專利名稱：Dna修復(fù)蛋白rad51在制備治療骨肉瘤表達方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域，涉及臨床常見惡性骨腫瘤的治療方法，更具體的 說DNA是修復(fù)蛋白RAD51在治療骨肉瘤表達方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
骨肉瘤是一種起源于間葉組織的惡性腫瘤，是骨骼系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，好發(fā) 于青少年。對骨肉瘤的治療主要是手術(shù)聯(lián)合化療，然而化療耐藥的出現(xiàn)對對骨肉瘤治療提 出了嚴峻的挑戰(zhàn)；骨肉瘤對放療不敏感，放療一般僅可以用作輔助治療和姑息性治療；骨 肉瘤的放化療耐受，其主要原因可能是骨肉瘤細胞其DNA損傷修復(fù)功能增強。哺乳動物細胞針對DNA雙鏈斷裂有多種修復(fù)方式。其中最主要的是HR和NHEJ。 HR的正常進行需要有姐妹染色單體的存在，而催化斷裂的DNA雙鏈與完整的同源DNA姐妹 鏈進行鏈間轉(zhuǎn)移置換時，需要一種關(guān)鍵酶即RAD51蛋白。實驗表明當Rad51蛋白水平異常升高時，可嚴重干擾通過效應(yīng)性半胱天冬酶 Caspase-3所介導的細胞凋亡途徑，使腫瘤細胞在出現(xiàn)DNA損傷后，能夠在抗凋亡BCL-2家 族蛋白共同作用下避免細胞凋亡的產(chǎn)生。同時，Rad51的升高還可以不直接經(jīng)過同源重組 途徑，而通過其他方式干擾正常的細胞周期。腫瘤細胞內(nèi)Rad51蛋白水平的異常升高，可造 成腫瘤對放療及化療的抵抗，包括射線、順鉬、氮芥、苯丁酸氮芥、絲裂霉素C、羥基脲、吉西 他濱等。Rad51蛋白表達水平的失調(diào)也可促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，并影響腫瘤的治療效果和 患者的生存率。研究者發(fā)現(xiàn)，RAD51的在腫瘤中的表達顯著高于正常細胞質(zhì)，提示靶向作用 于該修復(fù)蛋白可作用增強放射敏感性的一個潛在的靶點。目前對于Rad51在骨肉瘤細胞系中的表達及放化療敏感性的影響，國內(nèi)外的報道 還很少，因此如能對Rad51在骨肉瘤細胞增殖及放化療抵抗中的作用進行深入的探討，將 可能為骨肉瘤的治療及增強放化療敏感性提供一個新思路。RNAi是一種新的基因沉寂技術(shù)，它通過雙鏈RNA引起序列同源的mRNA的降解，降 低目標基因的表達，是一項理想阻斷特異基因表達技術(shù)，如將其應(yīng)用于腫瘤細胞DNA修復(fù) 途徑關(guān)鍵調(diào)控基因Rad51的阻斷，將收到比特異性阻斷劑更理想的腫瘤放射治療效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種DNA修復(fù)蛋白RAD51 pGCsi3. 0_shRAD51的干擾載體，其特征 在于分別將一對正義和反義的DNA寡核苷酸退火后連接哺乳動物表達載體pGCsi-U6/ne0/ GFP上，得到真核細胞RNA干擾質(zhì)粒，見圖1。本發(fā)明根據(jù)GenBank中的RAD51 cDNA設(shè)計了靶序列，分別將一對正義和反義的 DNA寡核苷酸退火后連接哺乳動物表達載體pGCsi3.0上，得到真核細胞RNA干擾質(zhì)粒，見圖 1，其有效靶序列shRNA-2，見NOl。本發(fā)明進一步公開了 DNA修復(fù)蛋白RAD51在制備抑制骨肉瘤增殖及增強放、化療 敏感性表達方面的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的放、化療敏感性藥物包括射線、順鉬、氮芥、苯丁酸氮芥、阿霉素、絲 裂霉素C、羥基脲或吉西他濱等，典型的優(yōu)選射線、順鉬、阿霉素。本發(fā)明所述的應(yīng)用，包括DNA修復(fù)蛋白RAD51在制備抑制骨肉瘤增殖表達方面的 應(yīng)用，以及DNA修復(fù)蛋白RAD51在制備治療骨肉瘤放化療耐受力方面的應(yīng)用。本發(fā)明經(jīng)過大量的藥理學實驗證明(1)免疫組織化學法分析骨肉瘤組織及癌旁 標本，發(fā)現(xiàn)RAD51蛋白在骨肉瘤組織中呈高表達，且表達水平同臨床分期及病理分型無關(guān)。 (2)western blotting和RT_PCR法檢測骨肉瘤細胞系和人胚皮膚成纖維細胞系中RAD51 蛋白表達，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞系中RAD51也呈高表達。(3)western blotting和RT_PCR法檢 測、射線和順鉬、阿霉素對RAD51表達的影響，結(jié)果提示RAD51的表達同、射線及化療 藥物間有時間和劑量依賴關(guān)系。(4)檢測不同RAD51表達水平的骨肉瘤細胞系的射線及化 療藥物敏感性，發(fā)現(xiàn)RAD51表達水平同γ射線和藥物敏感性均呈負相關(guān)。( 成功構(gòu)建 pGCshRNA-RAD51干擾載體，并挑選出有效的靶序列。(6)經(jīng)蛋白和RNA水平鑒定，成功建立 了穩(wěn)定的RAD51基因沉默的骨肉瘤細胞系(7)RAD51基因沉默抑制體外骨肉瘤細胞增殖， 在體內(nèi)抑制裸鼠移植瘤的生長。(8)RAD51基因沉默提高γ射線和順鉬、阿霉素的敏感性。 RAD51基因沉默促進γ射線和藥物誘導骨肉瘤細胞凋亡。


