骨修復(fù)預(yù)聚液緩慢加入下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液使其界面互溶，通過光聚合反應(yīng)形成功能梯度水凝膠。
[0075]實施例4:
[0076]—種用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法，具體步驟如下:
[0077]步驟A:通過甲基丙烯酸酐化在海藻酸鈉上引入雙鍵得到雙鍵化海藻酸鈉，具體步驟如下:
[0078]Al:稱取海藻酸鈉溶解于磷酸鹽緩沖液中，在水浴條件下配制成質(zhì)量分數(shù)為1%的溶液，同時滴加相同摩爾數(shù)的N-羥基琥珀酰亞胺/1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(NHS/EDC);
[0079]A2:以1.5ml/min的速度將6倍質(zhì)量的甲基丙烯酸酐滴加在海藻酸鈉溶液中，然后攪拌反應(yīng)24小時；
[0080]A3:向明膠與甲基丙烯酸酐的反應(yīng)液中加入磷酸鹽緩沖液稀釋以終止反應(yīng)；
[0081]A4:將步驟A3中稀釋后溶液置于截留分子量為12kDa的透析袋中，用去離子水透析后冷凍干燥得到雙鍵化海藻酸鈉。
[0082]將所述雙鍵化海藻酸鈉作為單體配制成兩份質(zhì)量分數(shù)為20%的水溶液I與水溶液Π，并在兩份水溶液中加入質(zhì)量占單體質(zhì)量百分比為0.5%的光引發(fā)劑1作3(:11^2959;
[0083]步驟B:將步驟A中所述水溶液I和將水溶液Π分別制備成上層軟骨修復(fù)預(yù)聚液和下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液;具體步驟如下:
[0084]BI:在水溶液I中加入包裹軟骨生長因子TGF-02的蛋白納米顆粒，
[0085]B2:將水溶液Π分為兩份，其中一份加入硝酸鈣使其鈣離子濃度為0.lmol/L，另一份加入磷酸二氫銨使其磷酸根離子濃度為0.8mol/L,然后將含有磷酸鹽的預(yù)聚液滴入含有鈣鹽的預(yù)聚液中，快速攪拌制得含有鈣磷納米顆粒的下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液。
[0086]步驟C:將步驟B中上層軟骨修復(fù)預(yù)聚液緩慢加入下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液使其界面互溶，通過光聚合反應(yīng)形成功能梯度水凝膠。
[0087]實施例5:
[0088]—種用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法，具體步驟如下:
[0089]步驟A:通過甲基丙烯酸酐化在海藻酸鈉上引入雙鍵得到雙鍵化海藻酸鈉，具體步驟如下:
[0090]Al:稱取海藻酸鈉溶解于磷酸鹽緩沖液中，在水浴條件下配制成質(zhì)量分數(shù)為1%的溶液，同時滴加相同摩爾數(shù)的N-羥基琥珀酰亞胺/1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(NHS/EDC);
[0091 ] A2:以1.5ml/min的速度將7倍質(zhì)量的甲基丙烯酸酐滴加在海藻酸鈉溶液中，然后攪拌反應(yīng)24小時；
[0092]A3:向明膠與甲基丙烯酸酐的反應(yīng)液中加入磷酸鹽緩沖液稀釋以終止反應(yīng)；
[0093]A4:將步驟A3中稀釋后溶液置于截留分子量為12kDa的透析袋中，用去離子水透析后冷凍干燥得到雙鍵化海藻酸鈉。
[0094]將所述雙鍵化海藻酸鈉作為單體配制成兩份質(zhì)量分數(shù)為10%的水溶液I與水溶液Π，并在兩份水溶液中加入質(zhì)量占單體質(zhì)量百分比為0.2%的光引發(fā)劑1作3(311^2959;
[0095]步驟B:將步驟A中所述水溶液I和將水溶液Π分別制備成上層軟骨修復(fù)預(yù)聚液和下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液;具體步驟如下:
[0096]B1:在水溶液I中加入包裹軟骨生長因子TGF-βΙ的蛋白納米顆粒，
[0097]B2:將水溶液Π分為兩份，其中一份加入硝酸鈣使其鈣離子濃度為0.4mol/L，另一份加入磷酸二氫銨使其磷酸根離子濃度為0.32mol/L,然后將含有磷酸鹽的預(yù)聚液滴入含有鈣鹽的預(yù)聚液中，快速攪拌制得含有鈣磷納米顆粒的下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液。
