專利名稱：人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1在制備治療糖尿病足部及腿部潰瘍的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1的新用途，特別是在制備治療糖尿病足部
及腿部潰瘍的藥物中的應(yīng)用。具體地說是將人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1制備成既能保持生物活 性、又適合外部給藥的制劑，并用于治療糖尿病足部及腿部潰瘍。
背景技術(shù)：
糖尿病足部及腿部潰瘍是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，是一種慢性、進(jìn)行性神經(jīng) 血管病變，其主要原因是肢端缺血、神經(jīng)病變、感染等多種誘因綜合所致；其病理基礎(chǔ)是動 脈和小動脈粥樣硬化，導(dǎo)致脈管狹窄、阻塞，以致所支配的組織器官缺血缺氧而造成壞疽或 潰瘍經(jīng)久不愈。 隨著人們生活水平提高和生活方式的改變，人口老齡化，糖尿病的發(fā)病率亦呈上 升趨勢，成為繼心腦血管疾病，腫瘤之后的第三大慢性疾病。在我國，糖尿病發(fā)病率約5%， 并以每年大于O. 1%的速度增加，嚴(yán)重威脅人們的健康。而在糖尿病慢性并發(fā)癥中，糖尿 病足是最嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的并發(fā)癥之一。國內(nèi)報道糖尿病病人并發(fā)糖尿病足約占 0. 9 % 1. 7 % ，老年糖尿病病人并發(fā)糖尿病足約占2. 8 % 14. 5 % ，國外并發(fā)率更高，約占 5. 8% 6. 3%，是非糖尿病患者的20 30倍，其中50歲以上高達(dá)40倍；糖尿病患者截肢 的主要原因是糖尿病足并發(fā)足部及腿部潰瘍長期不愈合。 臨床上尚無能很好滿足需求的治療方案。市場上的藥物多為護(hù)理、防護(hù)類產(chǎn)品，其 中用于糖尿病足部及腿部潰瘍治療的重組人PDGF凝膠是用于糖尿病足部及腿部潰瘍的第 一個生物制品。 hKGFl是成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)家族的一員，又稱FGF7。它能剌激來源于不同 組織的上皮細(xì)胞的生長，但對其它類型的細(xì)胞沒有直接的作用。這種明顯的特異性是由于 受到KGF1受體(KGFR)的限制性表達(dá)所造成的。不同組織中的上皮細(xì)胞包括胰腺、肝臟、 肺和尿道上皮組織都表達(dá)KGF1受體。KGF1是由處于與許多器官的上皮細(xì)胞相鄰的間葉細(xì) 胞所產(chǎn)生的，這些組織包括胰腺、肝臟、肺、尿道上皮、前列腺上皮和其它的一些組織。它是 由皮膚內(nèi)真皮成纖維細(xì)胞和腸道的固有層細(xì)胞所產(chǎn)生的。KGF1在正常組織中的廣泛表達(dá)表 明它在組織動態(tài)平衡中的作用。KGF1在真皮損傷時的mRNA的水平比在完整皮膚中所發(fā)現(xiàn) 的水平高出160倍，而且在患有炎癥性腸道疾病患者腸道中的水平也有升高。這些觀察結(jié) 果提示KGF1生成的增加是上皮損傷的一種正常反應(yīng)，并且它可能代表了損傷修復(fù)的一種 成分，但是人體在創(chuàng)傷中存在KGF1分泌相對不足的情況，因此上皮細(xì)胞損傷時單靠自身分 泌的KGF1是不足以存進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的，這為外源性補充KGF1提供了理論基礎(chǔ)。
美國Amgen公司已經(jīng)將重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子開發(fā)為腫瘤放化療后口腔潰瘍 的治療用藥，靜脈滴注給藥，為凍干生物制品，得到FDA和歐洲EMEA的批準(zhǔn)上市，其對口腔 粘膜損傷具有極其良好的修復(fù)治療作用。 本發(fā)明利用人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1對人上皮細(xì)胞的專一性和促進(jìn)分裂分化和遷
3移的生物學(xué)活性，促進(jìn)糖尿病足部及腿部潰瘍部位的上皮的修復(fù)、皮膚結(jié)構(gòu)重建，達(dá)到對潰 瘍的治療、阻止病情進(jìn)一步發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人角質(zhì)細(xì)胞生長因子l在制備治療糖尿病足部及腿部 潰瘍的藥物中的應(yīng)用，所述人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1為缺失N端23個氨基酸殘基的重組人角 質(zhì)細(xì)胞生長因子，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。 