專利名稱：：人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1在制備治療肛裂的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1的新用途，特別是在制備治療肛裂的藥物中的新用途。具體地說是將人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1制備成既能保持生物活性、又適合外部給藥的制劑，并經(jīng)外部給藥治療肛裂。
背景技術(shù)：
：肛裂是常見肛門疾病，多由肛管狹窄、肛門濕疹、排便損傷和痔瘡誘發(fā)創(chuàng)傷，未得到有效治療發(fā)展而成，肛裂發(fā)病率高，肛裂早期如果得不到及時治療，會出現(xiàn)肛管潰瘍(裂口纖維化，又稱陳舊性肛裂)、肛乳頭肥大(息肉樣瘤)、哨兵痔(皮贅增生)等三種病癥，繼續(xù)發(fā)展還可出現(xiàn)肛竇炎(肛門慢性炎癥)和肛瘺(肛門化膿性炎癥)，與前三癥合稱"肛裂五特征"。也有因長期慢性炎性剌激成肛管癌的可能。臨床上尚無能很好滿足需求的治療方案。最常用手術(shù)治療，但是術(shù)后仍舊有大批病人殘留肛裂或者肛裂復(fù)發(fā)。藥物治療多為口服抗生素類、局部用消炎藥物等，尚無促進(jìn)病灶部位創(chuàng)面修復(fù)、結(jié)構(gòu)重建的藥物。肛裂出現(xiàn)后，因排便產(chǎn)生創(chuàng)面的反復(fù)損傷，以及感染和創(chuàng)面部位的特殊解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，使肛裂不易治愈。具體來講，肛管上端齒線處的特殊結(jié)構(gòu)如肛竇、肛門瓣、肛乳頭、肛腺等，容易被干硬的糞團(tuán)下移時所損傷，使局部產(chǎn)生感染和炎癥，或?qū)е赂叵僮枞?，潰破后形成肛裂，由于局部炎癥剌激，括約肌痙攣，血液供應(yīng)不足，傷口久不愈合，形成慢性潰瘍。此外，解剖上的缺陷如肛裂多發(fā)生于肛門后位，主要是由于外括約肌淺層在肛管前后方各形成"Y"形薄弱區(qū)，排便時容易造成解剖薄弱區(qū)受傷撕裂，這是肛裂裂口的位置常發(fā)生于后方的原因。另外，干硬糞團(tuán)通過肛管時，易引起肛管撕裂和括約肌痙攣引起的慢性潰瘍也是肛裂不愈合的重要因素。hKGFl是成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)家族的一員，KGF1由上皮細(xì)胞相鄰的間葉細(xì)胞所產(chǎn)生，又稱FGF7。它通過結(jié)合只表達(dá)在上皮細(xì)胞的KGF受體(KGFR)特異性結(jié)合促進(jìn)不同組織上皮細(xì)胞的增殖、分化、減少上皮細(xì)胞的凋亡，阻止上皮細(xì)胞DNA的損傷，增強(qiáng)能降低細(xì)胞外部內(nèi)部環(huán)境有毒物質(zhì)的酶活，從而促進(jìn)上皮細(xì)胞的更新和增值。KGF1參與組織損傷后的修復(fù)。重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1已經(jīng)開發(fā)為腫瘤放化療后口腔潰瘍的治療用藥，靜脈滴注給藥，為凍干生物制品，得到FDA和歐洲EMEA的批準(zhǔn)上市，證明重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子l是非常安全的細(xì)胞因子，也是目前全球批準(zhǔn)體內(nèi)注射的第一個細(xì)胞因子。肛裂是人體特殊部位的損傷，影響其愈合的原因很多，得到一種療效顯著，使用方便的藥物是臨床醫(yī)生努力的目標(biāo)。目前沒有報道將KGF1應(yīng)用于肛裂的治療。本發(fā)明利用人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1對人上皮細(xì)胞的專一性和促進(jìn)分裂分化和遷移的生物學(xué)活性，促進(jìn)肛裂部位的修復(fù)、結(jié)構(gòu)重建，加快肛裂的愈合速度，達(dá)到了很好的治療效果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供一種人角質(zhì)細(xì)胞生長因子l在制備治療肛裂的藥物中的應(yīng)用。所述人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1為缺失N端23個氨基酸殘基的重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。進(jìn)一步的，所述的藥物是以有效量的人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1為活性成分，加上藥學(xué)上可以接受的輔料制備而成的藥劑。所述的藥劑是外用固體制劑、半固體制劑或液體制劑。優(yōu)選的固體制劑是凍干粉劑或栓劑；優(yōu)選的半固體制劑是凝膠制劑、乳劑或膏劑；優(yōu)選的液體制劑為噴霧劑。本發(fā)明的另一目的是提供一種治療肛裂的藥物組合物，它以有效量的人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1為活性成分，加上藥學(xué)上可以接受的輔料制備而成的藥劑。