圖1為pGCsi3. 0-shRAD51真核細胞RNA干擾質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。圖2免疫組織化學檢測RAD51在骨肉瘤組織中的表達。其中A骨肉瘤組織(強陽 性)B骨肉瘤組織(陽性)C骨肉瘤組織(弱陽性)D癌旁組織(陰性)。圖3RAD51在骨肉瘤細胞系中的表達。其中A為western blotting結(jié)果B為RT-PCR結(jié)果。圖4 γ射線與RAD51表達的時間劑量依賴關(guān)系。其中A為8gy γ射線與RAD51蛋 白表達的時間依賴關(guān)系；B為RAD51蛋白與Y射線的劑量依賴關(guān)系。圖5阿霉素與RAD51表達的時間劑量依賴關(guān)系.其中A為阿霉素與RAD51蛋白表 達的時間依賴關(guān)系；B為RAD51蛋白與阿霉素的劑量依賴關(guān)系。圖6順鉬與RAD51表達的時間劑量依賴關(guān)系。其中A為順鉬與RAD51蛋白表達的 時間依賴關(guān)系；B為RAD51蛋白與順鉬的劑量依賴關(guān)系。圖7為熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(GFP)表達情況。圖8為RNA干擾抑制RAD51蛋白表達和RAD5 ImRNA水平。圖9shRNA沉默RAD51在體外抑制骨肉瘤細胞的生長。圖10RAD51基因沉默在體內(nèi)抑制裸鼠移植瘤生長。圖11RAD51對骨肉瘤射線敏感性影響。圖12RAD51對阿霉素和順鉬敏感性的影響。其中A為RAD51基因沉默提高骨肉瘤 對阿霉素敏感性；B為RAD51基因沉默提高骨肉瘤對順鉬敏感性；C為三種細胞系對阿霉素 敏感性變化；D為三種細胞系對順鉬敏感性變化。圖13為Armexin V-PITC/PI雙染法顯示RAD51基因沉默促進細胞凋亡；其中A射 線照射組B阿霉素作用組C順鉬作用組。圖14為DNA ladder顯示RAD51沉默促進細胞凋亡.其中1. HOS 2. control3.H0S-shA2。
具體實施例方式為了更充分的解釋本發(fā)明的實施，提供詳細的制備實施實例。這些實施實例僅僅 是解釋、而不是限制本發(fā)明的范圍。實施例1實驗材料1.菌種、質(zhì)粒及細胞株1. 1菌種大腸桿菌T0P10本實驗室保存(有市售)。1. 2質(zhì)粒pGCsi3. 0_shRAD51，真核細胞RNA干擾質(zhì)粒，委托上海吉凱有限公司構(gòu) 建。質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖見圖1。1. 3細胞株入骨肉瘤細胞系!105、8&08-2、]\^-63、化2OS。人胚皮膚成纖維細胞系CCC-eSf-l。均購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)所細胞中心2實 驗動物裸鼠品系Balb/c-Nu，4周齡，雌性，體重16_20g(中國醫(yī)學科學院放射所動物中心 提供并飼養(yǎng))3臨床標本骨肉瘤及癌旁組織均取自天津骨科醫(yī)院1992-2008年間病例，所有患者術(shù)前均未 經(jīng)放療及化療。患者年齡13-53歲。標本相關(guān)臨床資料如下
ρ ΒΠ
4主要試劑
4.1細胞培養(yǎng)用品(有市售)
細胞培養(yǎng)基McCoy，s 5a, MEM, 0 pti-MEM (GIBCO)
胎牛血清(Invitrogen)
胰蛋白酶Gnvitrogen)
4. 2酶類(有市售)
RNA 酶(Promega)
蛋白酶抑制劑=PMSF(Sigma)
TaKaRa Ex Taq HS DNA 聚合酶(TaKaRa)
AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)
4. 3分子量Marker
Wide Range DNA Ladder Maker北京鼎國生物技術(shù)有限公司產(chǎn)
Prestained Protein Molecular Weight Marker Fermentas
DNA marker朋遠生物技術(shù)有限公司
4. 4試劑盒
Takara RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0大連 TAKARA 公司產(chǎn)品
質(zhì)粒小量中提取試劑盒天根生化科技有限公司
質(zhì)粒無內(nèi)毒素大提試劑盒天根生化科技有限公司
PCR產(chǎn)物純化試劑盒北京賽百盛基因技術(shù)有限公司
凝膠回收試劑盒北京賽百盛基因技術(shù)有限公司
BCA蛋白濃度測定試劑盒子碧云天生物技術(shù)有限公司
DNA抽提試劑盒(離心柱式)碧云天生物技術(shù)有限公司
Annexin V—PITC kitBeckman
Enhanced Chemi luminescent Detection System boster
4．5主要分子生物學試劑
／riZOl(Invitrogen)
Lip。feCtamine2000，月旨質(zhì)體2000(Invitrogen)
PI(Sigma)
4．6抗體
抗體名稱公司產(chǎn)品號
兔抗人Rad5l單克隆抗體(H一92)SAN／A CRUZSC一8349
兔抗人p—actinBosterBA0410
HRP標記羊抗兔IgGBosterEKl002
4．7其它主要試劑及耗材
胰蛋白胨、酵母提取物OXID公司產(chǎn)品
瓊脂糖、DMSO、考馬斯亮藍R一250 Sigma公司產(chǎn)品
SDS、TriS，甘氨酸北京鼎國生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品
氨芐青霉素、DEPCGenview分裝
丙烯酰胺、N—N’甲叉雙丙烯酰胺、Genview分裝
過硫酸胺(AP)Genview分裝
TEMED北京鼎國生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品
溴酚藍Sigma
PVDF膜北京鼎國生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品
