專利名稱：一種增強(qiáng)淋巴細(xì)胞靶向殺傷腫瘤的活性因子及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型生物活性因子(dsNKG2D-IL-15即雙可溶性NK細(xì)胞活化 性受體NKG2D與細(xì)胞因子IL-15)融合蛋白的構(gòu)建和制備基于利用腫瘤細(xì)胞自身結(jié) 合、富集、并反式遞呈該活性蛋白，不僅直接激活其局部微環(huán)境內(nèi)的NK或細(xì)胞毒性T細(xì) 胞(CTL)，并有望增強(qiáng)體內(nèi)的特異性免疫應(yīng)答，將可用于腫瘤的治療，屬于生物技術(shù)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
腫瘤細(xì)胞降低HLA I類分子及共刺激分子的表達(dá)，逃逸機(jī)體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的監(jiān) 視，卻激活了 NK細(xì)胞的活性。如果NK細(xì)胞表面活化性受體傳遞的活化性信號(hào)強(qiáng)于抑 制性受體傳遞的抑制性信號(hào)，NK細(xì)胞將被活化，分泌細(xì)胞因子及直接殺傷腫瘤細(xì)胞，被 譽(yù)為是機(jī)體抗腫瘤的第一道防線。另一方面，腫瘤逃逸NK細(xì)胞監(jiān)視功能的事實(shí)以及大 量實(shí)驗(yàn)依據(jù)證明，腫瘤組織內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)目及功能均低于正常組織。因此，如何在體 內(nèi)或體外促進(jìn)NK細(xì)胞增殖、并提高NK細(xì)胞的生物學(xué)活性，決定以NK細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫 瘤免疫治療的效果。NK細(xì)胞主要通過下面四條識(shí)別途徑而活化1)非己識(shí)別，表現(xiàn)為通過模式識(shí) 別受體識(shí)別一些病原相關(guān)的分子模式而被活化。2)應(yīng)激誘導(dǎo)的識(shí)別，即識(shí)別腫瘤細(xì)胞或 病毒感染細(xì)胞表面的應(yīng)激分子，如MICA或ULBP蛋白等，與活化性受體NKg2D結(jié)合而 激活NK細(xì)胞。3)缺失自我的識(shí)別，表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞或病毒感染的細(xì)胞丟失或下調(diào)了經(jīng) 典HLAI類分子的表達(dá)，引起抑制性信號(hào)減弱而使NK細(xì)胞活化。4)細(xì)胞因子介導(dǎo)的活 化，也是NK細(xì)胞活化的最有效刺激劑，例如DC細(xì)胞來源的IL-15是促進(jìn)NK細(xì)胞增殖、 活化及發(fā)揮細(xì)胞毒效應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子；IL-12是促進(jìn)NK細(xì)胞分泌IFN-Y最有效的細(xì) 胞因子；而IL-18可能促進(jìn)NK細(xì)胞向淋巴結(jié)或脾臟內(nèi)遷移，并與DC相互作用。IL-15被譽(yù)為是NK細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，也是NK細(xì)胞發(fā)育分化過程中的關(guān)鍵細(xì)胞 因子。IL-15與IL-2空間結(jié)構(gòu)相似，含有4個(gè)α螺旋，分子量14 15KD。IL-15除 其特異性α受體外，與IL-2共有β受體，與IL-2、IL_4、IL_7、IL_9和IL-21共有γ 受體。與IL-2相比，IL-15可有效延長(zhǎng)NK細(xì)胞生命周期，促進(jìn)記憶性CD8+T細(xì)胞在體 內(nèi)的長(zhǎng)期存活，維持免疫記憶。雖然IL-2已被FDA批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性腎癌和惡性黑色素瘤 的治療，但I(xiàn)L-2誘導(dǎo)腫瘤抗原限制性T細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)會(huì)降低其抗腫瘤效應(yīng)。另外IL-2 具有抑制記憶性T細(xì)胞存活、維持CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特點(diǎn)，提示用IL-15代替 IL-2用于腫瘤治療，將產(chǎn)生更好的效果。