專利名稱：角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的治療應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)刺激角質(zhì)細(xì)胞以外的其它細(xì)胞的增長(zhǎng)、生長(zhǎng)和分化，以及給患者施用KGF以利用其生物學(xué)作用再生被損害或病變的細(xì)胞和組織。
背景技術(shù)：
近些年，生物技術(shù)的進(jìn)展導(dǎo)致新的重組多肽(包括促紅細(xì)胞生成素和粒細(xì)胞集落刺激因子)的形成和治療性應(yīng)用，給許多患者帶來(lái)了好處。已發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出具有體外生物學(xué)活性的其他多肽的數(shù)目也在增加。然而，這些因子的靶細(xì)胞的特征和該因子的體內(nèi)生物學(xué)作用對(duì)人類潛在的治療學(xué)應(yīng)用是必需的。
KGF是一種已知的促細(xì)胞分裂劑，最初被鑒定為對(duì)上皮細(xì)胞，特別是對(duì)角質(zhì)細(xì)胞有特異性(Rubin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:802-806(1989)；Finch et al.,Science,245:752-755(1989)；Marchese et al.,J.Cell.Phys.144:326-332(1990))。在來(lái)自胚胎，新生兒和成人上皮組織的幾種基質(zhì)成纖維細(xì)胞系中和從正常成人腎臟和胃腸道提取的RNA中已檢測(cè)到KGF信使RNA的表達(dá)。在膠質(zhì)細(xì)胞、肺、腦或各種上皮細(xì)胞系(包括鱗狀細(xì)胞癌、乳腺上皮細(xì)胞、永生的支氣管上皮細(xì)胞、永生的角質(zhì)細(xì)胞和原代角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物)中未檢測(cè)到該RNA(Finch et al.,Science，出處同上)。然而，KGF對(duì)連續(xù)的小鼠細(xì)胞系BALB/MK細(xì)胞具有促有絲分裂活性。(Weissman and Aaronson,Cell,32:599(1983)；也見PNAS和Scienee，出處同上)。這一觀察支持了KGF在皮膚中表現(xiàn)出旁分泌作用的證據(jù)KGF在真皮(而不在表皮)中生產(chǎn)并作用于角質(zhì)細(xì)胞。
另外，使用角蛋白和filagrin基因的表達(dá)證實(shí)KGF影響角質(zhì)細(xì)胞的分化和成熟(參見J.Cell Phys．出處同上)。
用重組KGF完成了大量前述工作以考察KGF的生物學(xué)活性，重組KGF使得可以對(duì)該因子進(jìn)行更廣泛的研究。公開的PCT專利申請(qǐng)WO90/08771描述了從入胚胎成纖維細(xì)胞系條件培養(yǎng)基中純化KGF、分離的多肽之部分氨基酸測(cè)序、該基因的克隆及在細(xì)菌細(xì)胞(E.coli)中表達(dá)以得到重組的具生物學(xué)活性的KGF。
KGF作為體外角質(zhì)細(xì)胞的刺激劑的作用已被清楚地鑒定，而將KGF當(dāng)作生長(zhǎng)因子仍有待于了解，包括對(duì)可成為靶目標(biāo)的其他細(xì)胞種類以及KGF在體內(nèi)對(duì)該細(xì)胞的影響。這些資料對(duì)于了解KGF用作治療劑的全部效力是關(guān)鍵的。
發(fā)明概要簡(jiǎn)單地說(shuō)，本發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)KGF對(duì)非角質(zhì)細(xì)胞上皮細(xì)胞的刺激作用。更具體地說(shuō)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)KGF用于體內(nèi)誘導(dǎo)正常附屬結(jié)構(gòu)(如皮脂細(xì)胞和毛囊細(xì)胞)、肝臟細(xì)胞(如肝細(xì)胞)和呼吸粘膜上皮細(xì)胞(如Ⅱ型肺細(xì)胞)的增生和分化。對(duì)于KGF刺激腸粘膜細(xì)胞(如胃腺和小腸腺產(chǎn)生粘蛋白的杯狀細(xì)胞、結(jié)腸的隱窩細(xì)胞和腸道內(nèi)的其他上皮細(xì)胞)的增生和生長(zhǎng)。
構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的這些發(fā)現(xiàn)，明顯地暗示KGF能應(yīng)用于組織，尤其是其特征為特定類型的細(xì)胞損傷或缺失的組織。下面是對(duì)根據(jù)本發(fā)明能用KGF治療的疾病和醫(yī)學(xué)癥狀的描述。