Whatman 3MM濾紙B i o—Rad
X光膠片KODAK
／ween 20AMERSCO
M／／Sigma
G418GIBCO
其他各種試劑甲醛、甲醇、無水乙醇、異丙醇、氯仿、氫氧化鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉、冰醋酸、甘油、顯影液、定影液均為國產(chǎn)分析純試劑。
5引物
5．1人RAD5l基因擴增引物
上游引物5 CGGGA／CC／GGGGCAAGCGAG／AGAG 3
下游引物5 CG／C／AGAAAG／CA／／CC／AAGGCACC 3
產(chǎn)物長度1456bp
5．2人GADPH基因擴增引物
上游引物5 CGGGGAAGC／／G／GA／CAA／GG 3
下游引物5 GGCAGTGATGGCATGGACTG 3產(chǎn)物長度5. 3 shRNA-Rad51shRNA-2 :aatgtacatggcctttccttcttcaagacggaaggaaaggccatgtacattshRNA-3 :aaggcggtcagagatcatacattcaagacgtgtatgatctctgaccgccttcontrol :ttctccgaacgtgtcacgt6主要試劑、緩沖液和凝膠5 X TBE 緩沖液雙蒸水700mlTris 54. Og硼酸27. 5g0. 5mol/L (pH)8. 0 的 EDTA 溶液 20ml調(diào)pH值至8. 3左右，用雙蒸水定容至1000ml，備用。常溫密封保存，工作液濃度為 0.5XTBE05 X Tris-甘氨酸緩沖液Tris 堿15. Ig甘氨酸(電泳級)94g10% SDS 溶液 50ml加雙蒸水定容至1000ml，備用。常溫密封保存，工作液濃度為IXTris-甘氨酸緩沖 液。SDS-PAGE凝膠染色液按體積比為甲醇乙酸水=5 4 1配制500ml三者的混合液，然后將1. 25g 考馬斯亮藍R-250溶入其中，采用Whatmanl號濾紙過濾，濾液避光、密封、常溫保存。此染 色液可回收重復(fù)利用。SDS-PAGE凝膠脫色液按體積比為甲醇乙酸水=3 1 6配制IOOOml三者的混合液即為脫色液。
常溫保存，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。氨芐青霉素溶液用雙蒸水配制終濃度為50mg/ml的氨芐青霉素溶液，0. 22um的濾膜過濾后分 裝，-20°C保存。使用時按試劑所需的濃度添加。瓊脂糖凝膠將0. 2g電泳級瓊脂糖溶于20ml雙蒸水中，將溶液加熱至沸騰，重復(fù)一次。待溶液 溫度降至45°C左右，加入所需的EB。然后將凝膠溶液緩緩的倒入凝膠槽中，室溫放置至完 全凝固。若不及時使用可保鮮膜封閉后4°C保存，備用。DEPC 水通風櫥內(nèi)用雙蒸水配制0. 1 %的DEPC水溶液，用力振搖，使脂性液滴完全分散，室 溫下靜置48小時，高壓滅菌20分鐘。根據(jù)需要小量分裝，分裝部分-20°C凍存?zhèn)溆?。剩?部分密封，室溫保存，備用。McCOYS 5A 培養(yǎng)基取一袋Gibco McCOYS 5A培養(yǎng)基(IL)，溶于800mL去離子水中，加碳酸氫鈉2g，充 分混勻完全溶解后，加去離子水至IOOOmLjSO. 22um濾膜過濾除菌。用前加胎牛血清至終濃度為10% (ν/ν)，加青鏈霉素雙抗至終濃度為100U/mL。不連續(xù)SDS-PAGE 膠10%分離膠(IOml)7jC4. Oml30%丙烯酰胺混合液 3.3ml1. 0mol/LTris(pH8. 8) 2.5ml10% SDS0. Iml10%過硫酸銨(新鮮配制)0.1mlTEMED0.004ml以上溶液按次序添加到小燒杯中，要求快速，待充分混勻后迅速加入到膠槽中，最 后在膠溶液中加入約Iml的雙蒸水進行水封，室溫下30分鐘即可凝固。5%濃縮膠(4ml)/K2.7ml30%丙烯酰胺混合液0.67ml1.0mol/LTris(pH6.8) 0.5ml10% SDS0.04ml10%過硫酸銨(新鮮配制)0.(MmlTEMED0.004ml分離膠凝固后，倒去膠上面的水，并用濾紙充分吸干，按照濃縮膠配制的程序配 制，凝膠溶液加入完畢后迅速插入梳子。室溫下45分鐘即可凝固，最后輕輕拔去梳子即可。 若制備的凝膠不及時使用，可置入4°C冰箱保存。PI 染液檸檬酸鈉 50mgNacl32. 4mgPI2. 5mgRNase0. 5mgTriton-100 0.25ml加水至50ml4°C避光保存7主要培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基(普通、抗性)
0150]胰蛋白胨IOg
0151]酵母提取物 5g
0152]NaClIOg
0153]_搖動培養(yǎng)基瓶直至固形物完全溶解，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0，定容至1000ml， 高壓滅菌15分鐘，4°C保存?zhèn)溆谩?抗性培養(yǎng)基配制在使用時在普通培養(yǎng)基中加入抗生素 至所需濃度混勻即可。)LB固體培養(yǎng)基(普通、抗性)
胰蛋白胨log
酵母提取物 5g
58]NaCllog
瓊脂15．og
一一
搖動培養(yǎng)基瓶直至圖形物完全溶解，用Na。H溶液調(diào)節(jié)pH至7．o，定容至lOOoml，高壓滅菌15分鐘，待培養(yǎng)基冷卻至45度左右即可倒板。(抗性平板的制備在倒平板之前加入抗生素至所需的濃度倒板即可。)
8主要儀器
PCR基因擴增儀Therm。
電泳儀裝置北京六一
凝膠成像系統(tǒng)Bi。一Rad
超淨工作臺蘇州淨化設(shè)備廠
落地式高速冷凍離心機 HitaChi
臺式高速冷凍離心機上海離心機研究所
常溫臺式離心機北京醫(yī)用離心機廠
超低溫冰箱Therm。
冰箱SANY。
恒溫搖床太倉實驗設(shè)備廠