[0098]步驟C:將步驟B中上層軟骨修復(fù)預(yù)聚液緩慢加入下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液使其界面互溶，通過光聚合反應(yīng)形成功能梯度水凝膠。
[0099]實施例6:
[0100]—種用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法，具體步驟如下:
[0101]步驟A:通過甲基丙烯酸酐化在殼聚糖上引入雙鍵得到雙鍵化殼聚糖，具體步驟如下:
[0102]Al:稱取殼聚糖溶解于磷酸鹽緩沖液中，在水浴條件下配制成質(zhì)量分數(shù)為1%的溶液；
[0103]A2:以0.5ml/min的速度將10倍質(zhì)量的甲基丙烯酸酐滴加在殼聚糖溶液中，然后攪拌反應(yīng)8小時；
[0104]A3:向明膠與甲基丙烯酸酐的反應(yīng)液中加入磷酸鹽緩沖液稀釋以終止反應(yīng)；
[0105]A4:將步驟A3中稀釋后溶液置于截留分子量為13kDa的透析袋中，用去離子水透析后冷凍干燥得到雙鍵化殼聚糖。
[0106]將所述雙鍵化殼聚糖作為單體配制成兩份質(zhì)量分數(shù)為20%的水溶液I與水溶液Π，并在兩份水溶液中加入質(zhì)量占單體質(zhì)量百分比為0.5%的光引發(fā)劑1作3(311^500;
[0107]步驟B:將步驟A中所述水溶液I和將水溶液Π分別制備成上層軟骨修復(fù)預(yù)聚液和下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液;具體步驟如下:
[0108]B1:在水溶液I中加入包裹軟骨生長因子TGF-03的蛋白納米顆粒，
[0109]B2:將水溶液Π分為兩份，其中一份加入硝酸鈣使其鈣離子濃度為0.2mol/L，另一份加入磷酸二氫銨使其磷酸根離子濃度為0.15mol/L,然后將含有磷酸鹽的預(yù)聚液滴入含有鈣鹽的預(yù)聚液中，快速攪拌制得含有鈣磷納米顆粒的下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液。
[0110]步驟C:將步驟B中上層軟骨修復(fù)預(yù)聚液緩慢加入下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液使其界面互溶，通過光聚合反應(yīng)形成功能梯度水凝膠。
[0111]實施例7:
[0112]—種用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法，具體步驟如下:
[0113]步驟A:通過甲基丙烯酸酐化在殼聚糖上引入雙鍵得到雙鍵化殼聚糖，具體步驟如下:
[0114]Al:稱取殼聚糖溶解于磷酸鹽緩沖液中，在水浴條件下配制成質(zhì)量分數(shù)為1%的溶液；
[0115]A2:以0.5ml/min的速度將10倍質(zhì)量的甲基丙烯酸酐滴加在殼聚糖溶液中，然后攪拌反應(yīng)8小時；
[0116]A3:向明膠與甲基丙烯酸酐的反應(yīng)液中加入磷酸鹽緩沖液稀釋以終止反應(yīng)；
[0117]A4:將步驟A3中稀釋后溶液置于截留分子量為14kDa的透析袋中，用去離子水透析后冷凍干燥得到雙鍵化殼聚糖。
[0118]將所述雙鍵化殼聚糖作為單體配制成兩份質(zhì)量分數(shù)為10%的水溶液I與水溶液Π，并在兩份水溶液中加入質(zhì)量占單體質(zhì)量百分比為0.2%的光引發(fā)劑1作3(311^500;
[0119]步驟B:將步驟A中所述水溶液I和將水溶液Π分別制備成上層軟骨修復(fù)預(yù)聚液和下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液;具體步驟如下:
[0120]BI:在水溶液I中加入包裹軟骨生長因子IGF的蛋白納米顆粒；
[0121]B2:將水溶液Π分為兩份，其中一份加入硝酸鈣使其鈣離子濃度為0.5mol/L，另一份加入磷酸氫二銨使其磷酸根離子濃度為0.3mol/L,然后將含有磷酸鹽的預(yù)聚液滴入含有鈣鹽的預(yù)聚液中，快速攪拌制得含有鈣磷納米顆粒的下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液。
[0122]步驟C:將步驟B中上層軟骨修復(fù)預(yù)聚液緩慢加入下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液使其界面互溶，通過光聚合反應(yīng)形成功能梯度水凝膠。
[0123]上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【主權(quán)項】