附屬結(jié)構(gòu)(如毛囊、汗腺、皮脂腺)的增生和分化的刺激作用在燒傷和其他部分及全部深度損傷的患者表皮和真皮再生是非常重要的?，F(xiàn)在，用瘢痕形成和角質(zhì)細(xì)胞表面再生來(lái)治愈表面缺損，皮膚的完全再生還是不可能的。毛囊、汗腺和皮脂腺的種群重建目前在完全深度的皮膚缺損(包括燒傷)中還不能發(fā)生。KGF的使用使這種種群重建成為可能。
大泡性表皮松解是依附于表皮和真皮之間的一種損傷，導(dǎo)致頻繁的破裂的疼痛水泡，可引起嚴(yán)重的發(fā)病。加速這種損傷的表皮再生(如用KGF治療)將導(dǎo)致感染的風(fēng)險(xiǎn)減少，減輕疼痛，并減少傷口處理。
當(dāng)對(duì)患者使用化學(xué)療程治療惡性腫瘤時(shí)，引起化學(xué)治療誘導(dǎo)性脫毛癥。目前對(duì)于阻止引起頭發(fā)暫時(shí)減少的毛囊細(xì)胞死亡尚無(wú)有效的治療方法。而KGF可提供這類方法。
男性型脫發(fā)癥是一種流行的且基本上不可治療的疾病。男人和女人頭發(fā)的逐漸減少是一個(gè)嚴(yán)重的美容問(wèn)題。這一癥狀可用KGF進(jìn)行全身性的或局部的治療，如果這種藥物能通過(guò)頭皮使用和吸收，或使用氣槍或相似技術(shù)噴射進(jìn)頭皮。
胃潰瘍盡管可用H2拮抗劑來(lái)治療，但引起嚴(yán)重的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率，并且是通過(guò)粘膜內(nèi)面的瘢痕形成來(lái)愈合。而例如，用KGF治療，腺粘膜更快再生的能力將在胃潰瘍的治療上提供顯著的治療學(xué)改進(jìn)。
十二指腸潰瘍與胃潰瘍一樣也可治療，但開發(fā)更完全和更迅速地再生十二指腸粘膜內(nèi)表面的治療劑將是一個(gè)重要進(jìn)展。而且，再生性治愈這些潰瘍且減少?gòu)?fù)發(fā)的治療劑將是有利的。KGF提供了這種功效。
炎性腸疾病，如節(jié)段性腸炎(主要感染小腸)和潰瘍性結(jié)腸炎(主要感染大腸)，是病因未知的慢性疾病，引起粘膜表面的損傷、發(fā)炎、修復(fù)期間形成瘢痕和粘連并在感染的個(gè)體中有很高的發(fā)病率。目前的治療方法是設(shè)法控制炎癥。刺激粘膜表面的表面再生的治療方法(如用KGF)導(dǎo)致快速愈合，可能對(duì)控制疾病的惡化有利。
在放射和化學(xué)治療的治療方式中，腸道毒性是一個(gè)主要的限制因素。用KGF進(jìn)行預(yù)治療可以對(duì)小腸粘膜產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)性影響，允許增大這類治療的劑量而減小潛在致命的腸道毒副作用。
KGF治療對(duì)整個(gè)胃腸道粘液的產(chǎn)生具有顯著的影響。這一特性可能在保護(hù)腸粘膜兔受消化物的損傷和在限制諸如炎性腸疾病狀態(tài)中損傷的擴(kuò)散是有用的。
由肺內(nèi)Ⅱ型肺細(xì)胞產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)總產(chǎn)量的缺乏引起早產(chǎn)嬰兒的透明膜疾病，導(dǎo)致肺泡的萎縮。盡管皮質(zhì)甾類能在28周胎兒中加速成熟和分泌并超出很大程度，但目前對(duì)更小的胎兒尚無(wú)治療辦法，在這類胎兒中引起大量的發(fā)病率和死亡率。誘導(dǎo)Ⅱ型肺細(xì)胞增生和分化的治療劑(如KGF)在這類疾病的治療中可能有明顯的益處。
吸煙是燒傷后一周內(nèi)發(fā)病和死亡的明顯原因，起因于支氣管上皮和肺泡的壞死。生長(zhǎng)因子(如KGF)可能刺激這些結(jié)構(gòu)的增生和分化，誘導(dǎo)其修復(fù)和再生，在治療吸入性損傷中可能有益處。
肺泡的逐漸減少導(dǎo)致肺氣腫。生長(zhǎng)因子(如KGF)能刺激再生或保護(hù)殘留肺泡的細(xì)胞，這將具有治療學(xué)益處。目前還沒有有效的治療方法。
肝硬化繼發(fā)于病毒性肝炎和慢性乙醇攝入，是發(fā)病和死亡的重要原因。由KGF產(chǎn)生的肝細(xì)胞之細(xì)胞保護(hù)、增生和分化可改善肝功能，這對(duì)減緩或阻止肝硬化的發(fā)展有益處。
發(fā)生在肝硬化晚期的暴發(fā)性肝衰竭是一種威脅生命的疾病。諸如KGF之類的因子能誘導(dǎo)剩余肝細(xì)胞的增生，這對(duì)這一疾病將直接有利，目前僅用肝移植可治療該疾病。
急性病毒性肝炎是頻發(fā)的亞臨床性和自限性疾病。然而，在少數(shù)患者中，幾周內(nèi)可引起嚴(yán)重肝損傷。KGF作為一種細(xì)胞保護(hù)劑在阻止肝細(xì)胞變性中將有用。
由乙酰氨基苯、氟烷、四氯化碳和其它毒紊引起對(duì)肝臟的毒性損傷，可用對(duì)肝細(xì)胞具有細(xì)胞保護(hù)作用的生長(zhǎng)因子(KGF)來(lái)改善。