水平脫色搖床北京鼎國生物技術(shù)有限公司
恒溫水浴箱北京醫(yī)用設(shè)備廠
紫外分光光度計Bi。一Rad
恒溫培養(yǎng)箱ESPEC
高壓滅菌器山東新華醫(yī)療器械廠
微量進樣器Eppend。rf
實施例2
實驗方法
一1骨肉瘤組織中Rad5l的表達免疫組織化學染色
l1組織切片的制備
26例骨肉瘤組織標本和癌旁組織標本經(jīng)4％多聚甲醛固定，常規(guī)脫水透明1浸蠟1石蠟包埋，切成厚度為4 u m的切片，烤片器60℃烘烤4小時，用于免疫組化染色(工mmun。hiSt。ChemiStry，工HC)。
21免疫組織化學方法
(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，步驟依次為二甲苯工和II各5min，lOO％乙醇工和II各lomin，95％乙醇工和II各lomin；
(2)蒸餾水沖洗2次，每次5min；
(3)微波抗原修復(fù)，以增強其免疫組化染色效果。切片置于含o．olM枸椽酸鹽緩沖液(PH6．o)的修復(fù)盒中，高火煮沸l(wèi)omin，取出室溫自然冷卻；
(4)蒸餾水沖洗3次，每次5min，在PBS中浸泡5min；
(5) 3%過氧化氫室溫孵育lOmin，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；(6)蒸餾水沖洗3次，每次5min ；(7)滴加封閉液200 μ 1，室溫孵育15min，傾去，勿洗；(8)滴加1 300稀釋的兔抗人Ku80—抗200μ 1，4°C孵育過夜；(9)棄一抗，PBS沖洗3次，每次3min ；(10)滴加生物素標記山羊抗兔IgG 二抗200 μ 1，室溫孵育15min ；(11)棄二抗，PBS 沖洗 3 次，每次:3min;(12)滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液200 μ 1，室溫孵育15min ；(13)棄之，PBS沖洗3次，每次3min ；(14) DAB顯色Imin ；取Iml雙蒸水，滴加一滴試劑A混合均勻，然后滴加一滴試劑 B再次混勻。現(xiàn)用現(xiàn)配，避光保存，應(yīng)在30min內(nèi)使用。(注意掌握染色時間)(15)著色后，浸入水中終止反應(yīng)，自來水充分沖洗；(16)蘇木精復(fù)染Imin ；(注意掌握染色時間)(17)自來水沖洗 IOmin ；(18)脫水依次為95%乙醇I和II各lOsec，100%乙醇I和II各lOsec，二甲苯 I和II各IOsec ；中性樹脂封片。3、免疫組織化學評分取一片用PBS代替一抗作陰性對照。參照參考文獻的判定標準，根據(jù)同樣物鏡下 陽性細胞數(shù)不同可以分為以下五個等級< 5%為0分；5-25%為1分；25-50%為2分； 50-75 %為3分；75-100 %為4分。依據(jù)染色強度進行半定量判定，分數(shù)標準是無色為0分； 淡黃色，即弱陽性為1分；棕黃色，即中等染色強度為2分；棕褐色，即強陽性為3分。免疫 反應(yīng)的得分為陽性細胞的百分率得分與免疫染色的強度得分的乘積，最終評分范圍為0-12 分。我們將最終評分彡8 (12定義為強表達，彡4 < 8為中等表達，彡0 < 4為弱 表達。4、統(tǒng)計學處理對于食管鱗癌和正常食管上皮組織之間KuSO表達情況的比較分析，采用配對t檢 驗，P<0. 05具有統(tǒng)計學意義。二、腫瘤細胞中的RAD51蛋白表達測定(western blotting)1、細胞總蛋白提取(1)取生長狀態(tài)良好的不同腫瘤細胞系(骨肉瘤細胞H0S、MG_63、saos-2和U_2 OS,人胚皮膚成纖維細胞ccc-esf-Ι)，棄去培養(yǎng)基，用冰冷的PBS清洗兩遍，常規(guī)消化收集 細胞，2000rpm 4°C 10分鐘離心收集細胞沉淀。(2)在細胞沉淀中加入 200 μ 1 蛋白裂解液(20Mm Tris (PH7. 5)、150Mm NaClU % TritonX-100、sodium pyrophosphate> β-glycerophosphate、EDTA、NaV04、leupeptin)裂 解細胞，冰上作用lOmin，每5Min劇烈震蕩一次。(3)4°C 12，OOOrpm，離心 5min。(4)取上清即為細胞總蛋白，分裝后于-20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?、蛋白定量按照BCA試劑盒說明書進行操作。
10
(1)根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B (50 1)配制適量 BCA工作液，充分混勻。(工作液室溫M小時內(nèi)穩(wěn)定)(2)完全溶解BSA蛋白標準品，取10 μ 1稀釋至100 μ 1，使終濃度為0. 5mg/ml。(3)將標準品按0，1,2,4,8,12，16, 20 μ 1加到96孔板中，加標準品稀釋液補足到 20 μ 1。(4)加10 μ 1樣品到96孔板中，另加10 μ 1標準品稀釋液。(5)各孔加入 200 μ 1 BCA 工作液，37°C放置 30min。(6)用酶標儀測定波長為570nm的吸光度值。根據(jù)標準曲線計算出蛋白濃度。