所述藥物組合物中人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1的含量為500ng50ug/ml，優(yōu)選的含量范圍是5ug20ug/ml。所述藥劑是外用固體制劑、半固體制劑或液體制劑；優(yōu)選的外用固體制劑、半固體制劑或液體制劑分別是凍干粉劑或栓劑；凝膠劑、乳劑或膏劑；以及噴霧劑。本發(fā)明所使用重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1為用E.coli表達(dá)的缺失23氨基酸殘基的140氨基酸人角質(zhì)細(xì)胞生長因子。本發(fā)明所用重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1保存方式為冷凍干燥后4-『C冷藏保存，使用時用生理鹽水或醫(yī)學(xué)上用于溶解凍干生物制品的溶媒溶解后，直接使用于潰瘍部位或用適當(dāng)藥物載體將藥物送至潰瘍部位。試驗證明，重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1能促進(jìn)肛裂部位快速修復(fù)，完成結(jié)構(gòu)重建；并對痔瘡有良好的治療效果。下面通過具體實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但并非對本發(fā)明的限制具體實施例方式實施例1本發(fā)明凍干制劑的的制備活性成分重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子l(可購買美國安進(jìn)公司的產(chǎn)品palifermin或k印ivance)或者利用常規(guī)的基因重組技術(shù)生產(chǎn)重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子l，其方法如下a、按照生物
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員所熟知的方法，人工合成或者用RT-PCR技術(shù)克隆重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1的cDNA序列[fibroblastgrowthfactor7(keratinocytegrowthfactor),Homosapiens,GeneID2252，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染工程菌E.coli表達(dá)，得到表達(dá)重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1的基因工程菌，并經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基因工程菌進(jìn)行重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1的生產(chǎn)；b、經(jīng)過親和層析、離子交換層析等分離純化步驟，獲得純度達(dá)到95X以上的重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子l，按照Edman法測定蛋白N-末端序列，其序列與SEQIDN01N_末端15個氨基酸殘基相符合，同時通過質(zhì)譜法測定分子量，與預(yù)期分子量16278Da相吻合證明得到的蛋白為重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子l，并經(jīng)檢測物熱源物質(zhì)和生物活性測定，符合國家注射用蛋白的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。輔料甘露醇、組氨酸、蔗糖等將輔料溶解、與相應(yīng)的重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1原液混合，調(diào)整pH值到6.5、組成為每毫升液體含1毫克重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1、50毫克甘露醇、25毫克蔗糖、2毫克組氨酸，經(jīng)過濾除菌后，冷凍干燥，即為凍干制劑，規(guī)格按照需要確定。實施例2本發(fā)明噴霧制劑的制備為便于運輸和保存，重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1制備成凍干制劑，使用時可根據(jù)需要配制為噴霧制劑將凍干制劑用生理鹽水或醫(yī)學(xué)常用溶媒溶解，溶解后的活性物質(zhì)濃度范圍為500ng50ug/ml，裝入符合要求的噴霧器中，即可噴霧使用。實施例3本發(fā)明凝膠制劑的制備為便于運輸和保存，重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1制備成凍干制劑，使用時可根據(jù)需要配制為凝膠制劑，制備方法如下用聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(Pluronic)的低溫呈液態(tài)，體溫凝聚成凝膠的特點，將其配制成重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1凍干粉的凝膠伴侶，與重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1凍干粉共同低溫(4-8°C)保存，使用時用凝膠伴侶溶解凍干粉，吸出涂抹到患處，體溫作用即形成凝膠覆蓋患處，并釋放重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1產(chǎn)生治療作用。