因此，本發(fā)明包含KGF的用途，包括在治療學(xué)上(或在合適的情況下，在預(yù)防上)用于治療上面提到的疾病，以及含有合適的、治療學(xué)上有效量的KGF之藥品附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了合成的寡核苷酸DNA的核苷酸序列，它用于KGF的重組表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建體中，所說(shuō)的KGF被應(yīng)用于本文所述的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。
圖2描述兔耳朵部分深度真皮的傷口模型，經(jīng)修改產(chǎn)生一通過(guò)軟骨的傷口，以更好地定量新組織的生長(zhǎng)。
圖3描述了修改性兔耳部分深度真皮傷口模型中KGF處理后的和對(duì)照的傷口上皮再生。KGF治療后再生上皮的總面積如左所示，傷口再生上皮的百分?jǐn)?shù)如右所示。
圖4顯示使用兔傷口模型，以KGF治療達(dá)5天后傷口邊緣基底部和上基底部角質(zhì)細(xì)胞的增生。
圖5描述了經(jīng)KGF治療過(guò)的和對(duì)照的傷口以溴脫氧尿苷(BrdU)處理過(guò)的毛囊組織學(xué)分析以顯示在修改性兔模型中的細(xì)胞增生。
圖6描繪了相同兔模型中KGF處理過(guò)的和對(duì)照的傷口皮脂腺的油紅O染色。
圖7和圖8顯示了以KGF進(jìn)行氣管內(nèi)處理過(guò)的健康大鼠肺泡隔上皮細(xì)胞微乳頭狀過(guò)度生長(zhǎng)。
圖9和圖10顯示給相同的健康大鼠氣管內(nèi)施用KGF后肺內(nèi)大部分肺泡上皮細(xì)胞的立方形生長(zhǎng)。
圖11和圖12顯示這種處理過(guò)的大鼠肺泡隔內(nèi)表面增生的肺泡上皮細(xì)胞含有各種大小和形狀的片狀包涵體。
圖13A顯示給健康大鼠氣管內(nèi)投藥后支氣管上皮的KGF處理之增生效應(yīng)。
圖13B顯示了與圖13A試驗(yàn)組相應(yīng)的健康大鼠對(duì)照(僅用賦形劑)組的支氣管上皮。
圖14描繪了在成年大鼠肺中KGF受體(KGFR)的RNase保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果。
圖15顯示KGF處理4天后對(duì)劑量依賴型的胃腸道和肝增重。
圖16顯示以KGF處理4天后對(duì)劑量依賴型的大鼠肝臟蛋白質(zhì)合成的增加。
圖17顯示使用BrdU標(biāo)記(A)或分裂計(jì)數(shù)(B)測(cè)量的以KGF處理1到7天的動(dòng)物肝臟肝細(xì)胞增長(zhǎng)的增生作用。
圖18和19描繪了部分肝切除的大鼠以KGF處理后肝臟質(zhì)量的恢復(fù)。
圖20描繪了四氯化碳中毒大鼠以KGF處理后血清谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶水平的降低。
圖21顯示以KGF處理1到7天后大鼠胃腺內(nèi)胃腺長(zhǎng)度和粘液形成量的增加。
圖22顯示以KGF處理1到7天后大鼠小腸內(nèi)十二指腸隱窩長(zhǎng)度和粘液產(chǎn)量的增加。
圖23顯示了以KGF處理1到7天后大鼠結(jié)腸隱窩的增加。
圖24顯示了以KGF處理1到7天后大鼠結(jié)腸隱窩深度的增加。
具體實(shí)施方案的描述為鑒定KGF可對(duì)之產(chǎn)生顯著生物學(xué)效應(yīng)并表現(xiàn)出有效治療學(xué)價(jià)值的上皮細(xì)胞的特異性種類，使用活動(dòng)物體內(nèi)施用KGF并觀察和分析結(jié)果來(lái)進(jìn)行廣泛的研究。在下面各實(shí)施例中使用的重組KGF按如下方法制備。
經(jīng)PCR從人包皮成纖維細(xì)胞(AG1523)RNA中分離出重組KGF基因，所得DNA連接到pCFM1156表達(dá)載體NdeⅠ和BamHⅠ限制性位點(diǎn)之間。質(zhì)粒pCFM1156衍生于美國(guó)專利4,710,473所述的pCFM836質(zhì)粒(本文引入該美國(guó)專利供參考)，經(jīng)破壞2個(gè)內(nèi)源性NdeⅠ限制性位點(diǎn)，用T4聚合酶補(bǔ)齊末端，接著連接平末端，用下面含有SEQ.ID.NO:1和SEQ.ID.NO:2的寡聚核苷酸雙鏈取代單一ClaⅠ和KpnⅠ限制性位點(diǎn)之間的小段DNA序列ClaⅠ KpnⅠ5′ CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC 3′3′ TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5′使用標(biāo)準(zhǔn)電穿孔(BioRad Gene Pulser)轉(zhuǎn)化程序?qū)CFM1156KGF質(zhì)?？