所述的藥物是以人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1為活性成分，加上藥學(xué)上可以接受的輔料 制備而成的藥劑。 本發(fā)明的另一目的是提供一種治療糖尿病足部及腿部潰瘍的藥物組合物，其以有 效量的人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1為活性成分，加上藥學(xué)上可以接受的輔料制備而成的藥劑。 所述人角質(zhì)細(xì)胞生長因子l的含量為10ng 500ug/ml，優(yōu)選的人角質(zhì)細(xì)胞生長因子l的含 量為50ng 100ug/ml。 本發(fā)明所述的藥劑是外用固體制劑、半固體制劑或液體制劑。其中，所述的固體制 劑是凍干粉劑或敷料制劑；所述的半固體制劑是凝膠制劑、乳劑或膏劑；所述的液體制劑 為噴霧劑。 本發(fā)明所使用重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1為用E. coli表達(dá)的缺失23氨基酸殘基 的140氨基酸人角質(zhì)細(xì)胞生長因子。 本發(fā)明所用重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1保存方式為冷凍干燥后4-『C冷藏保存， 使用時用特定溶媒溶解后，直接使用于潰瘍部位；亦可將重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1制備 成凝膠制劑、凍干醫(yī)用敷料直接施用于潰瘍部位。 試驗證明，重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1能促進(jìn)糖尿病足部及腿部潰瘍部位快速修 復(fù)，完成結(jié)構(gòu)重建。 下面通過具體實施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但并非對本發(fā)明的限制。


圖1重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1對成纖維細(xì)胞形態(tài)影響
圖2.重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子l對稱纖維細(xì)胞生長曲線影響
具體實施例方式
實施例1本發(fā)明凍干制劑的的制備 活性成分重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子l(可購買美國安進(jìn)公司的產(chǎn)品palifermin 或k印ivance)或者利用常規(guī)的基因重組技術(shù)生產(chǎn)重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子l，其方法如 下 a、按照生物技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法，人工合成或者用RT-PCR技術(shù)克隆 重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1的cDNA序列[fibroblast growth factor7 (keratinocyte growth factor), Homo sapiens, Gene ID 2252，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染工程菌E. coli表 達(dá)，得到表達(dá)重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1的基因工程菌，并經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基因工程菌進(jìn)行重 組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1的生產(chǎn)；
b、經(jīng)過親和層析、離子交換層析等分離純化步驟，獲得純度達(dá)到95X以上的重組
人角質(zhì)細(xì)胞生長因子l，按照Edman法測定蛋白N-末端序列，其序列與SEQ ID N01 N_末
端15個氨基酸殘基相符合，同時通過質(zhì)譜法測定分子量，與預(yù)期分子量16278Da相吻合證
明得到的蛋白為重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子l，并經(jīng)檢測物熱源物質(zhì)和生物活性測定，符合國
家注射用蛋白的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 輔料甘露醇、組氨酸、蔗糖等 將輔料溶解、與相應(yīng)的重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1原液混合，調(diào)整pH值到6. 5、組 成為每毫升液體含1毫克重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1、50毫克甘露醇、25毫克蔗糖、2毫克 組氨酸，經(jīng)過濾除菌后，冷凍干燥，即為凍干制劑，規(guī)格按照需要確定。
