5-Aza-CdR在上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中RASSF1A基因表達(dá)的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR在上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中RASSF1A基因表達(dá)的應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】5-Aza-CdR在上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中RASSF1A基因表達(dá)的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物和藥物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及5-Aza-CdR在上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中RASSF1A基因表達(dá)的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]骨肉瘤在原發(fā)性惡性骨腫瘤中屬于最常見(jiàn)的一種類(lèi)型，多見(jiàn)于青少年和年輕成人，在兒童腫瘤中約占5%。盡管在早期診斷和綜合治療上獲得了很大進(jìn)步，但是骨肉瘤患者的五年生存率仍然只能達(dá)到60%左右。骨肉瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素和多階段的過(guò)程癌基因激活和抑癌基因失活共同導(dǎo)致了其表型的變化。近幾年來(lái)發(fā)現(xiàn)DNA甲基化狀態(tài)水平的改變成為腫瘤相關(guān)抑癌基因功能失活的一個(gè)重要分子機(jī)制。有學(xué)者在研究骨肉瘤細(xì)胞時(shí)通過(guò)對(duì)骨肉瘤組織細(xì)胞中RASSF1A的甲基化的狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤細(xì)胞中RASSF1A的啟動(dòng)子CpG島區(qū)域的CpG序列也處于高甲基化狀態(tài)。
[0003]腫瘤細(xì)胞的高甲基化狀態(tài)水平可以通過(guò)甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR的去甲基化作用逆轉(zhuǎn)，甲基化轉(zhuǎn)移酶的這種去甲基化效應(yīng)為腫瘤疾病的臨床治療帶來(lái)了新的希望和契機(jī)，部分研究發(fā)現(xiàn)在治療有些白血病危象和頑固性急性白血病時(shí)甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑的效果顯著，但是甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑的具體作用機(jī)制及其在骨肉瘤等疾病中的治療作用尚不清楚。在骨肉瘤細(xì)胞株MG63中，甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR對(duì)RASSF1A基因的表達(dá)水平以及對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響如何有待進(jìn)一步研究，未見(jiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞系MG63中抑癌基因RASSF1A的mRNA及蛋白表達(dá)的方法，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬采用如下技術(shù)方案:
[0005]本發(fā)明一方面涉及甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR在上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中RASSF1A基因表達(dá)的應(yīng)用。
[0006]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的骨肉瘤細(xì)胞系為骨肉瘤細(xì)胞系MG63。
[0007]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的骨肉瘤細(xì)胞系為離體骨肉瘤細(xì)胞系。
[0008]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR在同時(shí)增加抑癌基因RASSF1A的mRNA濃度中的應(yīng)用。
[0009]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的應(yīng)用是非診斷目的和非治療目的的。
【具體實(shí)施方式】
[0010]實(shí)施例1
[0011]I 材料
[0012]1.1細(xì)胞及抗體:
[0013]目的細(xì)胞MG-63(人成骨肉瘤細(xì)胞)由長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司提供。
[0014]RASSFla 抗體購(gòu)自 Abcam，貨號(hào) ab23950。[0015]2實(shí)驗(yàn)方法
[0016]2.15-Aza-CdR對(duì)MG63細(xì)胞生長(zhǎng)影響的研究:
[0017]取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞分16組，分別用不同劑量(0、5、10、50ymol/L)的5-Aza-CdR處理，分別處理(24h、48h、72h、96h)后，MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況。
[0018]2.25-Aza-CdR處理后RASSF1A的mRNA的表達(dá)變化情況:
[0019]收集細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞計(jì)數(shù)后將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，密度為5X105個(gè)/皿，分別予以(0、5、10、50ymol/L)的5-Aza-CdR處理，固定干預(yù)時(shí)間點(diǎn)72h，依此收集細(xì)胞，抽提樣品總RNA行逆轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA，cDNA為模板，分別擴(kuò)增RASSFla及GAPDH內(nèi)參片段，其中引物對(duì):
[0020]RAS-399-f:5，-AACGTGGACGAGCCTGTGGAGT-3，
[0021]RAS-399-r:5， -ACGCTCAGCGCGCTCAAAGA-3’
[0022]product:Length = 399bp, Ta = 58.7
[0023]GAPDH-452-f:5’ -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’
[0024]GAPDH-452-r:5’ -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’
[0025]product:Length = 452bp, Ta = 58
[0026]取PCR產(chǎn)物在I %瓊脂糖凝膠中電泳20min后，在凝膠成像分析系統(tǒng)下顯影照相存檔。通過(guò)使用影像分析儀對(duì)凝膠進(jìn)行照相并做灰度掃描分析，獲取每個(gè)樣品中PCR產(chǎn)物的灰度值，結(jié)果以與相對(duì)應(yīng)樣品GAPDH帶灰度值的比值表示。
[0027]2.35-Aza-CdR處理后RASSFla蛋白的表達(dá)變化情況:
[0028]取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞MG634組，分別用不同劑量(0、5、10、50 μ mol/L)的5-Aza-CdR處理72h后，提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，經(jīng)SDS-PAGE及免疫印跡及顯影檢測(cè)細(xì)胞系RASSFla蛋白的表達(dá)水平。采用影像分析儀對(duì)凝膠攝像并做圖片灰度掃描，對(duì)灰度掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲取每個(gè)樣品West-Blotting產(chǎn)物的灰度值，結(jié)果以對(duì)照組為0，做一個(gè)相對(duì)取值表示。3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0029]本實(shí)驗(yàn)中數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(又士 SD)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟
件，組間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)分析，當(dāng)P < 0.05時(shí)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。
[0030]3.1MTT檢測(cè)不同濃度5-Aza-CdR在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)MG63細(xì)胞株生長(zhǎng)增殖狀態(tài)的影響:
[0031]1.同一時(shí)間點(diǎn)隨著甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR處理濃度的增加，MG63細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)速度明顯下降，并且與空白對(duì)照組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)；
[0032]2.同一濃度甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR處理后不同時(shí)間點(diǎn)(24h、48h、72h、96h)，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著處理 時(shí)間的延長(zhǎng)，MG63細(xì)胞株的增殖生長(zhǎng)速度下降明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)
[0033]表1不同濃度甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR作用MG63細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的影響，用各組細(xì)胞的吸光度值(A)表示
【權(quán)利要求】
1.甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR在上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中RASSF1A基因表達(dá)的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，所述的骨肉瘤細(xì)胞為骨肉瘤細(xì)胞系MG63。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，所述的骨肉瘤細(xì)胞為離體骨肉瘤細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR在同時(shí)增加抑癌基因RASSFIA的mRNA濃度中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求 1-4所述的應(yīng)用，所述的應(yīng)用是非診斷目的和非治療目的的。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103989697SQ201410081347
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月7日
【發(fā)明者】臧曉方, 周勇, 熊軍, 肖智 申請(qǐng)人:臧曉方, 周勇