寺〉紽M5宿主細(xì)胞(ATCC#53911)。為降低觀察到的內(nèi)部翻譯啟動(dòng)，用設(shè)計(jì)為減少內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(圖1)的使用之合成寡聚核苷酸DNA取代KGF基因KpnⅠ和EcoRⅠ之間的DNA序列。連接和電穿孔到FM5細(xì)胞(ATCC#53911)后，挑選含pCFM1156KGF-dsd的克隆。編碼KGF基因的DNA經(jīng)測(cè)序來(lái)證實(shí)。然后在10升發(fā)酵罐中用標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)培養(yǎng)基30℃下培養(yǎng)細(xì)胞，在葡萄糖有限的條件下允許細(xì)胞以指數(shù)速率生長(zhǎng)以阻止毒性副產(chǎn)物的積累。在指數(shù)中期的細(xì)胞密度下，溫度突然升高到42℃以誘導(dǎo)KGF基因的轉(zhuǎn)錄，然后在大約37℃維持以利于發(fā)酵的KGF誘導(dǎo)期的剩余物。收集細(xì)胞膏并冷凍貯存。利用蛋白質(zhì)非常高的等電點(diǎn)(S-Sepharose Fast Flow Pharmacia)和大小(Superdex 75,Pharmacia)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)色譜程序從機(jī)械破碎的細(xì)胞膏中純化具生物學(xué)活性的KGF。在Rubin等(PNAS，出處見上)所描述的促有絲分裂試驗(yàn)中測(cè)量純化的重組KGF蛋白質(zhì)之內(nèi)毒素和生物學(xué)活性。
實(shí)施例1體內(nèi)傷口愈口模型中附屬結(jié)構(gòu)之KGF刺激的增生和分化在本實(shí)施例中，使用修改的兔耳部分深度真皮傷口模型。由Mustoe等人(J.Clin.Invest.,87:694-703(1991))描述的兔耳真皮潰瘍模型，使用6mm環(huán)鉆經(jīng)修改在耳背側(cè)真皮產(chǎn)生一個(gè)通過(guò)軟骨的傷口。因此經(jīng)軟骨下表面表皮部分的生長(zhǎng)來(lái)愈合傷口，在愈合期間不可能收縮，允許精確定量新組織(圖2)。按上面所述制備的重組KGF用作治療傷口愈合的制劑。材料和方法在手術(shù)當(dāng)天使用一次KGF或僅用磷酸緩沖鹽載體，并用Tegaderm封閉套(3M Company,St.Paul,MN)覆蓋傷口(0.25cm2)。處死前，每只動(dòng)物按每kg體重50mg的量靜脈注射BrdU(AldrichChemical Company,Milwaukee.WI)。BrdU的施用是為了更好地定量基部角質(zhì)細(xì)胞增生的程度和基部細(xì)胞遷移到表皮生發(fā)層和角質(zhì)層的動(dòng)態(tài)。處死后，剖開每個(gè)傷口，一部分在最適冷凍溫度培養(yǎng)基(OCT,Miles Inc.,Elkhart,IN)中冷凍，第二部分在Omnifix(Al-Con,Genetics,Inc.,Melville,NY)中固定并按常規(guī)組織學(xué)方法進(jìn)行處理。在各傷口的3μm厚切片上進(jìn)行Masson Trichrome、油紅O和免疫組織化學(xué)(IHC)染色。再生上皮的測(cè)量使用校準(zhǔn)態(tài)的測(cè)微尺對(duì)每個(gè)傷口的傷口全長(zhǎng)和上皮缺口長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)量。經(jīng)取全長(zhǎng)和上皮缺口長(zhǎng)之差除以各傷口的全長(zhǎng)計(jì)算出各傷口再生上皮的百分?jǐn)?shù)。來(lái)自每個(gè)傷口兩部分的資料進(jìn)行平均。使用單尾未配對(duì)Student t-檢驗(yàn)分析上皮長(zhǎng)測(cè)量值和再生上皮百分?jǐn)?shù)的差異。
計(jì)算各劑量組處理過(guò)的和未處理過(guò)的傷口產(chǎn)生的上皮面積。各劑量對(duì)對(duì)照組進(jìn)行單邊ANOVA和Dunnett t-檢驗(yàn)。上皮細(xì)胞增生和分化的測(cè)量用抗-BrdU(Dako Corp,Carpinteria,CA)、抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物(Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA)和二氨基聯(lián)苯胺底物(DAB,Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)染色石蠟包埋的3μm組織切片。