IL-15及IL-15Rci基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)證明IL_15主要被細(xì)胞反式遞呈而發(fā)揮效 應(yīng)，即IL-15被樹突狀細(xì)胞或其他基質(zhì)細(xì)胞分泌后，立即與這些細(xì)胞表面的受體α結(jié)合 (Ka = 10_")，再激活表達(dá)β與Y受體的鄰近細(xì)胞(如NK細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞)。而且 Lucas等制備可誘導(dǎo)性清除體內(nèi)CDllchlgh DC的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)或脾臟內(nèi)的DC細(xì) 胞反式遞呈IL-15，是引起NK細(xì)胞致敏(細(xì)胞漿內(nèi)儲(chǔ)備顆粒酶和干擾素)的必要因素。另外，Kobayashi等將IL-15Rα轉(zhuǎn)染小鼠高轉(zhuǎn)移性結(jié)腸腺癌細(xì)胞株MC38，移植普通小鼠 可抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，而移植IL-15基因敲除鼠，短時(shí)間內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移到肺組織導(dǎo)致小鼠死亡。 這些現(xiàn)象提示若建立腫瘤細(xì)胞反式遞呈IL-15的作用方式，NK細(xì)胞不僅高效擴(kuò)增與活 化，還具備靶向抗腫瘤的特點(diǎn)。若要腫瘤細(xì)胞反式遞呈IL-15，首要方法是給腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染IL-15Rci，但如何 讓體內(nèi)腫瘤細(xì)胞特異性攝取外源性的基因載體，目前的技術(shù)手段仍然困難。另一種較為 簡(jiǎn)便的策略是制備某種融合蛋白，既使其氨基端與腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，又在羧基端攜 帶IL-15分子，從而具備激活NK細(xì)胞的效應(yīng)。因此，選擇合適的在腫瘤細(xì)胞與IL-15之 間“搭橋”的分子非常關(guān)鍵，既可制備某一腫瘤抗原的單克隆抗體，也可以選取該抗原 分子的受體。MHC I 類相關(guān)分子 A (MHC class I chain-related antigen A, MICA)是機(jī)體受到
應(yīng)激反應(yīng)后表達(dá)在細(xì)胞表面的一種糖蛋白，在大多數(shù)上皮性腫瘤細(xì)胞和病毒感染的細(xì)胞 表面廣泛表達(dá)，而僅于正常腸道上皮組織中微量表達(dá)，成為腫瘤治療很好的候選靶點(diǎn)。 NKg2D為MICA分子的受體，屬于C-型凝集素家族成員，1個(gè)MICA分子可與兩個(gè)同源 性的NKg2D分子結(jié)合，二者之間的親和力相對(duì)較高(Kd為8X 10_7 4X 10_9M)。因此 體外制備的NKG2D分子在理論上具備體內(nèi)靶向識(shí)別腫瘤的活性。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種生物活性因子dsNKG2D-IL_15 的序列及其制備方法，該方法能在體外大量表達(dá)dsNKg2D-IL-15蛋白，并且表達(dá)的 dsNKg2D-IL-15蛋白在生理環(huán)境下穩(wěn)定而不降解。體內(nèi)應(yīng)用時(shí)，該活性因子可靶向結(jié)合 腫瘤細(xì)胞，并使腫瘤細(xì)胞反式遞呈IL-15而激活NK細(xì)胞。本發(fā)明的方案是取NKg2D胞外區(qū)基因序列，通過柔性片段連接另一段相同 NKg2D的胞外區(qū)序列，體外表達(dá)后可在空間構(gòu)象上形成二聚體。然后在其羧基端加上 IL-15,既靶向識(shí)別腫瘤細(xì)胞，又可以反式遞呈IL-15，達(dá)到刺激NK細(xì)胞活化和增殖的目 的。本發(fā)明所說的增強(qiáng)淋巴細(xì)胞靶向殺傷腫瘤的活性因子，是雙可溶性NK細(xì)胞活化 性受體NKG2D與細(xì)胞因子IL-15融合蛋白dsNKG2D-IL_15，它的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。