3、SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)蛋白電泳(1)制膠按蛋白分子量要求制備相應(yīng)濃度為10%的SDS-聚丙烯酰胺分離膠和 5%的濃縮膠，待濃縮膠凝固后，小心地拔出梳子，反復(fù)沖洗上樣孔，將凝膠玻璃固定于電泳 裝置上，加入電泳緩沖液，用彎頭注射器排除凝膠底部的氣泡，加樣孔用電泳緩沖液沖洗后 上樣。(2)上樣樣品預(yù)先用BCA試劑盒定量，取等量蛋白，加入上樣緩沖液，100°C煮沸 5min變性，4°C 12，OOOrpm離心lOmin。每孔上樣30yg總蛋白。同一板膠上加入預(yù)染蛋白 分子量marker電泳以確定待檢蛋白的分子量和轉(zhuǎn)膜效率。(3)電泳先以IlOV電壓電泳，當染料前沿到達分離膠與濃縮膠交界時，調(diào)電壓至 90V電泳，直至染料到達最下沿。(4)半干式電轉(zhuǎn)染裁剪濾紙和PVDF膜，使大小與凝膠完全相同。用甲醇浸泡PVDF 膜lmin，用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡6張3M濾紙，PVDF膜再用轉(zhuǎn)移緩沖液預(yù)平衡5min。從陽極到 陰極依次是海綿、3張濾紙、PVDF膜、凝膠、3張濾紙和海綿，以200MA恒流轉(zhuǎn)膜約1小時。(5)取出PVDF膜，室溫下用TBS洗膜5min，進行下一步程序。凝膠用考馬斯亮藍 染色，膜用麗春紅染色，以觀察轉(zhuǎn)膜效率。4、蛋白免疫印記(Western Blotting)(1)取轉(zhuǎn)膜完畢的PVDF膜，放入封閉液中(1 XTBST+5%脫脂奶粉)，4°C封閉過夜。(2)用TBST洗3次，每次5min。用封閉液1 1000稀釋一抗兔抗人Ku80，將PVDF 膜放入一抗中，4°C孵育過夜，并且搖床輕微振動。(3)用TBST洗3次，每次5min。用封閉液1 5000稀釋二抗羊抗兔辣根過氧化 物酶標記的IgG，室溫孵育1小時。 (4)用TBST洗3次，每次5min。將ECL Kit的A液和B液各一滴混均于Iml雙蒸 水中，將混合液滴在膜上，使之完全覆蓋PVDF膜。室溫作用lmin。(5)將膜上多余的液體用濾紙從邊緣吸走，不要碰到表面，用保鮮膜將其包裹。在 暗室曝光，顯影，定影。三、表達RAD51基因發(fā)夾干擾RNA載體的構(gòu)建(由上海吉凱基因有限公司完成)1寡核苷酸的設(shè)計為了實現(xiàn)特異基因的沉默，設(shè)計寡核苷酸來源于RAD51基因mRNA的一段長度為 19 21個堿基的獨特序列，形成一對特定的DNA Oligos0以下鏈均正義鏈shRNA-A2 5，AATGTACATGGCCTTTCCTTCTTCAAGACGGAAGGAAAGGCCATGTACATT3，shRNA-F6 :5， AATGTACATGGCCTTTCCTTCTTCAAGACGGAAGGAAAGGCCATGTACATT3,目的片段作用于RAD51編碼區(qū)的7觀-748位。2DNA Oligos 的退火(1)將DNA Oligos溶解在滅菌、無核酸酶的水中，終濃度為;3mg/ml。(2)退火反應(yīng)是將各1 μ 1的正向和反向DNA Oligos與48 μ 1的退火緩沖液混合。(3)將混合物在90°C溫育％iin，70°C溫育lOmin。慢慢冷卻退火的DNA Oligos至 10°C。3pGCsi3. O載體的線性化用Hind III和BamH I限制酶將1 μ 1的pGCsi載體線性化。注意不要同時進行 酶切，而應(yīng)該先用Hind III酶切60min，接著加BamH I繼續(xù)反應(yīng)2小時，然后加熱終止反應(yīng) (升高溫度至650C，加熱20min)。4線性化載體的純化將酶切后的線性化載體在1 %瓊脂糖凝膠上進行純化，切膠回收，調(diào)整質(zhì)粒濃度為 0.2-0. 5ng/ml。5退火模板與載體的連接將2 μ 1退火后的DNA Oligos加到"Γ4 DNA連接酶緩沖液中，接著再加1 μ IpGCsi 載體、5 μ 1無核酸酶的水、1 μ 1Τ4 DNA連接酶。室溫下孵育過夜。6轉(zhuǎn)化細菌擴增和純化將重組的pGCsi3. 0-shRad51載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)宿主細胞株(ToplO)。用連接有 錯拼堿基的發(fā)夾DNA Oligos的載體作為陰性對照來檢測轉(zhuǎn)化步驟的效率。細菌鋪于含有 氨芐青霉素的瓊脂糖平板，培養(yǎng)過夜，然后挑克隆，在含有青霉素的培養(yǎng)基里進行另一輪培 養(yǎng)。用質(zhì)粒提取試劑盒純化質(zhì)粒后，_20°C保存?zhèn)溆谩Ｋ?、細胞培養(yǎng)人骨肉瘤細胞株HOS，用含10%胎牛血清的McCOYS 5A培養(yǎng)液在37°C、5% CO2條 件下常規(guī)培養(yǎng)，每3天傳代一次。五、細胞轉(zhuǎn)染1、G418致死劑量的測定將細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)細胞至70 80%融合，在培養(yǎng)液中分別加入 50mg/mlG418，至終濃度為0、200、400、600和800μ g/ml，以14天內(nèi)細胞全部死亡的濃度為 最適G418篩選劑量。得到為800 μ g/ml。2、用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒入人骨肉瘤HOS細胞2. 1瞬時轉(zhuǎn)染(1)轉(zhuǎn)染前一天在M孔培養(yǎng)板中種植6X IO4細胞，轉(zhuǎn)染時細胞密度達到80 90%。(2)準備以下復(fù)合體A-將1 μ g質(zhì)粒DNA稀釋于50 μ 1無血清培養(yǎng)基中，輕輕混 勻；復(fù)合體B-取1μ 1 Lipofectamine 2000(用前混勻)稀釋于無血清培養(yǎng)基中，混勻。室 溫孵育15min (在30min內(nèi)將稀釋的脂質(zhì)體與稀釋的DNA混合)(3)將上面的復(fù)合物A和B混合，輕輕混勻，室溫孵育15min (復(fù)合體于室溫6小時 內(nèi)會保持穩(wěn)定)。(4)將混合后脂質(zhì)體-DNA復(fù)合體100 μ 1加入含無血清培養(yǎng)基的食管癌細胞中，上下左右輕輕混勻。