專(zhuān)利名稱(chēng)：一種含有重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2滴眼液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2滴眼液及其制備方法，特別是一種適用于治療各種原因引起的角膜上皮損傷的重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2的滴眼液及其制備方法。

背景技術(shù)：
人眼角膜共分5層，最外面那層厚約50微米的非角化鱗狀上皮叫做角膜上皮。角膜上皮經(jīng)常暴露于惡劣的環(huán)境中，容易受到物理、化學(xué)、微生物、寄生蟲(chóng)、免疫等多種因素的損害，常導(dǎo)致角膜上皮愈合延遲或不愈，嚴(yán)重的可造成角膜潰瘍、穿孔等嚴(yán)重并發(fā)癥，臨床治療頗感棘手。此外，眼科手術(shù)和創(chuàng)傷后快速而完整的角膜上皮修復(fù)對(duì)維持正常視力也是必要的。目前，臨床上可供選用的促角膜上皮損傷的有效藥物并不多見(jiàn)，常用的藥物是進(jìn)口的小牛血清眼膏。國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上唯一基因工程藥物貝復(fù)舒(重組牛bFGF滴眼劑)的問(wèn)世，開(kāi)創(chuàng)了國(guó)內(nèi)治療角膜上皮損傷藥物的新紀(jì)元，主藥是重組牛bFGF，但是對(duì)于人的適應(yīng)性差并且對(duì)角膜新生血管有促進(jìn)作用。正常角膜無(wú)血管，這是維持角膜透明的重要因素，同時(shí)也是角膜能夠處于相對(duì)免疫赦免狀態(tài)的一個(gè)必要條件。但是在眼部感染性疾病、化學(xué)傷以及長(zhǎng)期配戴角膜接觸鏡的患者，角鞏膜緣部的血管會(huì)侵入角膜并向中央生長(zhǎng)，形成角膜新生血管。角膜新生血管的結(jié)構(gòu)往往比較脆弱，滲透性強(qiáng)，易發(fā)生出血和繼發(fā)纖維化，從而嚴(yán)重影響視力乃至失明。同時(shí)，角膜新生血管也破壞了角膜的免疫赦免狀態(tài)，使角膜移植術(shù)后免疫排斥的發(fā)生率明顯升高。
角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(KGF-2)是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族中第10個(gè)成員，是機(jī)體內(nèi)自身存在的多肽生長(zhǎng)因子，KGF-2為單拷貝基因，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，定位于15號(hào)染色體，是一條單鏈多肽，含有5個(gè)半胱氨酸殘基，其中4個(gè)半胱氨酸形成2對(duì)二硫鍵，另一個(gè)在折疊的肽中，為β2三葉草型。其編碼的蛋白由208個(gè)氨基酸殘基組成，N端有約40個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽序列，成熟蛋白為169個(gè)氨基酸(40～208氨基酸殘基)，理論分子質(zhì)量為19.3×103，相對(duì)分子質(zhì)量約為24×103。KGF-2不同于FGFs家族其他成員的最重要一點(diǎn)是KGF-2由成纖維細(xì)胞及其他間質(zhì)細(xì)胞分泌產(chǎn)生，對(duì)肝素具有很強(qiáng)的親和力，特異性作用于上皮細(xì)胞表面的酪氨酸激酶受體FGFR2IIIb(KGFR)和FGFR1IIIb。KGF-2與FGFR2IIIb的親和力很高，而與FGFR1IIIb的親和力很低，只有在高濃度KGF-2存在時(shí)才與FGFR1IIIb結(jié)合。KGF-2特異的促上皮細(xì)胞增殖作用主要通過(guò)FGFR2IIIb介導(dǎo)，而FGFR2IIIb僅在上皮細(xì)胞中表達(dá)。KGF-2與受體結(jié)合后，促使受體胞內(nèi)的C端酪氨酸殘基磷酸化，磷酸化的受體具有酪氨酸激酶活性，并與一系列的靶蛋白發(fā)生作用，引發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其生理作用主要承擔(dān)間質(zhì)細(xì)胞-上皮細(xì)胞之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，是體內(nèi)上皮細(xì)胞增殖的重要旁分泌介質(zhì)，有廣泛的生物學(xué)功能。目前證實(shí)，KGF-2不僅起著維持正常組織的結(jié)構(gòu)和功能，而且參與組織的損傷修復(fù)，對(duì)燒傷、潰瘍、切割傷的修復(fù)、再生比其他生長(zhǎng)因子具有更顯著的促進(jìn)愈合、減少瘢痕的作用。FGFs家族中各成員之間功能具有一定的交叉，其中KGF-2對(duì)上皮組織具有高度特異性，對(duì)比目前上市的生長(zhǎng)因子類(lèi)滴眼液具有修復(fù)角膜上皮細(xì)胞的同時(shí)并不促進(jìn)損傷引起的角膜新生血管的生長(zhǎng)。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，是公開(kāi)一種具有角膜修復(fù)并不促進(jìn)角膜新生血管生長(zhǎng)的滴眼液，特別是一種適用于治療各種原因引起的角膜上皮損傷的重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2的滴眼液。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是公開(kāi)上述滴眼液的制備方法。