20%PluronicF-127液制備方法20mMPBSpH7.0緩沖液，緩慢加入PluronicF-127攪拌30分鐘，4t:下過夜，過濾除菌分裝成lml每支，4-8。C運輸或保存。使用時，凝膠伴侶與重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1凍干粉溶解配制方法與生理鹽水配制方法相同，配制后重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1濃度為500ng50ug/ml。試驗例1重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子對醋酸誘導(dǎo)肛門潰瘍作用研究1材料與方法1.1實驗材料1.1.1實驗動物KM種小鼠，體重18-22g，72只；四川抗菌素工業(yè)研究所實驗動物中心提供，合格證號2003-05。冰醋酸，分析純，批號0805011，長征化學(xué)試劑廠提供。1.1.2實驗藥物實施例1制備的重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1凍干制劑凍干粉，lmg/支；批號20080601。使用時用生理鹽水或其他常用醫(yī)用溶媒溶解，稀釋成最終所需濃度。1.2實驗方法1.2.1實驗方法選用健康昆明種小鼠72只，適應(yīng)飼養(yǎng)3天。將小鼠分成6組，即正常對照組，模型對照組、溶媒對照組、角質(zhì)細(xì)胞生長因子(20、10、5ug/ml)劑量組。除正常對照組外，向其他小鼠肛門內(nèi)用無針注射器推入20%醋酸0.05m1/只，保持2分鐘后用無菌棉簽沾出；正常對照組給予無菌蒸餾水。造模后第2天開始給藥，每天1次，用棉簽沾取稀釋液深入肛門涂抹，連續(xù)3天。實驗觀察ll天。1.2.2觀察指標(biāo)1.2.2.1—般觀察造模后第2天開始觀察，每天1次，包括(1)肛周情況，紅腫，分泌物；5(2)拖尾，即動物在飼養(yǎng)籠內(nèi)摩擦肛門部。1.2.2.2組織病理學(xué)檢查觀察ll天后，脫頸處死小鼠，取直腸及肛門組織，中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察。2結(jié)果2.1—般觀察造模后當(dāng)天，模型組及給藥組動物均出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。第二天給藥前，正常組肛門無異常，模型組及給藥組動物肛門紅腫，并有少量膿性物流出。給藥后第8天，中、高劑量組紅腫消退，少量動物仍有異物流出(結(jié)果見表1.)。表1重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子對一般觀察影響組別劑量第1天給藥前第2天第3天wml)紅腫異物流出拖尾紅腫異物流出拖尾紅腫異物流出拖尾正常對照組/001(1/12)000000模型組/12(12/12)8(8/12)12(12/12)12(12/12)8(8/12)12(12/12)12(12/12)8(8/12)8(8/12)溶媒組/12(12/12)8(8/12)12(12/12)12(12/12)8(8/12)12(12/12)12(12/12)8(8/12)8(8/12)低劑量組512(12/12)8(8/12)12(12/12)12(12/12)7(7/12)8(8/12)11(11/12)8(8/12)8(8/12)中劑量組1012(12/12)9(9/12)12(12/12)12(12/12)7(7/12)8(8/12)12(12/12)7(7/12)7(7/12)高劑量組2012(12/12)8(8/12)12(12/12)12(12/12)7(7/12)8(8/12)12(12/12)7(7/12)7(7/12)表1重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子對一般觀察影響(續(xù))6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.2組織病理學(xué)結(jié)果組織學(xué)檢查表明模型組大量單柱狀上皮細(xì)胞脫落，黏膜可見膿灶形成，并大量炎性細(xì)胞浸潤，可見大量或成片潰瘍形成。以上研究結(jié)果說明肛門潰瘍模型成功。溶媒組大量單柱狀上皮細(xì)胞脫落，黏膜可見膿灶形成，并大量炎性細(xì)胞浸潤，可大量或成片潰瘍形成。低劑量組少量上皮細(xì)胞脫落，偶見炎性細(xì)胞浸潤，可見少量局灶性潰瘍。中、高劑量組殘留輕度炎癥，固有層仍可見少量炎癥細(xì)胞浸潤，組織處于修復(fù)期，可見肉芽組織，復(fù)層上皮基本修復(fù)，絨毛結(jié)構(gòu)出現(xiàn)；高劑量組可見表皮基底細(xì)胞層細(xì)胞明顯增多。3結(jié)論重組人角質(zhì)細(xì)胞能促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞增殖，角質(zhì)細(xì)胞鱗狀上皮可以促進(jìn)黏膜潰瘍的愈合。