切片用0.1％蛋白酶溶液消化，接著用2N HCl處理，經(jīng)與3％過(guò)氧化氫溶液接觸抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。切片用10％的正常馬血精的磷酸緩沖鹽(PBS)溶液封閉，然后與在1％牛血清白蛋白中按1∶400稀釋的抗-BrdU一起溫育。洗滌后，切片與在1％TBSA中按1∶100稀釋的過(guò)氧化物酶連接的抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物一起溫育20分鐘。然后，切片浸入DAB底物(10mg DAB,20m1 PBS,20μl 30％過(guò)氧化氫)中10分鐘。切片用蘇木精復(fù)染。BrdU處理過(guò)的毛囊組織學(xué)分析BrdU摻入和IHC染色后，用Kruskall-Wallis多重比較試驗(yàn)計(jì)數(shù)和分析每個(gè)傷口創(chuàng)面的毛囊總數(shù)。進(jìn)一步的分析包括對(duì)每處理組中具有10個(gè)或更多增生細(xì)胞的毛囊之傷口百分?jǐn)?shù)的卡一方檢驗(yàn)。另外，在所有含多于5個(gè)增生細(xì)胞的毛囊中計(jì)數(shù)了BrdU正染細(xì)胞數(shù)。皮脂腺的油紅O染色油紅O是一種中性脂肪特異性染料，用于鑒定皮脂細(xì)胞和皮脂腺，使用F.L.Carson(Histotechnology:A Self-InstructionalText ASCP Press，Chicago(1990))所述的程序在冰凍切片上進(jìn)行。簡(jiǎn)單地說(shuō)，7μm冰凍切片經(jīng)空氣干燥在鋅-福爾馬林中固定10分鐘。切片浸入0.3％ w/v油紅O(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)中，然后在60％異丙醇中室溫下處理30分鐘，在60％異丙醇中脫色后用Learner蘇木精復(fù)染。測(cè)定皮脂腺的大小和每個(gè)腺體的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果和分析在以4-40μg/cm2的KGF處理過(guò)的傷口上觀察到上皮再生加速和上皮厚度增加。處理后第5天的傷口與對(duì)照相比表現(xiàn)出明顯的上皮再生增強(qiáng)(76.7％對(duì)52.5％,1μg的KGF)，新上皮的厚度以劑量依賴性方式增加，在每傷口10μg KGF劑量下處理后第5天和第7天幾乎是對(duì)照傷口表皮面積的2倍(圖3)。組織學(xué)分析表明，上皮再生以發(fā)芽的方式大量出現(xiàn)于真皮的附屬結(jié)構(gòu)中，即皮脂腺、汗腺和毛囊。
基部角質(zhì)細(xì)胞增生和基部細(xì)胞遷移分析揭示出KGF處理1天后傷口邊緣增生的基部角質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增加(圖4)。KGF處理的第2天，在表皮上基底層的增生角質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增加表明增生細(xì)胞向表皮生發(fā)層的轉(zhuǎn)變時(shí)間加快。處理后的第5天，在基底層傷口顯示出較少的增生，表明上皮修復(fù)和分化加速的自我限制(圖4)。角質(zhì)細(xì)胞隨著其向上遷移表現(xiàn)出進(jìn)行正常的成熟以形成角質(zhì)層。
未料到還觀察到了皮脂細(xì)胞增生和分化的增加以及毛囊增生的增加。KGF處理過(guò)的傷口與對(duì)照傷口相比毛囊和皮脂腺均表現(xiàn)出形態(tài)更大和數(shù)量更多(分別見圖5和6)。經(jīng)油紅O染色以選擇性地鑒別皮脂腺的組織切片顯示出該腺體數(shù)目明顯增加且形態(tài)也顯著增大，表明皮脂細(xì)胞的增生和分化加快形成產(chǎn)皮脂的細(xì)胞。在KGF處理過(guò)的傷口中也觀察到每個(gè)毛囊中增生細(xì)胞數(shù)目的劑量依賴性增加。
以前在兔耳模型中檢查了表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)(J.Clin.Invest.,同上，和Pierce et al.,Amer,J.Pathol.140:1375-1388(1992))。盡管已知兩種生長(zhǎng)因子都刺激上皮再生，但EGF和堿性FGF都不影響附屬結(jié)構(gòu)(如皮脂腺和毛囊)的增生或分化。KGF刺激皮膚中的多種細(xì)胞類型增生繼而分化的能力及其最初從成纖維細(xì)胞中分離出來(lái)的事實(shí)表明KGF是一種皮膚再生過(guò)程的有效旁分泌刺激物。
