專利名稱：一種重組人B細(xì)胞刺激因子(rhBLyS)表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)、及單克隆抗體制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達(dá)載體，特別是一種含有人B淋巴細(xì)胞刺激因子(hBlyS)基因的表達(dá)載體。本發(fā)明還涉及該表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)、及單克隆抗體制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
BLyS(B lymphocyte stimulator)是腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)家族的一個(gè)新成員，它含有285個(gè)氨基酸，是II型跨膜蛋白。BLyS主要由T淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞合成，其受體僅位于B淋巴細(xì)胞膜表面。
BLyS被不同的研究小組分別命名為THANK(TNF homologue that activatesapoptosis，nuclear factor κB，and c-jun NH2-terminal kinase)、TALL-1(TNF andapoptosis ligand-related leukocyte-expressed ligand 1)、zTNF4、TNFRSF19、BAFF(Bcell activating factor belonging to the TNF family)等。BLyS對(duì)保持生發(fā)中心B淋巴細(xì)胞的增生和延長(zhǎng)成熟B淋巴細(xì)胞的存活發(fā)揮重要作用。BLyS轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出外周血B淋巴細(xì)胞數(shù)量增加、B淋巴細(xì)胞存活時(shí)間延長(zhǎng)以及血漿IgM、IgG、IgA、IgE、IgD顯著增加等表現(xiàn)，5個(gè)月小鼠出現(xiàn)免疫復(fù)合物沉積在腎臟和蛋白尿現(xiàn)象。但是BLyS的過(guò)度表達(dá)可以導(dǎo)致自身免疫性疾病，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)，而用抗鼠的BLyS抗體可以阻斷BLyS分子與其受體的結(jié)合，減輕模型鼠SLE的癥狀。
采用抗hBLyS單克隆抗體研究BLyS與人類自身免疫性疾病的關(guān)系，以及探討阻斷BLyS與B淋巴細(xì)胞膜上受體結(jié)合從而達(dá)到抑制B淋巴細(xì)胞活化的目的等方面的研究越來(lái)越受到人們重視，并且將成為治療自身免疫性疾病新途徑研究的熱點(diǎn)。BLyS分子主要存在于激活的T淋巴細(xì)胞膜上，要想直接從人血細(xì)胞得到純化的抗原免疫動(dòng)物研制抗體十分困難。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種重組質(zhì)粒載體，該載體含有人B淋巴細(xì)胞刺激因子(hBlyS)基因。
本發(fā)明的另一目的在于上述載體表達(dá)的蛋白在制備抗hBLyS的單克隆抗體的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一目的在于上述單克隆抗體在制備治療B淋巴細(xì)胞惡性腫瘤以及自身免疫性疾病藥物和在制備人外周血細(xì)胞上BLyS表達(dá)以及血漿中BLyS濃度的檢測(cè)劑的應(yīng)用。
本發(fā)明構(gòu)建含全長(zhǎng)hBLyS基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌中表達(dá)谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)-hBLyS融合蛋白，并以此為基礎(chǔ)制備hBLyS單克隆抗體，為研究BLyS與自身免疫性疾病的關(guān)系及研發(fā)新的特異性抑制B淋巴細(xì)胞功能的免疫抑制劑創(chuàng)造條件本發(fā)明全長(zhǎng)hBLyS基因的獲得是分離健康人外周血淋巴細(xì)胞，提取總RNA，再根據(jù)全長(zhǎng)hBLyS基因序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，以提取的總RNA為模板，先逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，然后進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。
本發(fā)明采用的pGEX-4T-1為表達(dá)GST融合蛋白的原核高效表達(dá)載體，帶有強(qiáng)的tac啟動(dòng)子。構(gòu)建的質(zhì)粒中，pGEX-4T-1的多克隆酶切位點(diǎn)位于GST基因之后；采用分子克隆方法將全長(zhǎng)hBLyS目的基因插入后，接在GST基因下游；重組質(zhì)粒DNA序列測(cè)定結(jié)果證實(shí)了含有目的基因。將含有pGEX-4T-1/hBLyS質(zhì)粒載體的菌株放入含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)后，離心收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析。當(dāng)基因進(jìn)行表達(dá)時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物為GST和目的基因表達(dá)蛋白的融合體。目的基因預(yù)期表達(dá)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為32000，GST蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為26000，融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為58000(26000+32000)。本發(fā)明用此GST-hBLyS融合蛋白作為抗原，既增加了抗原的免疫原性，又方便篩選。采取兩種方法進(jìn)行下一步篩選陽(yáng)性克?、儆胔BLyS蛋白篩選將表達(dá)的GST-hBLyS融合蛋白通過(guò)谷胱甘肽-agarose柱進(jìn)行親和層析，再用凝血酶將其GST切除，從而獲得目的蛋白，選擇與目的蛋白反應(yīng)的特異性雜交瘤細(xì)胞株為陽(yáng)性細(xì)胞株；②用融合蛋白篩選選擇與GST-hBLyS融合蛋白反應(yīng)而與GST不反應(yīng)的特異性雜交瘤細(xì)胞株為陽(yáng)性細(xì)胞株；最后再用激活的人T淋巴細(xì)胞鑒定，即可得到特異性抗hBLyS蛋白的單克隆抗體。該單克隆抗體具有阻斷BLyS的作用，因此該單克隆抗體可以應(yīng)用于制備治療B淋巴細(xì)胞惡性腫瘤以及自身免疫性疾病藥物，以及應(yīng)用于制備人外周血細(xì)胞上BLyS表達(dá)以及血漿中BLyS濃度的檢測(cè)劑。