將細胞放入孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。2. 2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和陽性克隆篩選質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞M小時后，加入G418 800 μ g/ml，每3天更換選擇培養(yǎng)基一次，培 養(yǎng)14天后，挑選單克隆，擴大培養(yǎng)，待細胞生長至40 %左右，消化轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶中，在G418 400 μ g/ml培養(yǎng)液中繼續(xù)擴增。六、RNA干擾效果的鑒定1 半定量 RT-PCR1. 1細胞總RNA的提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞、陰性對照轉(zhuǎn)染細胞和未轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，常規(guī)消化，離 心收集，計數(shù)，每小管約5 X 106個細胞，按TRIZOL Reagent總RNA分離試劑盒使用說明進 行，具體操作步驟如下(1)離心收集5X106細胞，加Iml TRIZOL提取液，顛倒混勻15sec，室溫放置 5min。(2)加0. 2ml氯仿，強烈振蕩15sec，室溫放置5min。(3)4°C，12，000rpm，離心15min，取上層水相，轉(zhuǎn)入新的1.5ml離心管中。(4)加入等體積異丙醇(約400-500 μ 1)，混勻，室溫放置IOmin。(5)4°C，12，OOOrpm，離心 IOmin0(6)棄去上清，加Iml 75%乙醇(用DEPC處理過的去離子水配制)，混勻。(7) 40C，7500rpm離心5min，棄去上清，空氣干燥5_10min (不能干透)。(8)加10 μ 1 DEPC處理水溶解RNA，_80°C冰箱貯存?zhèn)溆谩?. 2RNA濃度測定和純度的鑒定1. 3RT-PCR采用TAKARA公司生產(chǎn)的TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0來進行目的基因擴增， 嚴格按照說明書的操作方法進行，設(shè)定退火溫度為60°C。具體操作步驟如下反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)1.按下列組成配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液MgCl210 μ 110XRT Buffer5μ 1RNase Free dH2018. 75 μ 1dNTP Mixture (各 IOmM)5 μ 1RNase Inhibitor1. 25μ 1AMV Reverse Transcriptase 2. 5 μ 1Oligo dT-Adaptor2. 5 μ 1人總RNA5. 0 μ 1Total50 μ 1/Sample(將上述配好的反應(yīng)液用手指輕彈混勻后瞬間高速離心使反應(yīng)液匯聚至管底)2.按以下條件進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)42 "C 15min99 °C 5min
5 0C IOmin
反應(yīng)完畢后的產(chǎn)物即為cDNA，隨后分裝，標記，-20°C保存。
PCR反應(yīng)
1.按下列組成配制PCR反應(yīng)液
5XPCR Buffer10 μ 1
dH2028. 75 μ 1
TaKaRa Ex Taq HS0. 25 μ 1
F引物0. 5μ 1
R引物0. 5μ 1
cDNA10 μ 1
Total50 μ1/Sample
(將上述配好的反應(yīng)液用手指輕彈混勻后瞬間高速離心使反應(yīng)液匯聚至管底)
2.按以下設(shè)定好的程序進行反應(yīng)
94 0C 2minICycle
94 °C 30sec
57. 2°C 30sec30cycle
72 °C 1. 5min
反應(yīng)完畢后取一部分行瓊脂糖凝膠電泳進行分析，剩余部分分裝后凍存于-20°C。
瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物配制瓊脂糖凝膠電泳所需的緩沖液和凝膠。每個PCR反應(yīng)管上樣3 μ 1，同時按照 說明書操作對DNA Marker上樣。加入1 XTBE緩沖液，在恒壓40V條件下，電泳90min。電 泳完畢后，將膠置于紫外分析儀觀察目的條帶及DNA Marker遷移情況，拍照，對實驗結(jié)果進 行分析評價。2ffestern blotting2.1細胞總蛋白提取方法同前2. 2蛋白定量方法同前2. 3SDS-PAGE電泳 方法同前2. 4蛋白免疫印記 方法同前七、腫瘤細胞生物學行為的測定1、MTT法測定細胞生長曲線MTT 實驗方法(1)將對數(shù)生長期的RNA干擾細胞、陰性轉(zhuǎn)染細胞和未轉(zhuǎn)染細胞，用胰酶消化后， 用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基配成適合濃度的細胞懸液。(2)接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔2000個細胞，設(shè)5個平行孔。(3)經(jīng)37°C，5% C02條件下培養(yǎng)M小時。(4)分別在1、3、5和7天以MTT法檢測其570nm的OD值。(5)到指定時間，取出細胞，棄去上清液，用培養(yǎng)液洗兩遍。然后，每孔加入20 μ 1 含5mg/ml MTT，在37°C繼續(xù)培養(yǎng)4小時。