實(shí)施例2KGF體內(nèi)刺激Ⅱ型肺細(xì)胞的增生和分化完成本實(shí)施例以評(píng)價(jià)施用KGF對(duì)健康大鼠呼吸道上皮細(xì)胞的影響。材料和方法雄性Lewis大鼠，每只體重200-250克，使用Ulich等人的方案(in Amer.J.Pathol.,138:1485-1496(1991))，單次氣管內(nèi)注射以鹽水或磷酸緩沖鹽水稀釋的各種劑量的KGF。注射的KGF劑量為0.1、1.0、5.0和10.0mg/kg。對(duì)照大鼠接受一次氣管內(nèi)注射賦形劑。在注射KGF后6小時(shí)和1、2、3、4、5和6天各時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，肺用布安氏固定劑經(jīng)氣管內(nèi)導(dǎo)管膨脹，石蠟包埋肺的矢狀切面，用蘇木精和曙紅染色組織學(xué)切片。結(jié)果和討論0.1mg/kg的KGF不能引起組織學(xué)上可見的肺泡上皮細(xì)胞增生。1.0mg/kg的KGF引起輕微但有限的肺泡上皮細(xì)胞增長(zhǎng)。在5.0和10.0mg/kg劑量下分別觀察到肺泡上皮細(xì)胞增生的增加。在氣管內(nèi)注射后6小時(shí)或1天時(shí)KGF不能引起肺泡上皮細(xì)胞組織學(xué)上可見的增長(zhǎng)。在第2天，在KGF處理后的大鼠肺內(nèi)觀察到肺泡隔上皮細(xì)胞疣狀微乳頭的增生(圖7、8)。在第3天，在大部分肺的肺泡全部由表面上觀察到腫泡上皮細(xì)胞的分散的低立方形到立方形的生長(zhǎng)(圖9、10)。然而，肺的一些區(qū)域保持正常的組織學(xué)狀態(tài)。第三天大鼠增生的肺泡上皮組織學(xué)形態(tài)與入肺反應(yīng)性Ⅱ型肺細(xì)胞增生的形態(tài)基本相同。氣管內(nèi)注射后第4天和第5天可觀察到KGF處理過(guò)的大鼠肺內(nèi)增生的肺泡上皮量減少。第6天，KGF處理過(guò)的和對(duì)照的大鼠肺不可區(qū)別開。
氣管內(nèi)注射3天后對(duì)KGF處理過(guò)的大鼠肺進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)檢查。肺泡隔內(nèi)表面增生的肺泡上皮細(xì)胞幾乎一律含有一個(gè)或多個(gè)不同大小和形狀的層狀包涵體(圖11、12)。在第3天，KGF處理過(guò)的大鼠支氣管上皮增生，但其增生并不像肺泡細(xì)胞增生一樣顯著。正常情況下由表面為單層上皮細(xì)胞的較小的遠(yuǎn)端支氣管以內(nèi)表面上皮假?gòu)?fù)層化的形式增加增生，這種增生以支氣管上皮的簇生或微乳頭狀生長(zhǎng)，和以支氣管上皮內(nèi)有絲分裂數(shù)增加來(lái)進(jìn)行(圖13A、13B)。
氣管內(nèi)用藥的KGF引起肺泡上皮細(xì)胞的顯著增生。細(xì)胞內(nèi)在超微結(jié)構(gòu)水平上存在層狀細(xì)胞質(zhì)包涵體與增生的細(xì)胞是Ⅱ型肺細(xì)胞的假設(shè)一致。層狀包涵體不表現(xiàn)出在有些情況下大鼠實(shí)驗(yàn)性Ⅱ型肺細(xì)胞增生表現(xiàn)出的數(shù)量或嗜鋨性，但與正常大鼠肺表現(xiàn)出的層狀包涵體非常相似。除了引起肺泡細(xì)胞增生外，KGF還引起支氣管上皮細(xì)胞的增生?？赡茉錾姆闻萆掀ご碇夤苌掀哪┒酥夤艿椒闻輰?shí)質(zhì)的向下生長(zhǎng)。然而，似乎更可能KGF直接作用于Ⅱ型肺細(xì)胞，因?yàn)樽⑸銴GF兩天后肺泡隔肺細(xì)胞的多點(diǎn)微乳頭狀發(fā)芽生長(zhǎng)方式在第3天以立方形細(xì)胞伸出肺泡匯合的內(nèi)表面。另外，Ⅱ型肺細(xì)胞被認(rèn)為是有絲分裂應(yīng)答性肺泡上皮細(xì)胞類群，并期望是對(duì)有效的內(nèi)源性肺泡細(xì)胞生長(zhǎng)介質(zhì)(如KGF)產(chǎn)生應(yīng)答的肺泡細(xì)胞類型。最后，對(duì)增生細(xì)胞內(nèi)層狀包涵體的鑒定表明它們不僅分化成Ⅱ型肺細(xì)胞，而且起源于Ⅱ型肺細(xì)胞。
KGF對(duì)Ⅱ型肺細(xì)胞的刺激效應(yīng)與觀察到的每等份總RNA樣品中肺內(nèi)KGF受體信使RNA總量是在成熟的年輕大鼠其它各種器官中所發(fā)現(xiàn)的水平的2到3倍這一結(jié)果一致。在本實(shí)驗(yàn)中，使用修改的Ambion RNase保護(hù)試驗(yàn)(RPAⅡ,No.1410)檢測(cè)KGF受體信使RNA水平。
用于本試驗(yàn)的“反意”RNA探針具有下面序列(SEQ.ID.NO:3):5′GAAUACGAAUUCCUUGCUGUUUGGGCAGGACAGUGA-GCCAGGCAGACUGGUUGGCCUGCCCUAUAUAAUUGG-AGACCUUACAUAUAUAUUCCCCAGCAUCCAUCUCCG-UCACAUUGAACAGAGCCAGCACUUCUGCAUUGGAGC-UAUUUAUCCCCGAGUGGAUC 3′使用Promega Riboprobe Gemini Ⅱ試劑盒(#P2020)從編碼上述相應(yīng)DNA序列的線型化模板DNA制備反意探針。經(jīng)切下準(zhǔn)確大小的帶并在Ambion溶液F中洗脫RNA探針從尿素-聚丙烯酰胺凝膠中純化RNA探針。