圖1為pGEX-4T-1/hBLyS重組質(zhì)粒中hBLyS的核苷酸和氨基酸序列；圖2為hBLyS cDNAPCR產(chǎn)物凝膠電泳；圖3為pGEX-4T-1/hBLyS重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖；圖4為重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/hBLyS的酶切鑒定；圖5為重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1/hBLyS部分序列測(cè)定結(jié)果；圖6為pGEX-4T-1/hBLyS表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析；圖7為抗體特異性的Western blot分析；圖8為單克隆抗體與人外周血淋細(xì)胞結(jié)合的FACS結(jié)果；圖9為單克隆抗體與CD3+和CD8+細(xì)胞結(jié)合的FACS。
圖2中PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果表明，所擴(kuò)增的目的基因片段與預(yù)期的一致，為876bp(含保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn))。
圖3中hBLyS基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切后，插入pGEX-4T-1的EcoR I和Sal I雙酶切窗口，得到含GST-hBLyS融合蛋白基因的重組質(zhì)粒。
圖4中用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，然后把大腸桿菌BL21鋪于含氨芐青霉素的LB平板，37℃過(guò)夜，次日觀察到pGEX-4T-1/hBLyS質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌較稀疏地均勻分布在平板上，分別取pGEX-4T-1/hBLyS和pGEX-4T-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行擴(kuò)增后，抽提質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切鑒定，經(jīng)1.0％的瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切后，成為兩個(gè)片段，分別為4.9kb的pGEX-4T-1和858bp的hBLyS基因片段，與理論值相符。
圖5中對(duì)閱讀框架分析，證明該重組質(zhì)粒已正向插入了目的基因，肯定了該重組表達(dá)質(zhì)粒能正確表達(dá)GST-hBLyS融合蛋白。
圖6中含重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/hBLyS的菌株和含質(zhì)粒pGEX-4T-1的菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，進(jìn)行10％SDS-PAGE分析，結(jié)果表明，分別在相對(duì)分子質(zhì)量約為58000(融合蛋白)和26000(GST蛋白)處有明顯的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶，而未經(jīng)誘導(dǎo)的pGEX-4T-1/hBLyS在58000處無(wú)條帶產(chǎn)生。說(shuō)明pGEX-4T-1/hBLyS在宿主菌BL21中表達(dá)了重組GST-hBLyS融合蛋白。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1、hBLyS cDNA的獲得分離健康人外周血淋巴細(xì)胞，加入植物凝集素(phytohamagglutinin，PHA)1μg/ml和佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)10ng/ml激活，37℃培養(yǎng)8h后，收集培養(yǎng)細(xì)胞，按異硫氫酸胍一步法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)定量。再根據(jù)全長(zhǎng)hBLyS基因序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，P15`GTCGAATTCATGGATGACTCCACAG3`，P25`CACGTCGACTCACAGCAGTTTCAATG3`，其中5`端引物含有EcoR I酶切位點(diǎn)和起始密碼，3`端引物含有Sal I酶切位點(diǎn)和終止密碼。以提取的總RNA為模板，先逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，然后進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件95℃變性60s，55℃退火60s，72℃延伸90s，循環(huán)35次。取PCR產(chǎn)物5ul在1.0％的瓊脂糖凝膠中電泳，用紫外分析儀檢測(cè)電泳結(jié)果。實(shí)施例2、pGEX-4T-1/hBLyS重組質(zhì)粒的構(gòu)建及大腸桿菌轉(zhuǎn)化hBLyS基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切后，插入pGEX-4T-1的EcoR I和Sal I雙酶切窗口，得到含GST-hBLyS融合蛋白基因的重組質(zhì)粒，構(gòu)建過(guò)程如圖2所示。