因此，重組人角質(zhì)細(xì)胞對化學(xué)物質(zhì)、細(xì)菌感染等誘導(dǎo)黏膜潰瘍，以及異物導(dǎo)致肛門創(chuàng)傷具有一定的治療作用。試驗例2重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1(rhKGFl)治療肛裂效果觀察肛裂是最常見的肛門部疾病之一，以周期性肛門疼痛、便秘及間歇性便血為主要特征。肛裂常規(guī)保守治療常經(jīng)久不愈，而需要手術(shù)治療，側(cè)方內(nèi)括約肌切開術(shù)是目前臨床上最常選擇的術(shù)式，但常發(fā)生出血、疼痛、感染、肛門狹窄、瘺管形成和肛門失禁等并發(fā)癥，患者因肛裂或者手術(shù)并發(fā)癥存在巨大痛苦1。目前肛裂治療尚是臨床的難題，我們使用rhKGFl(重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1)外用治療IO例急慢性肛裂病人，效果良好，現(xiàn)報道如下。1資料與方法1.1臨床資料試驗用重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1為凍干粉，由實施例1制備，規(guī)格lmg/支，用生理鹽水溶解，配置成5ug/ml的濃度，用在肛門內(nèi)涂抹。此外外用5ug/mlrhKGFl水凝膠(為實施例3制備的凝膠制劑)外敷于肛門外肛裂處，也可以直接使用按相同方法配制的10ug/ml的rhKGFl水凝膠或水溶液。本觀察入選18名肛裂患者，其中急性肛裂5例，慢性肛裂患者13例，慢性肛裂患者中有4例曾行手術(shù)治療，術(shù)后復(fù)發(fā)，所有患者都試用過肛泰、馬應(yīng)龍痔瘡膏等藥物治療，但是均無明顯療效?；颊呔刑弁?、出血、間歇性便秘等癥狀，18例患者中有5例合并存在內(nèi)外痔。1.2治療方法本觀察使用rhKGFl(重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1)于肛門處外敷以及肛門周圍內(nèi)涂。具體方法用生理鹽水溶解rhKGFl凍干粉，濃度為5ug/ml，將無菌棉球蘸濕，帶橡膠手套，使用該棉球在肛門內(nèi)部涂抹，之后另外使用5ug/mlrhKGFl凝膠制劑外敷于肛門處，持續(xù)30分鐘，早晚各一次。觀察期間兩組均停用一切藥物，于8天后觀察結(jié)果。1.3療效評定標(biāo)準(zhǔn)臨床痊愈便血及疼痛消失，創(chuàng)面愈合；顯效便血及疼痛消失，創(chuàng)面愈合2/3以上；有效便血減少，疼痛減輕，創(chuàng)面愈合1/3以上；無效用藥7d，癥狀及體征無明顯改善。1.4結(jié)果所有患者便血和疼痛癥狀消失，18例患者中達(dá)到臨床痊愈的病例有11例，包括4例急性肛裂和7例慢性肛裂患者，急性肛裂患者使用rhKGFl制劑治療3天內(nèi)創(chuàng)面愈合，慢性肛裂患者使用1周內(nèi)創(chuàng)面愈合，(臨床治愈率61%)5例有效，創(chuàng)面愈合達(dá)2/3以上(顯效率28%)2例有效，創(chuàng)面愈合達(dá)到1/3。5例合并內(nèi)外痔的患者，持續(xù)使用rhKGFl—月之后，痔核變軟、縮小，有3例患者痔核回納到肛門以內(nèi)。1.5不良反應(yīng)未觀察到不良反應(yīng)。2討論肛裂是指齒狀線以下內(nèi)括約肌表面肛管皮膚全層裂開性潰瘍，好發(fā)于肛管后、前正中，以周期性肛門疼痛、便秘及間歇性便血為特征，目前臨床一致認(rèn)為與便秘、努力排便造成機(jī)械性損傷、局部感染、潰瘍等有關(guān)。急性肛裂采用保守治療方法可好轉(zhuǎn)，但是慢性肛裂不易愈合，現(xiàn)在認(rèn)為與局部感染、肛門括約肌壓力增高有關(guān)。慢性肛裂手術(shù)之后還存在著易復(fù)發(fā)、病程長等缺點，到目前為止尚無有效的治療藥物，有些人嘗試使用肉毒堿局部注射加坐浴的方法，短時間使肛門括約肌處于輕癱狀態(tài)，降低肛門括約肌壓力和肛內(nèi)壓力，促進(jìn)肛裂愈合，效果尚可，但是會有短暫的便失禁狀態(tài)2。使用KGF1治療肛裂在國內(nèi)外尚未見到報道，在我們的觀察中，對于急慢性肛裂的愈合十分有效，且使用方法方便、安全，一周內(nèi)即觀察到明顯療效，可促使傷口或潰瘍部位快速愈合，減少進(jìn)一步感染機(jī)率，不但可以作為手術(shù)療法的有效補(bǔ)充，甚至可以代替手術(shù)的可能性。且使用一個月左右，可觀察到緩解內(nèi)外痔的作用，雖然機(jī)理不甚清楚，但是效果是確切的。KGF1對于廣大肛裂患者，實是治療良藥。參考文獻(xiàn)1陳慶生，王淑香。肛門后切術(shù)治療37例陳舊性肛裂臨床體會。Proceedingofclinicalmedicine2008:17(11):92張桂霞。慢性肛裂的診治進(jìn)展。現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生。