編碼與“反意”探針互補(bǔ)的RNA序列的“有意義”RNA標(biāo)準(zhǔn)品序列如下(SEQ.ID.NO:4):5′GGGAGACAAGCUUGCAUGCCUGCAGGUCGACUCUAG-AGGAUCCACUCGGGGAUAAAUAGCUCCAAUGCAGAA-GUGCUGGCUCUGUUCAAUGUGACGGAGAUGGAUGCU-GGGGAAUAUAUAUGUAAGGUCUCCAAUUAUAUAGGG-CAGGCCAACCAGUCUGCCUGGCUCACUGUCCUGCCCA-AACAGCAAGG 3′使用Promega Riboprobe Gemini Ⅱ試劑盒(#P2020)制備冷(無(wú)放射活性標(biāo)記)有意義鏈標(biāo)準(zhǔn)品并在G50 Sephadex Quick旋轉(zhuǎn)柱上純化。
按照標(biāo)準(zhǔn)Ambion(RPA Ⅱ #1410)方案，50μg總RNA與105cpm的探針先95℃溫育4分鐘，再45℃溫育12到18小時(shí)。RNase(1∶500 Ambion溶液R)與雜交溶液37℃下溫育40分鐘，接著加入滅活/沉淀試劑(溶液Dx)。然后使用尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳按大小分離RNAase保護(hù)的片段，全部凝膠浸沒于Phosphorimagerscreen中。然后條帶在Molecular Dynamics Phosphorimager中定量。結(jié)果如圖14所示。
KGF作為Ⅱ型肺細(xì)胞生長(zhǎng)因子的鑒定提高了KGF用作胎兒肺成熟刺激物顯示出與糖皮質(zhì)激素相似的治療學(xué)效力的可能性。KGF在臨床上刺激成人肺損傷后支氣管肺泡的修復(fù)中也可能是有用的。KGF對(duì)Ⅱ型肺細(xì)胞的增生效應(yīng)表明KGF可能在調(diào)節(jié)表面活性劑的合成和分泌中起重要作用。
實(shí)施例3KGF刺激的肝細(xì)胞增生和分化本實(shí)施例評(píng)價(jià)了經(jīng)全身性施用KGF對(duì)成年大鼠肝臟上皮組織的影響材料和方法，雄性大鼠隨意接受水和食物。所有動(dòng)物每天接受腹膜內(nèi)注射KGF或PBS，注射1天、4天或7天。在所有實(shí)驗(yàn)中，每組至少分析5只動(dòng)物。
所有大鼠以CO2室息而死，死后立即以心臟穿刺取血用于血清化學(xué)，血液冷凍貯存直至分析。分析血清的標(biāo)準(zhǔn)血清化學(xué)和電解質(zhì)。在黑暗中稱肝臟的重量，重量以每100克體重(百分體重)的克數(shù)來(lái)表達(dá)。組織樣品放入10％緩沖的福爾馬林中以備常規(guī)組織學(xué)處理。
肝臟切片用蘇木精和曙紅(H和E)染色。處死前1小時(shí)，大鼠經(jīng)腹膜內(nèi)注射接受5Dmg/kg的BrdU。進(jìn)行抗BrdU免疫組織化學(xué)，使BrdU摻入DNA的復(fù)制細(xì)胞可見。
使用校準(zhǔn)的目鏡物鏡方格網(wǎng)測(cè)定肝臟的標(biāo)記指數(shù)(LI)。每只動(dòng)物計(jì)數(shù)10個(gè)視野并平均。計(jì)數(shù)每單位面積的總核數(shù)和被標(biāo)記的核數(shù)。校準(zhǔn)計(jì)數(shù)的視野所代表的肝實(shí)質(zhì)的相同面積，計(jì)數(shù)的所有視野與肝門三岔脈相鄰。
使用未配對(duì)雙尾Student t-檢驗(yàn)或單邊ANOVA多組比較分析全部資料。結(jié)果和討論進(jìn)行劑量應(yīng)答試驗(yàn)以鑒定KGF的有效劑量。每天注射KGF，四天后摘取器官。當(dāng)以ANOVA比較時(shí)，僅僅每天以5mg/kg的最高劑量注射的肝臟(以百分體重表示)與對(duì)照有顯著性差異(圖15)。其中注意到對(duì)于肝臟合成的血清蛋白質(zhì)，膽固醇和甘油三酯化合物，1和5mg/kg KGF劑量處理的大鼠與對(duì)照大鼠相比明顯較高(圖16)。
每天以5mg/kg KGF處理1、4或7天后分析動(dòng)物。經(jīng)過(guò)大體尸體剖檢，在7天時(shí)間點(diǎn)的肝臟顯著增大。KGF處理過(guò)的大鼠在所有試驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)肝臟重量明顯增加(第17天,KGF:4.08±0.08％而對(duì)照3.49±0.06％,p=0.0003)。