(6)小心棄去上清，并加入200 μ 1 DMSO溶解沉淀，用震蕩器震蕩lOmin，在酶標儀 上用波長570nm測定吸光度值(OD)。(7)以天數(shù)為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制生長曲線。2、平板克隆形成實驗

(1)取對數(shù)生長期的各組細胞，用胰酶常規(guī)消化制備成單細胞懸液，接種于6孔板 中，每皿400個細胞。每組設(shè)三個重復(fù)培養(yǎng)皿，置于37°C，5% C02孵箱中培養(yǎng)。當培養(yǎng)到 14天，可觀察到克隆形成。(2)固定取出細胞培養(yǎng)皿，棄去上清液，用PBS洗兩遍，加入新配制的固定液，即 甲醇冰醋酸(3 1)約5ml，鋪滿整個培養(yǎng)皿底面，固定5min。(3)染色棄去固定液，待稍干燥后加入5%結(jié)晶紫染色液，染色約lOmin，當克隆 著色足夠時用水沖洗去殘余的染色液，進行克隆計數(shù)。每團細胞數(shù)大于50個時作為一個克 隆。用下列公式求得克隆形成率?？寺⌒纬陕?％ )=集落數(shù)/接種細胞數(shù)X 100%八、裸鼠體內(nèi)成瘤性實驗1、取4周齡Balb/C雌或雄性裸鼠(按SPF級動物飼養(yǎng)于動物實驗中心)，隨機分 為對照組，陰性對照組和干擾組，每組5只。SPF級裸鼠由實驗員專門飼養(yǎng)。2、取對數(shù)生長期各組細胞，胰酶常規(guī)消化，調(diào)整細胞濃度為5X IO7個/ml，取 200 μ 1即IX IO7個細胞接種于每只裸鼠的右上肢背部皮下，觀察瘤細胞接種后的生長情 況，待6天后可見瘤塊，每隔4天用游標卡尺測量腫瘤的長徑(a)和短徑(b)，按公式V = aXb2/2計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。接種30天后，斷頸法處死裸鼠，取出瘤體、肺、 心、肝組織，肉眼觀察有無粘連和轉(zhuǎn)移灶，然后用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，每個瘤體制 作4 μ m厚的連續(xù)切片，免疫組化分析RAD51表達情況。九、腫瘤細胞放射敏感性測定(1)取對數(shù)生長期的各組細胞，消化細胞成單個，接種細胞于IOOmm培養(yǎng)皿中，每 皿3000個細胞，每組設(shè)三個平行皿。(2) 小時細胞貼壁后，進行137Cs射線照射，照射劑量為1，2，4和8Gy (0. 86y/ min)，同時未照射組為對照組。(3)將培養(yǎng)皿置于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天，有克隆形成。(4)固定和染色倒去上清培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，加入75%甲醇固定液，鋪滿培 養(yǎng)皿底面，固定5min。棄去固定液，待稍干燥后加入0.5%結(jié)晶紫(甲醇配制)染色5min， 在鏡下檢查染色程度，當克隆著色足夠時用水洗去殘余染液，以每團細胞數(shù)大于50個時作 為一個克隆計數(shù)，并拍照。(5)用下列公式求得克隆形成率。克隆形成率=(處理組克隆數(shù)/對照組克隆數(shù))X 100%十、腫瘤細胞存活率的測定(1)將對數(shù)生長期的各組細胞，用胰酶消化后，用新的培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞 濃度為lX106/ml。(2)將各組細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種200 μ 1，每組設(shè)5個平行孔。(3)經(jīng)37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。
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(4)加入不同濃度的MMC (0. 5，1，1. 5，2 μ g/ml)，作用48小時后用MTT法測定OD值。(5)腫瘤細胞生存率=(實驗組OD/對數(shù)組0D) X 100%i^一、細胞凋亡的測定UDNA ladder 法a.收集約100萬個細胞，離心沉淀，棄上清。加入200微升PBS，輕輕吹散或彈散 細胞，使細胞重懸于PBS中。b.加入4微升RNase A，Vortex混勻。室溫(15_25°C )放置2分鐘。c.加入20微升蛋白酶K，Vortex混勻。d.加入200微升樣品裂解液B，Vortex混勻。70°C孵育10分鐘。加入樣品裂解 液B后必須立即Vortex混勻。不可把蛋白酶K直接和樣品裂解液B混合。e.加入200微升無水乙醇，Vortex混勻。加入乙醇后必須充分混勻，否則會嚴重 影響抽提效果。加入乙醇后可能產(chǎn)生白色沉淀，屬正常現(xiàn)象，后續(xù)步驟中必須把白色沉淀和 溶液全部轉(zhuǎn)移到純化柱內(nèi)。f.把步驟e中的混合物加入到DNA純化柱內(nèi)。彡6000g (約彡8000rpm)離心1分 鐘。倒棄廢液收集管內(nèi)液體。進行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回 收廢液收集管。注意必須把沉淀全部轉(zhuǎn)移到DNA純化柱內(nèi)，否則會嚴重影響抽提效果！g.加入500微升洗滌液I，^ 6000g(約> 8000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集 管內(nèi)液體。進行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。h.