2008,24(22):341180082]治療肛裂藥物.ST25.txt0083]SEQUENCELISTING0084]〈110〉成都博發(fā)生物技術(shù)有限公司0085]〈120〉人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1在制備治療肛裂的藥物中的應(yīng)用0086]〈130>CD566-09P1080710087]〈160>10088]〈170>PatentInversion3.20089]〈210>10090]〈211>1400091]〈212>PRT0092]〈213〉重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子10093]〈400>10094]SerTyrAspTyrMetGluGlyGlyAsplieArgValArgArgLeuPhe0095]1510150096]CysArgThrGinTrpTyrLeuArglieAspLysArgGlyLysValLys0097]2025300098]GlyThrGinGluMetLysAsnAsnTyrAsnlieMetGlulieArgThr0099]3540450100]ValAlaValGlylieValAlalieLysGlyValGluSerGluPheTyr0101]5055600102]LeuAlaMetAsnLysGluGlyLysLeuTyrAlaLysLysGluCysAsn0103]657075800104]GluAspCysAsnPheLysGluLeulieLeuGluAsnHisTyrAsnThr0105]8590950106]TyrAlaSerAlaLysTrpThrHisAsnGlyGlyGluMetPheValAla0107]1001051100108]LeuAsnGinLysGlylieProValArgGlyLysLysThrLysLysGlu0109]1151201250110]0111]GinLysThrAlaHisPhe130Leu135ProMetAlalieThr1409權(quán)利要求人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1在制備治療肛裂的藥物中的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是所述人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1為缺失N端23個氨基酸殘基的重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是所述的藥物是以有效量的人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1為活性成分，加上藥學(xué)上可以接受的輔料制備而成的藥劑。4.一種治療肛裂的藥物組合物，其特征是以有效量的人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1為活性成分，加上藥學(xué)上可以接受的輔料制備而成的藥劑。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征是所述人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1的含量為500ng50ug/ml。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征是所述人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1的含量為5ug20ug/ml。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征是所述的藥劑是外用固體制劑、半固體制劑或液體制劑。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征是所述的固體制劑是凍干粉劑或栓劑。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征是所述的半固體制劑是凝膠制劑、乳劑或膏劑。10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征是所述的液體制劑為噴霧劑。全文摘要本發(fā)明公開了人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1的一種新的用途，應(yīng)用于因肛管狹窄、肛門濕疹、排便用力過度、痔瘡創(chuàng)傷所引發(fā)急慢性肛裂，以及外科手術(shù)后殘留或者復(fù)發(fā)肛裂的治療。本發(fā)明利用人角質(zhì)細(xì)胞生長因子1特異性促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖的生物活性，促進(jìn)傷口創(chuàng)面上皮細(xì)胞增殖和創(chuàng)面組織的修復(fù)，促進(jìn)肛裂部位的結(jié)構(gòu)恢復(fù)，加快肛裂的愈合。文檔編號A61P1/00GK101721683SQ20091021618公開日2010年6月9日申請日期2009年11月10日優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日發(fā)明者張寶華,彭紅衛(wèi),楊偉,董佳里,趙斌申請人:成都博發(fā)生物技術(shù)有限公司;西藏天行生物藥業(yè)有限公司;天津博發(fā)生物技術(shù)有限公司