本發(fā)明所研制的重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2滴眼液，主要由重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2和基質(zhì)兩部分組成。其中重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2是利用基因工程方法表達(dá)后純化得到的?；|(zhì)部分由一定比例的抗氧化劑、螯合劑、穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)解劑、表面活性劑組成和合適的緩沖體系組成。其中抗氧化劑的種類(lèi)以及各自的濃度分別為0.1％～5％甲硫氨酸；0.1％～5％組氨酸；螯合劑為0.01～1％EDTA；穩(wěn)定劑的種類(lèi)以及各自的濃度分別為0.5％～10％甘露醇；1％～10％甘油；0.1％～5％L-組氨酸鹽酸鹽；0.1％～5％PEG-300；表面活性劑的種類(lèi)以及各自的濃度為0.01％～0.5％泊洛沙姆188；0.001～0.5％吐溫80；滲透壓調(diào)解劑為0.1％～0.7％氯化鈉；合適的緩沖體系為5mM～100mM磷酸鹽緩沖液，緩沖體系的pH范圍是6.0～7.5。
本發(fā)明所述的重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2滴眼液的制備過(guò)程是將抗氧化劑、螯合劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑用處方量磷酸鹽緩沖液溶解，測(cè)定滲透壓，用滲透壓調(diào)節(jié)劑調(diào)解滲透壓，加入1μg/ml～1mg/ml人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2，除菌過(guò)濾，分裝。
蛋白質(zhì)類(lèi)滴眼液的研制，關(guān)鍵是解決這類(lèi)藥物的穩(wěn)定性問(wèn)題，在一定溶液條件下，KGF-2分子中Met、Cys、His、Trp及Tyr的某些基團(tuán)由于與各種活潑氧具有很高的反應(yīng)性易受到氧化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的活性下降，因此需要加入抗氧劑；本發(fā)明制備方法采用甲硫氨酸、組氨酸作為抗氧化劑，用量為0.1％～5％。KGF-2蛋白在一定溶液條件下，容易發(fā)生水不溶性聚集而沉淀，非離子型表面活性劑泊洛沙姆188、吐溫80能防止蛋白質(zhì)吸附于表面，而抑制其凝聚和沉淀，阻止其變性；高濃度的聚乙二醇類(lèi)常作為蛋白質(zhì)的低溫保護(hù)劑和沉淀結(jié)晶劑。本發(fā)明研究人員經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)，確定0.01％～0.5％泊洛沙姆188、0.01％～0.5％吐溫80、0.5％～2％PEG300，0.1％～5％賴(lài)氨酸的鹽酸鹽可抑制10mM磷酸鹽緩沖液KGF-2的聚集。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于提高了KGF-2液體制劑的穩(wěn)定性，可在常溫條件下放置，使應(yīng)用更為方便。
具體實(shí)施例 一、處方實(shí)施例 處方 KGF-2 100μg 甘油 2g 甲硫氨酸 0.2g 組氨酸鹽酸鹽 1g EDTA 0.2g 吐溫80 0.01g 氯化鈉 0.5g 50mM磷酸鹽緩沖液 加至100ml 制備 稱(chēng)取處方量甘油、甲硫氨酸、組氨酸鹽酸鹽、EDTA、吐溫80和氯化鈉溶于50mM磷酸鹽緩沖液60ml中，流通蒸汽滅菌(115℃，30分鐘)。冷卻后，在局部百級(jí)環(huán)境下加入處方量KGF-2，攪勻后加入50mM磷酸鹽緩沖液至約90ml，調(diào)節(jié)pH至7.0，補(bǔ)充50mM磷酸鹽緩沖液至100ml。0.22μm濾膜過(guò)濾，分裝即得。
穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按照《中國(guó)藥典》(2005年版)進(jìn)行穩(wěn)定性加速實(shí)驗(yàn)。溫度25℃±2℃，相對(duì)濕度60％RH±5％。在0個(gè)月、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月末取樣進(jìn)行外觀、澄明度、pH值和KGF-2含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)下表。
表1KGF-2加速穩(wěn)定性考察結(jié)果
由上表可見(jiàn)，KGF-2滴眼劑在考察期內(nèi)穩(wěn)定，預(yù)計(jì)可在常溫下避光存放N年。
在溫度4℃±2℃，相對(duì)濕度60％±10％條件下進(jìn)行長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)24個(gè)月。在0個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、12個(gè)月、18個(gè)月、24個(gè)月末取樣進(jìn)行外觀、色澤、pH值和KGF-2含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)下表。
表2KGF-2長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察結(jié)果

由上表可見(jiàn)，KGF-2滴眼劑在考察期內(nèi)穩(wěn)定。