加入600微升洗滌液II，> 18000g(約> 12000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收 集管內(nèi)液體。進行本步驟前需把純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。i.再彡18000g(約彡12000rpm)離心1分鐘，以去除殘留的乙醇。不可把步驟h 的離心時間延長而省略本步驟。倒棄廢液后再離心可以確保充分去除殘留的乙醇。j.將DNA純化柱置于一潔凈的1. 5ml離心管上，加入50-100微升洗脫液。室溫放 置1-3分鐘?！?2000rpm離心1分鐘。所得液體即為純化得到的總DNA。洗脫液需要直接 加至純化柱管內(nèi)柱面中央，使液體被純化柱吸收。k.取部分抽提得到的DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳分析。如果細胞發(fā)生凋亡，即可觀 察到典型的DNA ladder。電泳時一定要注意換用新鮮配制的電泳液，DNA凝膠也要用新鮮 配制的電泳液配制并新鮮配制后使用。電泳時為獲取最佳的電泳效果使ladder充分分開， 電泳速度宜適當慢一些，凝膠宜適當長一些，而加樣孔宜更加扁平一些。選取適當較薄的梳 齒，往往會獲得更好的ladder電泳效果。2. Annexin V-PITC/PI 雙染法1.細胞用不含EDTA的胰酶消化收集(注胰酶消化時間不易過長，否則容易引起 假陽性)；2.用PBS洗滌細胞二次QOOOrpm離心5min)收集5 X IO5細胞；3.加入 500 μ L 的 Binding Buffer 懸浮細胞；4.力口入 5yL Annexin V—FITC 混勻后，力口入 5 μ L Propidium Iodide,混勻；5.室溫、避光、反應(yīng)5 15min ；6.在Ihour內(nèi)，進行流式細胞儀的觀察和檢測
7.用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長Ex = 488nm ；發(fā)射波長Em = 530nm。Armexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道(FLl)檢測；PI紅色熒光通過PI通道(FL2或FL3)檢 測。實施例3實驗結(jié)果URAD51在骨肉瘤組織中的表達情況為了了解RAD51在骨肉瘤組織中的表達情況。本發(fā)明采用免疫組織化學的方法， 檢測了 RAD51在骨肉瘤及瘤旁正常組織中的表達。如圖2所示。RAD51蛋白在骨肉瘤組織 中表達明顯增強，胞核呈現(xiàn)強陽性著色，而在骨肉瘤癌旁組織中呈弱陽性或不表達。在沈 例食管癌標本中，有19例標本(73% )RAD51蛋白胞核呈強陽性著色，7例標本(27% )呈弱 陽性。因此在沈例骨肉瘤標本中RAD51蛋白高表達的陽性率為100%，;相比之下，在沈例 癌旁組織標本中，僅有1例(10% )顯示了中度染色，其余的(90% )為弱或陰性染色。統(tǒng) 計學分析發(fā)現(xiàn)RAD51蛋白在骨肉瘤組織中呈明顯的高度表達(P < 0. 05)。同時本發(fā)明人就RAD51表達情況同患者年齡、性別、骨肉瘤臨床分期及病理分型 間的相關(guān)性進行了分析。如表1所示RAD51高表達和低表達二組之間，性別、年齡、臨床分 期、和病理組織學類型間均無顯著性差異(P > 0. 05)。表1. RAD51的表達與骨肉瘤臨床及病理特征的關(guān)系
權(quán)利要求
1.一種DNA修復(fù)蛋白RAD51 pGCsi3. 0_shRAD51的干擾載體，其特征在于分別將一對 正義和反義的DNA寡核苷酸退火后連接哺乳動物表達載體pGCsi3. 0上，得到真核細胞RNA 干擾質(zhì)粒，見圖1。
2.權(quán)利要求1所述的DNA修復(fù)蛋白RAD51在制備抑制骨肉瘤增殖及增強放化療敏感性 表達方面的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中所述的放、化療敏感性藥物包括射線、順鉬、氮芥、苯 丁酸氮芥、阿霉素、絲裂霉素C、羥基脲或吉西他濱。
4.權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中的DNA修復(fù)蛋白RAD51在制備抑制骨肉瘤增殖表達方 面的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中的DNA修復(fù)蛋白RAD51在制備治療骨肉瘤放化療耐受 力方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種DNA修復(fù)蛋白RAD51的pGCsi3.0-shRAD51質(zhì)粒載體，具有干擾載體功能，同時也公開了RAD51在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，即DNA修復(fù)蛋白RAD51在制備治療骨肉瘤藥物中的應(yīng)用，它可能成為臨床診斷和治療骨肉瘤的一個潛在靶點，本發(fā)明通過研究實驗首次證實了同源重組修復(fù)途徑參與了骨肉瘤的放化療耐受，抑制修復(fù)蛋白RAD51的表達可提高骨肉瘤的敏感性，從而可為今后的治療提供理論基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/85GK102108369SQ20091024511
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月28日
發(fā)明者劉強, 吳紅英, 孟愛民, 張恒, 李德冠, 杜利清, 樊飛躍, 王小春, 王月英, 白劍強, 路璐 申請人:中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所