本發(fā)明還公開了 dsNKG2D-IL-15的制備方法，其步驟如下l)dsNKg2D-IL_15表達(dá)載體的構(gòu)建以原核表達(dá)載體pQ31為骨架，利用PCR 分別擴(kuò)增兩個(gè)相同人NKG2D受體的胞外區(qū)片段SEQ IDNO : 2和SEQ IDNO : 3，將這兩 個(gè)片段先后插入PQ31載體，中間接上柔性片段；然后將IL-15的PCR擴(kuò)增片段SEQ ID NO 4插入pQ31載體，與上述兩個(gè)胞外區(qū)片段形成串聯(lián)，中間接上柔性片段，得到融合 蛋白表達(dá)載體；2)dsNKg2D-IL-15蛋白的表達(dá)和純化將上述融合蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入M15大 場(chǎng)桿菌菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，然后洗滌包涵體，變性條件下用Ni+-ITA樹脂純化，進(jìn) 一步復(fù)性后得到dsNKg2D-IL_15蛋白。本發(fā)明還通過正交實(shí)驗(yàn)摸索出適合該蛋白的特定復(fù)性條件包括所需的最佳離
4子濃度、緩沖體系和酸堿度，分別為pH7.5，Tris-Base 20mM, Nacl 2OmM，甘油10%。 大量復(fù)性后超濾濃縮，交換在PBS緩沖體系，置于4°C條件下一周，蛋白質(zhì)無明顯沉淀及 降解。得到的dsNKg2D-IL_15蛋白經(jīng)測(cè)序，其氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；其
中氨基酸殘基位置1-3為dsNKg2D-IL-15基因片段插入載體后在連接部位產(chǎn)生的無關(guān)序 列；氨基酸殘基4-142為第一個(gè)NKG2D胞外區(qū)的序列；165-303為第二個(gè)NKG2D胞外 區(qū)的序列；氨基酸殘基326-439為IL-15的序列；氨基酸殘基143-162、304-323為柔性 片段的序列；氨基酸殘基163-164、324-325為兩個(gè)片段連接時(shí)產(chǎn)生的無關(guān)序列。上述復(fù)性完全的dsNKg2D-IL_15重組蛋白，利用間接ELISA的方法分別鑒定 NKG2D和IL-15抗體結(jié)合該重組蛋白的能力；利用夾心ELISA和間接免疫熒光法鑒定該 融合蛋白結(jié)合MICA配體及超表達(dá)在K562細(xì)胞表面MICA分子的能力；最后鑒定該蛋 白刺激NK細(xì)胞活化、分泌IFN-Y及殺傷靶細(xì)胞的能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該體外制備的 dsNKg2D-IL_15重組蛋白，具有靶向識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面相應(yīng)配體及激活NK活化、增殖 及殺傷腫瘤細(xì)胞的活性。


圖l.dsNKg2D-IL_15融合基因片段的構(gòu)建策略圖。圖2.dsNKg2D-IL_15蛋白介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞反式遞呈IL-15激活NK細(xì)胞的模式圖。圖3.pQE31-dsNKG2D-IL_15 重組載體經(jīng) BamH I 和 Hind III 雙酶切后的 電泳圖(l.Marker，2.PQE31 -dsNKG2D-IL-15/B+H, 3.PQE3l-dsNKG2D-IL-l5, 4.PQE31 -dsNKG2D-IL-15, 5.PQE31 -dsNKG2D-IL-15/B+H)。圖4.利用DNAstar軟件分析插入序列和標(biāo)準(zhǔn)序列之間的比對(duì)情況。圖5.經(jīng)不同時(shí)間IPTG誘導(dǎo)后重組蛋白表達(dá)的電泳圖(1.未誘導(dǎo)，2.誘導(dǎo)后4h， 3.誘導(dǎo)后5h，4.誘導(dǎo)后6h)。圖6.重組蛋白純化過程中各步驟收集液體的PGAE電泳結(jié)果(1.包涵體，2.上樣 穿透，3.W1, 4.W2, 5.E1, 6.E2, 7.Marker)。圖7.重組蛋白質(zhì)在不同緩沖體系中的PAGE電泳圖(l.Marker，2 10.為表3條 件下dsNKg2D-IL-15電泳圖)。圖8.顯示重組蛋白經(jīng)超濾管交換緩沖液后的PAGE電泳圖(1.純化后蛋白，2.復(fù) 性第1天蛋白，3.復(fù)性第2天蛋白，4.復(fù)性第3天蛋白，5.超濾上液，6.超濾下液， 7.Marker)。圖9.NKG2D抗體鑒定重組蛋白的間接ELISA法檢測(cè)結(jié)果。