二、藥理實(shí)施例 為了充分證明由重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2為原料制備的本發(fā)明滴眼液的藥理作用，本發(fā)明研究人員以重組人表皮生長(zhǎng)因子衍生物滴眼劑為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行了以下藥效學(xué)試驗(yàn)。
1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1.1健康新西蘭白兔130只，體重1.5～2.0kg，雌雄兼有。實(shí)驗(yàn)前用裂隙燈顯微鏡檢查眼前段無(wú)病變。
2.藥物 2.1受試藥物重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子滴眼液由吉林農(nóng)大生物反應(yīng)器工程有限公司提供。
2.2滴眼劑基質(zhì)由吉林農(nóng)大生物反應(yīng)器工程有限公司提供。
2.3陽(yáng)性對(duì)照藥采用重組人表皮生長(zhǎng)因子衍生物滴眼劑。
2.4其他試驗(yàn)用藥物均為市售品。
3.角膜堿燒傷模型的制作 動(dòng)物以20mg/kg戊巴比妥鈉靜脈麻醉，用1％丁卡因表面麻醉，開(kāi)瞼器開(kāi)眼，暴露角膜，取直徑為8mm的單層濾紙，浸入1mol/L的NaOH溶液中10秒，取出后除去多于NaOH，將其貼于角膜中央60秒，即用60ml生理鹽水沖洗眼表及結(jié)膜囊。
4.分組及治療方法 將130只新西蘭大白兔，分成5組，每組26只，其中3組為受試藥物角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子滴眼液高，中，低劑組，另外兩組分別為角膜損傷模型對(duì)照組及陽(yáng)性藥物對(duì)照組，為排除兔的個(gè)體差異對(duì)治療效果的影響，本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)抽取每只兔的左右眼為實(shí)驗(yàn)眼和空白對(duì)照眼。試驗(yàn)組眼滴角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子滴眼液每日3次，每次3滴。空白組滴平衡鹽溶液作對(duì)照。分組情況如下 ①角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子大劑量組 26 ②角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子中劑量組 26 ③角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子小劑量組 26 ④陽(yáng)性藥對(duì)照組 26 ⑤陰性對(duì)照組26 5觀察指標(biāo) 5.1活體觀察 分別于燒傷前及給藥后1、2、7、14d第一次滴眼前用裂隙燈顯微鏡觀察眼前段的大體情況。
5.2上皮愈合面積及愈合率 分別于堿燒傷后的0、1、3、5、7、9、14d對(duì)兔眼行熒光染色，用裂隙燈顯微鏡觀察角膜著色的情況。測(cè)定角膜表面熒光染色的面積。計(jì)算角膜上皮愈合面積和角膜上皮愈合率。用SAS軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均表為X±SD，差異顯著性定為P＜0.05。
角膜上皮愈合面積(mm2)＝給藥前熒光素著色面積-給藥后熒光素著色面積按角膜上皮愈合率＝(0d著色面積-觀察時(shí)著色面積)/0d著色面積×100％公式計(jì)算角膜上皮愈合率。
5.3角膜新生血管的影響 分別于堿燒傷后的7、11、14、21d用裂隙燈顯微鏡觀察測(cè)量、照相。以長(zhǎng)入新生血管的垂直長(zhǎng)度為準(zhǔn)。新生血管的形成面積按Robert電腦教學(xué)模型公式S＝C/12X3.14X[r2-(r-L)2]，其中C為圓周鐘點(diǎn)數(shù)，r為角膜半徑，L為新生血管的長(zhǎng)度。
6.實(shí)驗(yàn)結(jié)論 1)重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2滴眼液對(duì)堿燒傷兔角膜上皮愈合的影響 本研究建立的新西蘭大白兔角膜堿燒傷模型中，設(shè)計(jì)的角膜燒傷面積約為50mm2。燒傷后，燒傷區(qū)內(nèi)的角膜組織立即呈灰白色混濁，角膜上皮壞死脫落，周?chē)M織雖透明，但已有輕微水腫。經(jīng)熒光素染色和裂隙燈檢查可見(jiàn)，各試驗(yàn)組角膜原燒傷區(qū)的著色區(qū)面積均為47mm2左右，自給藥后角膜原燒傷區(qū)逐漸由外周向中央愈合，重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2組和重組人表皮生長(zhǎng)因子衍生物組至傷后第4天時(shí)均可見(jiàn)到原燒傷區(qū)角膜上皮完全愈合的兔眼，隨后隨著用藥天數(shù)的增加，完全愈合的眼數(shù)亦增加，到第14天時(shí)低、中、高劑量重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2滴眼劑組和陽(yáng)性對(duì)照組完全愈合的兔眼分別達(dá)到53％、78％、81％和72％，而陰性對(duì)照組在整個(gè)觀察期內(nèi)均未見(jiàn)到完全愈合的眼。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2滴眼液可減緩堿燒傷愈合過(guò)程中的角膜上皮細(xì)胞再脫落，三種劑量的重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2滴眼劑均可顯著促進(jìn)堿燒傷兔角膜上皮的愈合，治療效果與陽(yáng)性對(duì)照組沒(méi)有明顯差異。