1.一種用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: A:通過甲基丙烯酸酐化在生物大分子上引入雙鍵得到雙鍵化生物大分子，將所述雙鍵化生物大分子作為單體配制成兩份質(zhì)量分數(shù)相同的水溶液I與水溶液Π，并在兩份水溶液中加入等量的光引發(fā)劑； B:將步驟A中所述水溶液I和將水溶液Π分別制備成上層軟骨修復(fù)預(yù)聚液和下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液，所述上層軟骨修復(fù)預(yù)聚液含有負載軟骨生長因子的蛋白納米顆粒，所述下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液含有鈣磷納米顆粒； C:將步驟B中上層軟骨修復(fù)預(yù)聚液緩慢加入下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液使其界面互溶，通過光聚合反應(yīng)形成功能梯度水凝膠。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法，其特征在于，所述步驟A中雙鍵化生物大分子的制備步驟具體為: Al:稱取生物大分子溶解于磷酸鹽緩沖液中，在水浴條件下配制成溶液； A2:以0.5?3ml/min的速度將甲基丙烯酸酐滴加在生物大分子溶液中，然后攪拌反應(yīng)2?24小時; A3:向生物大分子與甲基丙烯酸酐的反應(yīng)液中加入磷酸鹽緩沖液稀釋以終止反應(yīng)； A4:將步驟A3中稀釋后溶液置于截留分子量為12?14kDa的透析袋中，用去離子水透析后冷凍干燥得到雙鍵化生物大分子。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法，其特征在于，所述步驟B中上層軟骨修復(fù)預(yù)聚液的制備具體為:在水溶液I中加入包裹軟骨生長因子的蛋白納米顆粒，混合均勻形成上層軟骨修復(fù)預(yù)聚液。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法，其特征在于，所述步驟B中下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液的制備具體為:將水溶液Π分為兩份，其中一份加入鈣鹽使其鈣離子濃度為0.05?1.5mol/L，另一份加入磷酸鹽使其磷酸根離子濃度為0.05?1.2mol/L，然后將含有磷酸鹽的預(yù)聚液滴入含有鈣鹽的預(yù)聚液中，快速攪拌制得含有鈣磷納米顆粒的下層軟骨下骨修復(fù)預(yù)聚液。5.根據(jù)權(quán)利要求1?4任一項所述的一種用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法，其特征在于，所述步驟A中的生物大分子為膠原、明膠、海藻酸鈉、硫酸軟骨素、殼聚糖和透明質(zhì)酸或絲素蛋白中任一種。6.根據(jù)權(quán)利要求1?4任一項所述的一種用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法，其特征在于，所述步驟A中水溶液I和水溶液Π的質(zhì)量分數(shù)均為5?20%。7.根據(jù)權(quán)利要求1?4任一項所述的一種用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法，其特征在于，所述步驟A中光引發(fā)劑為irgacure2959、irgacurel84、irgacurel27和irgacure500中任一種，其質(zhì)量占所述單體質(zhì)量的百分比為0.05?0.5%。8.根據(jù)權(quán)利要求1?4任一項所述的一種用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法，其特征在于，所述步驟B中負載軟骨生長因子的蛋白納米顆粒為牛血清蛋白納米顆粒、人血清蛋白納米顆?；蚵寻椎鞍准{米顆粒。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法，其特征在于，所述的步驟B中的軟骨生長因子是TGF-m、TGF-02、TGF-03或IGF。10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于骨-軟骨修復(fù)的功能梯度水凝膠的制備方法，其特征在于，所述步驟B中的鈣鹽為硝酸鈣、氟化鈣和碳酸鈣中任一種，所述磷酸鹽為磷酸氫二銨、磷酸二氫銨和磷酸氫二鈉中任一種。
【文檔編號】A61L27/16GK105999420SQ201610318278
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月16日
【發(fā)明人】魯雄, 王志雄, 韓璐, 胥杰龍
【申請人】西南交通大學(xué)