實施例2本發(fā)明噴霧制劑的制備 為便于運輸和保存，重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1制備成凍干制劑，使用時可根據(jù) 需要配制為噴霧制劑將凍干制劑用生理鹽水或醫(yī)學(xué)常用溶媒溶解，溶解后的活性物質(zhì)濃 度范圍為50ng 100ug/ml，裝入符合要求的噴霧器中，即可噴霧使用。
實施例3本發(fā)明凝膠制劑的制備 為便于運輸和保存，重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1制備成凍干制劑，使用時可根據(jù) 需要配制為凝膠制劑，制備方法如下 用聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(Pluronic)的低溫呈液態(tài)，體溫凝聚成凝膠的
特點，將其配制成重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1凍干粉的凝膠伴侶，與重組人角質(zhì)細(xì)胞生長
因子1凍干粉共同低溫(4-8°C )保存，使用時用凝膠伴侶溶解凍干粉，吸出涂抹到患處，體
溫作用即形成凝膠覆蓋患處，并釋放重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1產(chǎn)生治療作用。 20%Pluronic F-127液制備方法20mM PBS pH7. 0緩沖液，緩慢加入Pluronic
F-127攪拌30分鐘，4t:下過夜，過濾除菌分裝成lml每支，4-8。C運輸或保存。 使用時，凝膠伴侶與重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1凍干粉溶解配制方法與生理鹽水
配制方法相同，配制后重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1濃度為50ng 100ug/ml。 試驗例一重組人角質(zhì)細(xì)胞對糖尿病足潰瘍處成纖維細(xì)胞增殖的影響 1材料與方法 1. 1主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基，新生小牛血清，Hyclone公司生產(chǎn)。MTT (噻唑藍(lán))Amresco公司 生產(chǎn)。實施例1制備的重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子(rhKGF-l)，由成都博發(fā)生物技術(shù)有限公司 提供。 1. 2主要儀器 電鏡，日本電子公司JEM-1220透射電鏡。酶標(biāo)儀，美國450型酶聯(lián)檢測儀。
1. 3細(xì)胞株 試驗用糖尿病足潰瘍處成纖維細(xì)胞由解放軍總醫(yī)院燒傷研究所贈送。
2方法 2. 1成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取對數(shù)生長期的單層生長細(xì)胞，用含0. 3%新生小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng) 48小時，加入10ug/ml重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子(對照空加入等體積溶媒)，20%小牛血 清，培養(yǎng)24小時，棄液，用0. 25 %胰蛋白酶消化處理，離心、，加入2 %戊二醛固定、脫水、包埋、切片、染色，然后電鏡觀察。 2. 2MTT法測定成纖維細(xì)胞生長曲線 用0. 25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含10%新生小牛血清的RPMI1640培養(yǎng) 液配成單細(xì)胞懸液，以每孔2*105個細(xì)胞接種96孔板，每孔體積200ul。實驗分5組，即第 一組空白對照組、第二組陰性對照組，第3-5組分別為0. 1、10、100ug/ml重組人角質(zhì)細(xì)胞生 長因子。培養(yǎng)7天，每組設(shè)復(fù)孔，在490nm處測定各孔光吸收值，取平均值；繪制生長曲線。
3結(jié)果 3. 1重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1對成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響 電鏡觀察結(jié)果顯示，加入重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1后，成纖維細(xì)胞形態(tài)及超微 結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；表現(xiàn)為核分裂相增加，胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯緊密，其中內(nèi)容物增加，高爾 基復(fù)合體增加(見圖1)。 