用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，然后把大腸桿菌BL21鋪于含氨芐青霉素的LB平板，37℃過(guò)夜，次日觀察到pGEX-4T-1/hBLyS質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌較稀疏地均勻分布在平板上，分別取pGEX-4T-1/hBLyS和pGEX-4T-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行擴(kuò)增后，抽提質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切鑒定，經(jīng)1.0％的瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切后，成為兩個(gè)片段，分別為約4.9kb的pGEX-4T-1和約858bp的hBLyS基因片段，與理論值相符。經(jīng)DNA序列測(cè)定結(jié)果正確。實(shí)施例3、GST-hBLyS融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)分別將含有pGEX-4T-1/hBLyS質(zhì)粒和pGEX-4T-1空載體的菌株放入含氨芐青霉素的2×YTG培養(yǎng)基中37℃過(guò)夜搖菌培養(yǎng)，次日按1∶100稀釋培養(yǎng)過(guò)夜的菌液轉(zhuǎn)種，培養(yǎng)至菌液OD600＝0.4～0.6時(shí)，加入異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)至終濃度為0.2mmol/L，未加IPTG誘導(dǎo)的菌液作為對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，離心收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析。選擇陽(yáng)性菌株大量誘導(dǎo)和純化GST-hBLyS融合蛋白。
結(jié)果表明，相對(duì)分子質(zhì)量Mr＝58000(融合蛋白)處有明顯的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶；未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/hBLyS在Mr＝58000處無(wú)條帶顯示；空質(zhì)粒pGEX-4T-1經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在Mr＝26000(GST蛋白)處有明顯的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶(圖3)。說(shuō)明pGEX-4T-1/hBLyS在宿主菌BL21中表達(dá)了重組GST-hBLyS融合蛋白。
實(shí)施例4、抗人BLyS單克隆抗體的制備(1)免疫動(dòng)物將GST-hBLyS融合蛋白0.5mL(2g/L)作為抗原與等量的完全福氏佐劑混合乳化，取3只6～7周齡的雌性健康BALB/c小鼠同時(shí)用GST-hBLyS融合蛋白進(jìn)行免疫。細(xì)胞融合前第3天，用GST-hBLyS融合蛋白100μL進(jìn)行加強(qiáng)免疫。
(2)細(xì)胞融合 取SP2/0細(xì)胞和加強(qiáng)沖擊免疫后的鼠脾細(xì)胞懸液于50mL離心管中，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合后，加入含HAT的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，分配入鋪有飼養(yǎng)層細(xì)胞的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1mL，在5％CO2、37℃條件下培養(yǎng)。在融合后的第10天，檢測(cè)培養(yǎng)上清中的特異性抗體。
(3)陽(yáng)性克隆的篩選及克隆化 分別包被GST-hBLyS融合蛋白和GST蛋白作為抗原，然后加入雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清(含雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體)，用ELISA法篩選陽(yáng)性克隆。選擇與GST-hBLyS融合蛋白呈陽(yáng)性反應(yīng)，而與GST蛋白呈陰性反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞作為陽(yáng)性細(xì)胞克隆，然后采用顯微操作進(jìn)行連續(xù)3次亞克隆培養(yǎng)，直至達(dá)到單克隆化。
(4)抗體的特異性鑒定①ELISA按常規(guī)ELISA方法。②免疫印跡(Western blot)按常規(guī)免疫印跡方法。③流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)ACS)從人外周血分離單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)人IFN-γ激活3天后，實(shí)驗(yàn)組加單克隆后的雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，對(duì)照組加含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，4℃孵育1小時(shí)，用常規(guī)FACS方法測(cè)定所制備的抗體(FITC標(biāo)記)與淋巴細(xì)胞、CD3+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞的結(jié)合情況。④抗體效價(jià)測(cè)定包被GST-hBLyS融合蛋白做抗原，用ELISA測(cè)定培養(yǎng)上清和腹水的效價(jià)用0.01mol/L PBS倍比稀釋培養(yǎng)上清和腹水，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照孔(只加PBS)和陽(yáng)性對(duì)照孔(只加免疫鼠的血清)。所檢測(cè)的培養(yǎng)上清為單克隆化雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，所檢測(cè)的腹水為BALB/c鼠腹腔注射單克隆雜交瘤細(xì)胞后誘導(dǎo)生成的腹水。
(5)試驗(yàn)結(jié)果通過(guò)以下方法對(duì)抗hBLyS單克隆抗體的特異性舉行鑒定①ELISA雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)上清與GST-hBLyS融合蛋白反應(yīng)，與GST蛋白不反應(yīng)。說(shuō)明單克隆抗體是針對(duì)hBLyS蛋白的單克隆抗體。