2)病理組織形態(tài)學(xué)變化 正常兔角膜由上皮細(xì)胞層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層和內(nèi)皮細(xì)胞層組成，上皮細(xì)胞層由5-6層細(xì)胞組成，排列規(guī)則。角膜堿燒傷后，上皮層完全脫落，前彈力層模糊，角膜基質(zhì)暴露、水腫、增厚，凝固性壞死，內(nèi)皮細(xì)胞面見(jiàn)纖維素性滲出及少數(shù)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；至傷后第14天，重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子2滴眼液3種劑量治療組的角膜原燒傷區(qū)已被5-6層上皮細(xì)胞覆蓋，上皮細(xì)胞極向明顯，細(xì)胞間連接緊密，前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層和內(nèi)皮細(xì)胞層基本恢復(fù)正常；陽(yáng)性對(duì)照組表現(xiàn)出與實(shí)驗(yàn)組相似的促角膜上皮修復(fù)的作用；陰性對(duì)照組兔眼原燒傷區(qū)的角膜上皮細(xì)胞亦已有明顯的增殖再生，但新生上皮層表面細(xì)胞部分脫落，大部分基質(zhì)纖維變性和水腫。
3)重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2滴眼液對(duì)堿燒傷兔角膜上皮新生血管面積的影響
*p＜0.05，各組與一組比較。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，KGF-2滴眼液堿燒傷后的7、11、14、21d高、中、低劑量組與模型組比較新生血管面積沒(méi)有顯著差異，陽(yáng)性對(duì)照組堿燒傷后的7、11、14、21d高、中、低劑量組與模型組比較新生血管面積有顯著差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明KGF-2不促進(jìn)堿燒傷后兔角膜新生血管的生長(zhǎng)。
權(quán)利要求
1.一種重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(KGF-2)滴眼液，其特征在于，它由重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2，抗氧化劑、螯合劑、穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)解劑、表面活性劑和合適的緩沖體系組成。
2.權(quán)利要求1所述的滴眼液，其中重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2的濃度為1μg/ml～1mg/ml。
3.權(quán)利要求1所述的滴眼液，其中抗氧化劑的種類(lèi)以及各自的濃度分別為0.1％～5％甲硫氨酸、0.1％～5％組氨酸；螯合劑為0.01～1％EDTA；穩(wěn)定劑的種類(lèi)以及各自的濃度分別為0.5％～10％甘露醇、1％～10％甘油、0.1％～5％L-組氨酸鹽酸鹽、0.1％～5％PEG-300；表面活性劑的種類(lèi)以及各自的濃度為0.01％～0.5％泊洛沙姆188、0.001～0.5％吐溫80；滲透壓調(diào)解劑為0.1％～0.7％氯化鈉；合適的緩沖體系為5mM～100mM磷酸鹽緩沖液，緩沖體系的pH范圍是6.0～7.5。
4.一種重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(KGF-2)滴眼液的制備方法，其特征在于，將抗氧化劑、螯合劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑用處方量磷酸鹽緩沖液溶解，測(cè)定滲透壓，用滲透壓調(diào)節(jié)劑調(diào)解滲透壓，加入1μg/ml～1mg/ml人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2，除菌過(guò)濾，分裝。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種具有角膜上皮損傷修復(fù)作用的滴眼液，其特征在于，它由重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2與一定比例的抗氧化劑、螯合劑、穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)解劑、表面活性劑和合適的緩沖體系組成；本發(fā)明還公開(kāi)了上述滴眼液的制備方法。藥理實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的滴眼液能很好的促進(jìn)角膜上皮損傷的修復(fù)。
文檔編號(hào)A61P27/02GK101537172SQ20081003015
公開(kāi)日2009年9月23日 申請(qǐng)日期2008年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月14日
發(fā)明者李校堃, 王曉杰, 田海山, 王會(huì)巖, 馬吉?jiǎng)? 黃志鋒, 黃亞?wèn)|, 健 肖, 鑫 周, 朱佳男, 琪 項(xiàng) 申請(qǐng)人:溫州醫(yī)學(xué)院, 廣東暨大基因藥物工程研究中心有限公司, 吉林農(nóng)大生物反應(yīng)器工程有限公司