對照組，線粒體空泡變，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)疏松，擴張呈囊泡狀(左)；加入重組人角質(zhì)細(xì) 胞生長因子，核分裂相增加，胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯緊密，其中內(nèi)容物增加，高爾基復(fù)合體 增加(右)。 3. 2重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1對成纖維細(xì)胞生長曲線影響 生長曲線如圖2 :添加重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1的成纖維細(xì)胞其生長曲線最高， 較對照組和陰性對照組明顯增。以上結(jié)果說明重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子促進(jìn)糖尿病足潰瘍 處成纖維細(xì)胞增殖，有利于糖尿病足潰瘍面愈合。
4結(jié)論 重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1顯著剌激糖尿病足潰瘍處成纖維細(xì)胞增殖，對糖尿病 足潰瘍創(chuàng)面具有促進(jìn)愈合作用。 試驗例二 KGF1治療糖尿病足部及腿部潰瘍的臨床觀察 糖尿病足是糖尿病中晚期因神經(jīng)病變和/或因雙下肢缺血造成的足部病理狀態(tài)，
常合并感染，臨床以肢體末端麻木、疼痛、感染、潰瘍(爛)、壞疽，甚至指趾脫落為主要表
現(xiàn)，是糖尿病患者，尤其是老年患者最痛苦的一種慢性并發(fā)癥，也是老年患者致殘、致死的
主要原因之一。近年來糖尿病足潰爛和壞疽的發(fā)病率正在逐漸增加，已成為非創(chuàng)傷性截肢
手術(shù)的首要原因1。目前醫(yī)生們雖然嘗試多種方法，包括中西藥，來治療糖尿病足部壞疽，
但是效果都十分有限。使用KGF(角質(zhì)細(xì)胞生長因子)外敷治療糖尿病足部壞疽15例，效
果優(yōu)異，現(xiàn)報道如下。 1材料與方法 1. 1 —般資料 糖尿病足的診斷標(biāo)準(zhǔn) 按國際wagner的分級及1995年中華醫(yī)學(xué)會第一屆全國糖尿病足學(xué)術(shù)會制定的分 級標(biāo)準(zhǔn)共分0 V級0級肢端供血不足；1級皮膚有開放性病灶；11級感染病灶已侵犯 深部肌肉組織；III級肌腱韌帶破壞；IV級骨質(zhì)缺損；V級大部或全足壞疽，甚至累及踝 關(guān)節(jié)和小腿2。 15例患者均為常規(guī)換藥方法無效的病例，常用方法局部慶大霉素加中藥外敷，外 科清創(chuàng)等。男性8例，女性7例；年齡最大83歲，最小45歲；糖尿病史最長35年，最短2年， 均為2型糖尿病患者。診斷分級病例1級4例，II級4例，III級3例，IV級3例，V級1
6例。 1. 2治療方法 15例患者均使用胰島素嚴(yán)格控制原發(fā)病血糖外，有感染灶者，根據(jù)局部壞疽的分 泌物培養(yǎng)，選用敏感和足量的廣譜抗生素。 局部治療凡有感染灶、潰爛壞疽者，外科清創(chuàng)去除潰爛壞疽，然后在創(chuàng)面上均勻
涂抹5ug/ml或10ug/ml rhKGFl凝膠制劑，也可以按照相同的量使用凍干粉凍干粉和凝
膠劑的制備方法和使用方法見實施例1、3，后用無菌紗布覆蓋，前一周每天換藥兩次，一周
后，每天換藥一次，此后每周換藥兩次，療程一個月， 一個月時評價療效。 1. 3療效判定標(biāo)準(zhǔn) 顯效7-15d潰爛傷口好轉(zhuǎn)及愈合； 有效10-20d傷口好轉(zhuǎn)及愈合； 無效在治療30d內(nèi)病情無好轉(zhuǎn)，反而繼續(xù)加重及惡化或15d以上局部傷口無變化者。 2結(jié)果 使用rhKGFl凝膠制劑后，全部病例足部壞疽情況好轉(zhuǎn)，有效率100% ，其中顯效11 例，有效率73. 3% ，有效27. 7% 。 V級病例1例，曾經(jīng)嘗試多種治療方法無效，患者考慮患肢 切除，用rhKGFl之后1個月，創(chuàng)面40%以上有明顯好轉(zhuǎn)。使用rhKGFl凝膠制劑之后，所有 病例1周之內(nèi)小創(chuàng)面明顯愈合，大創(chuàng)面滲液、潰爛有好轉(zhuǎn)傾向，用藥至1個月左右，大創(chuàng)面滲 液、潰爛情況基本消失，逐漸形成新鮮肉芽腫，有愈合傾向。
3不良作用 使用rhKGFl凝膠制劑，患者未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，耐受性良好。僅一例使用 rhKGFl凝膠制劑2天后，有輕度皮膚瘙癢，繼續(xù)用藥后皮膚瘙癢消失，考慮與使用rhKGFl關(guān) 系不大。