②Western blot分別用GST-hBLyS融合蛋白和GST蛋白作抗原，經(jīng)Westernbolt鑒定，結(jié)果在相對(duì)分子質(zhì)量為58000處有一條抗原-抗體結(jié)合的條帶，而在Mr＝26000處無(wú)特異性條帶。進(jìn)一步證明雜交瘤細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體可以結(jié)合GST-hBLyS融合蛋白，但不與GST蛋白反應(yīng)，是特異性結(jié)合hBLyS的單克隆抗體。③用IFN-γ激活的人外周血單個(gè)核細(xì)胞作抗原，與雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清孵育1小時(shí)后，做FACS單標(biāo)的結(jié)果顯示，細(xì)胞株分泌的單抗能與激活的人外周血單個(gè)核細(xì)胞結(jié)合，結(jié)合率為6.7％(對(duì)照組為1.9％)。④用IFN-γ激活的人外周血單個(gè)核細(xì)胞作抗原，F(xiàn)ACS雙標(biāo)結(jié)果顯示，細(xì)胞株分泌的單抗能與激活的人外周血CD3+T細(xì)胞結(jié)合，并且大部分結(jié)合在CD3+CD8-T細(xì)胞上。說(shuō)明細(xì)胞株分泌的抗體是特異性針對(duì)T細(xì)胞表面hBLyS分子的細(xì)胞外段，可用于制備人外周血細(xì)胞上BLyS表達(dá)以及血漿中BLyS濃度的檢測(cè)劑，和制備治療B淋巴細(xì)胞惡性腫瘤以及自身免疫性疾病藥物。<110>張志方 張春艷<120>一種重組人B細(xì)胞刺激因子(rhBLyS)表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及單克隆抗體制備和應(yīng)用<130><140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>912<212>DNA<213>健康人外周血淋巴細(xì)胞<220><221>CDS<222>(1)..(912)<400>1tcc tcc aaa tcg gat ctg gtt ccg cgt gga tcc ccg gaa ttc atg gat 48Ser Ser Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Met Asp1 5 10 15gac tcc aca gaa agg gag cag tca cgc ctt act tct tgc ctt aag aaa 96Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gln Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu Lys Lys20 25 30aga gaa gaa atg aaa ctg aag gag tgt gtt tcc atc ctc cca cgg aag 144Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro Arg Lys35 40 45gaa agc ccc tct gtc cga tcc tcc aaa gac gga aag ctg ctg gct gca 192Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu Ala Ala50 55 60acc ttg ctg ctg gca ctg ctg tct tgc tgc ctc acg gtg gtg tct ttc 240Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Val Val Ser Phe65 70 75 80tac cag gtg gcc gcc ctg caa ggg gac ctg gcc agc ctc cgg gca gag 288Tyr Gln Val Ala Ala Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ala Glu85 90 95ctg cag ggc cac cac gcg gag aag ctg cca gca gga gca gga gcc ccc 336Leu Gln Gly His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly Ala Pro100 105 110aag gcc ggc ctg gag gaa gct cca gct gtc acc gcg gga ctg aaa atc 384Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu Lys Ile115 120 125ttt gaa cca cca gct cca gga gaa ggc aac tcc agt cag aac agc aga 432Phe Glu Pro Pro Ala Pro Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn Ser Arg130 135 140aat aag cgt gcc gtt cag ggt cca gaa gaa aca gtc act caa gac tgc 480Asn Lys Arg Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln Asp Cys145 150 155 160ttg caa ctg att gca gac agt gaa aca cca act ata caa aaa gga tct 528Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys Gly Ser165 170 175tac aca ttt gtt cca tgg ctt ctc agc ttt aaa ggg gga agt gcc cta 576Tyr Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Gly Gly Ser Ala Leu180 185 190gaa gaa aaa gag aat aaa ata ttg gtc aaa gaa act ggt tac ttt ttt 624Glu Glu Lys Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr Phe Phe195 200 205ata tat ggt cag gtt tta tat act gat aag acc tac gcc atg gga cat 672Ile Tyr Gly Gln Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met Gly His210 215 220cta