圖10.IL-15抗體鑒定重組蛋白的間接ELISA法檢測(cè)結(jié)果。圖11.夾心ELISA法檢測(cè)重組蛋白與其配體MICA結(jié)合的結(jié)果。圖12.流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度重組蛋白分別與K562、K562-MICA細(xì)胞結(jié)合的結(jié)果。圖13.流式細(xì)胞儀檢測(cè)可溶性或固定型dsNKg2D-IL_15蛋白對(duì)NK細(xì)胞表達(dá) CD69影響的情況。圖14.流式細(xì)胞儀檢測(cè)可溶性dsNKg2D-IL_15蛋白對(duì)NK細(xì)胞毒活性和IFN- Y分泌影響的情況。
具體實(shí)施例方式l.dsNKg2D-IL-15基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建IlPCR擴(kuò)增的引物序列利用生物信息學(xué)的手段，分別設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物(見表 1)擴(kuò)增出 sNKG2D (a)、sNKG2D (b)及IL-15 的基因片段。在 sNKG2D (a)和 sNKG2D (b)
的下游引物序列上分別加上(Gly4Ser)4的反向互補(bǔ)序列(表中方框內(nèi)顯示)，并考慮到密 碼子的兼并性原則，提高該蛋白的翻譯效率。圖1顯示dsNKg2D-IL-15融合基因片段的 構(gòu)建策略。表l.sNKG2D (a)、sNKG2D (b)及IL-15基因擴(kuò)增的引物序列
權(quán)利要求
1.一種增強(qiáng)淋巴細(xì)胞靶向殺傷腫瘤的活性因子，其特征在于，它的氨基酸序列如 SEQ ID NO 1 所示。
2.—種增強(qiáng)淋巴細(xì)胞靶向殺傷腫瘤的活性因子的制備方法，其特征在于，步驟如下1)表達(dá)載體的構(gòu)建以原核表達(dá)載體pQ31為骨架，利用PCR分別擴(kuò)增兩個(gè)相同 人NKG2D受體的胞外區(qū)片段SEQIDNO: 2禾Π SEQ ID NO 3，將這兩個(gè)片段先后插入 PQ31載體，中間接上柔性片段；然后將IL-15的PCR擴(kuò)增片段SEQ IDNO : 4插入pQ31 載體，與上述兩個(gè)胞外區(qū)片段形成串聯(lián)，中間接上柔性片段，得到融合蛋白表達(dá)載體；2)蛋白的表達(dá)及高效復(fù)性將步驟(1)得到的融合蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入M15大 場(chǎng)桿菌菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，然后洗滌包涵體，變性條件下用Ni+-ITA樹脂純化，進(jìn) 一步復(fù)性后得到dsNKg2D-IL_15蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)淋巴細(xì)胞靶向殺傷腫瘤的活性因子及其制備方法，所說的活性因子的氨基酸序列如SEQIDNO1所示。它通過以下方法制得利用PCR分別擴(kuò)增出SEQIDNO2-4的片段，將這三個(gè)片段串聯(lián)插入pQ31載體，各片段中間接上柔性片段；得到融合蛋白表達(dá)載體；再將融合蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入M15大場(chǎng)桿菌菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，然后洗滌包涵體，變性條件下用Ni+-ITA樹脂純化，進(jìn)一步復(fù)性后得到dsNKg2D-IL-15蛋白。本發(fā)明能在體外大量表達(dá)dsNKg2D-IL-15蛋白，并且表達(dá)的蛋白在生理環(huán)境下穩(wěn)定而不降解，具備使腫瘤細(xì)胞反式遞呈IL-15激活NK細(xì)胞的活性。
文檔編號(hào)C12N15/62GK102020717SQ201010533669
公開日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2010年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月5日
發(fā)明者季明春, 楊悌, 潘興元, 龔衛(wèi)娟 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)