討論 糖尿病足壞疽的病因復(fù)雜，可以由神經(jīng)營養(yǎng)不良、動脈粥樣硬化和外傷引起。糖尿 病血管病變雖然廣泛，但病理發(fā)展緩慢，有利于側(cè)支循環(huán)的形成，若能在壞疽形成早期進(jìn)行 積極治療，促進(jìn)血管和表皮細(xì)胞的新生，能有效緩解或者治愈壞疽，有可能避免截肢。但遺 憾的是，目前所使用的局部用藥，如慶大霉素和胰島素，雖然能夠抑制局部細(xì)菌生長，卻不 能很好促進(jìn)傷口愈合，而具有生肌作用的中藥，往往具有療效不佳，甚至因為使用過程中無 菌工藝不佳，導(dǎo)致感染的副作用。 KGF1是人體自然分泌的生長因子，具有強效促進(jìn)上皮細(xì)胞增生，和修復(fù)表皮創(chuàng)傷 的作用，其凍干粉工藝可以保證無菌，因此在使用過程中無需擔(dān)心感染等副作用。局部外用 KGF1不但安全，而且起效十分迅速，使用方便，是目前治療糖尿病足部壞疽的最佳選擇。
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0088]Ser Tyr Asp Tyr Met GluGlyGlyAsplieArgValArgArgLeuPhe
0089]1 51015
0090]Cys Arg Thr Gin Trp TyrLeuArglieAspLysArgGlyLysValLys
0091]202530
0092]Gly Thr Gin Glu Met LysAsnAsnTyrAsnlieMetGlulieArgThr
0093]354045
0094]Val Ala Val Gly lie ValAlalieLysGlyValGluSerGluPheTyr
0095]505560
0096]Leu Ala Met Asn Lys GluGlyLysLeuTyrAlaLysLysGluCysAsn
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0105]130135140
權(quán)利要求
人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1在制備治療糖尿病足部及腿部潰瘍的藥物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是所述重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征是所述的藥物是以人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1 為活性成分，加上藥學(xué)上可以接受的輔料制備而成的藥劑。
4. 一種治療糖尿病足部及腿部潰瘍的藥物組合物，其特征是以有效量的人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1為活性成分，加上藥學(xué)上可以接受的輔料制備而成的藥劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征是所述人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1的含量為10ng 500ug/ml。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征是所述人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1的含量為50ng 100ug/ml。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征是所述的藥劑是外用固體制劑、半固體 制劑或液體制劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征是所述的固體制劑是凍干粉劑或敷料 制劑。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征是所述的半固體制劑是凝膠制劑、乳劑或膏劑。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征是所述的液體制劑為噴霧劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1的一種新用途，應(yīng)用于糖尿病足部及腿部潰瘍及腿部潰瘍的治療。本發(fā)明利用人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1特異性促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖的生物活性，達(dá)到對上皮損傷的修復(fù)，促進(jìn)糖尿病足部及腿部潰瘍部位的結(jié)構(gòu)修復(fù)，達(dá)到對糖尿病足部及腿部潰瘍的治療。
文檔編號A61K38/18GK101721681SQ20091021618
公開日2010年6月9日 申請日期2009年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日
發(fā)明者張寶華, 彭紅衛(wèi), 楊偉, 董佳里, 趙斌 申請人:成都博發(fā)生物技術(shù)有限公司;西藏天行生物藥業(yè)有限公司