att cag agg aag aag gtc cat gtc ttt ggg gat gaa ttg agt ctg 720Leu Ile Gln Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu Ser Leu225 230 235 240gtg att ttg ttt cga tgt att caa aat atg cct gaa aca ctg ccc aat 768Val Ile Leu Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu Pro Asn245 250 255aat tcc tgc tat tca gct ggc att gca aaa ctg gaa gaa gga gat gaa 816Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly Asp Glu260 265 270ctc caa ctt gca ata cca aga gga aat gca caa ata tca ctg gat gga 864Leu Gln Leu Ala Ile Pro Arg Gly Asn Ala Gln Ile Ser Leu Asp Gly275 280 285gat gtc aca ttt ttt ggt gca ttg aaa ctg ctg tga gtc gac tcg agc 912Asp Val Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu Val Asp Ser Ser290 295 300<210>2<211>299<212>PRT<213>健康人外周血淋巴細(xì)胞<400>2Ser Ser Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Met Asp1 5 10 15Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gln Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu Lys Lys20 25 30Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro Arg Lys35 40 45Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu Ala Ala50 55 60Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Val Val Ser Phe65 70 75 80Tyr Gln Val Ala Ala Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ala Glu85 90 95Leu Gln Gly His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly Ala Pro100 105 110Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu Lys Ile115 120 125Phe Glu Pro Pro Ala Pro Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn Ser Arg130 135 140Asn Lys Arg Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln Asp Cys145 150 155 160Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys Gly Ser165 170 175Tyr Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Gly Gly Ser Ala Leu180 185 190Glu Glu Lys Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr Phe Phe195 200 205Ile Tyr Gly Gln Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met Gly His
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1.一種重組質(zhì)粒載體，其特征是該載體含有人B淋巴細(xì)胞刺激因子(hBLyS)基因。
2.按照權(quán)利要求1所述的載體，其特征是該載體為大腸桿菌表達(dá)載體。
3.按照權(quán)利要求2所述的載體，其特征是該載體為pGEX-4T-1/hBLyS，它含有谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)基因片段。
4.按照權(quán)利要求3所述的載體，其特征是該載體轉(zhuǎn)化的是可以表達(dá)hBLyS基因的大腸桿菌。
5.按照權(quán)利要求4所述的載體，其特征是該載體表達(dá)的融合蛋白為GST-hBLyS融合蛋白。
6.權(quán)利要求5所述蛋白在制備抗hBLyS的單克隆抗體的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求6所述的單克隆抗體在制備治療B淋巴細(xì)胞惡性腫瘤以及自身免疫性疾病藥物的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求6所述的單克隆抗體在制備人外周血細(xì)胞上BLyS表達(dá)以及血漿中BLyS濃度的檢測(cè)劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組質(zhì)粒載體，該載體含有人B淋巴細(xì)胞刺激因子(hBlyS)基因。本發(fā)明還公開了上述該表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)、及單克隆抗體制備，該單克隆抗體可以應(yīng)用于制備治療B淋巴細(xì)胞惡性腫瘤以及自身免疫性疾病藥物，以及應(yīng)用于制備人外周血細(xì)胞上BLyS表達(dá)以及血漿中BLyS濃度的檢測(cè)劑。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1401776SQ02115188
公開日2003年3月12日 申請(qǐng)日期2002年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月9日
發(fā)明者張志方 申請(qǐng)人:張志方, 張春艷