BrdU陽(yáng)性核定量分析證實(shí)在第一天KGF處理過(guò)的大鼠與對(duì)照相比增長(zhǎng)了3到4倍(圖17)。在處理后的第一天，以每個(gè)高倍視野內(nèi)的有絲分裂數(shù)表示的有絲分裂指數(shù)比對(duì)照明顯上升，這與BrdU計(jì)數(shù)結(jié)果一致。
這些結(jié)果證實(shí)KGF對(duì)肝臟具有促有絲分裂作用和分化作用。KGF處理1天后肝重的迅速增加與上升的有絲分裂指數(shù)和BrdU陽(yáng)性分?jǐn)?shù)證實(shí)KGF對(duì)這種上皮占優(yōu)勢(shì)的組織具有迅速和有效的影響。盡管KGF的有絲分裂作用迅速下降，但在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中以百分體重表示的肝重持續(xù)增加。增加的重量最初是由于最早在第1天并持續(xù)到處理的4和7天組織學(xué)上可觀察的細(xì)胞增加引起的。由于在肝再生期間在不到兩周的時(shí)間內(nèi)肝質(zhì)量能以大于2倍的速度增加，所以在處理1天后開始發(fā)現(xiàn)顯著的差別并不奇怪。
白蛋白水平的上升不與脫水以外的其它任何已知疾病狀態(tài)相聯(lián)系。由于存在的肺細(xì)胞數(shù)目增加，KGF很可能誘導(dǎo)血清白蛋白(和其它蛋白質(zhì))水平增高。由KGF誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成的增加可能對(duì)處于晚期肝疾病或肝硬化的病人具有極大的挽救生命的益處。
實(shí)施例4部分肝切除術(shù)后KGF體內(nèi)刺激的肝細(xì)胞增生和恢復(fù)在本實(shí)驗(yàn)中，雄性Spraque-Dawley大鼠每只重300到340克，用作實(shí)驗(yàn)對(duì)象。材料和方法使用Higgins和Anderson(Archives of Pathology,Volume12,Page 196(1931))的程序?qū)γ恐淮笫笫┬?/3的部分肝切除。從手術(shù)后8小時(shí)開始，此后每天繼續(xù)一次以1mg/kg劑量的PBS(對(duì)照組)或KGF皮下注射大鼠。手術(shù)后4、7、10或14天稱重和處死對(duì)照的和KGF處理過(guò)的大鼠。然后摘取殘余的肝臟并稱重。結(jié)果和討論發(fā)現(xiàn)以KGF處理部分肝切除的大鼠在絕對(duì)和相對(duì)基礎(chǔ)上都導(dǎo)致肝質(zhì)量恢復(fù)的明顯加速，分別如圖18和19所示。KGF處理組的肝質(zhì)量在7天內(nèi)恢復(fù)到手術(shù)前的質(zhì)量值。作為對(duì)照，對(duì)照組(未經(jīng)KGF處理)絕對(duì)和相對(duì)肝質(zhì)量即使在14天后仍不能完全恢復(fù)。
實(shí)施例5KGF對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)性肝毒性的改善作用雄性Spraque-Dawley大鼠每只重300到340克，用于試驗(yàn)以評(píng)價(jià)導(dǎo)入化學(xué)毒素后KGF對(duì)肝臟的治療作用。用藥在第0天每組12只雄性Spraque-Dawley大鼠的各組以玉米油載體供給1ml/kg或2ml/kg的四氯化碳(CCl4)。每個(gè)劑量組往下分成各6只大鼠的兩個(gè)亞組。施用CCl4后3小時(shí)開始，此后每天繼續(xù)給各亞組皮下注射PBS或1mg/kg/天的KGF。在施用CCl4后22、72、144小時(shí)從每只大鼠取血液樣品并檢測(cè)血清谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(SGOT)水平。結(jié)果和分析如圖2D所示，口服CCl4后皮下注射KGF明顯降低血清酶(SGOT)水平，該酶是一種已知的肝損傷指示劑。在以2ml/kg口服后的第1天效果尤其顯著。
實(shí)施例6KGF刺激的腸粘膜上皮細(xì)胞的增生和分化本實(shí)施例評(píng)價(jià)了KGF對(duì)健康大鼠腸粘膜上皮細(xì)胞的生物學(xué)影響。材料和方法雄性大鼠隨意接受水和食物。所有動(dòng)物每天接受腹膜內(nèi)注射KGF或PBS1、4或7天。在所有實(shí)驗(yàn)中，每組至少分析5只動(dòng)物。
所有大鼠以CO2室息處死。主要器官在黑暗中稱重，重量以每100克體重的克數(shù)(百分體重)來(lái)表示。腸道分成無(wú)腺體前腸。胃腺、小腸和大腸。組織樣品放入10％緩沖的福爾馬林中以備常規(guī)組織學(xué)處理。
來(lái)自摘取的所有器官的切片以蘇木精和曙紅(H和E)染色。處死前1小時(shí)，大鼠經(jīng)腹膜內(nèi)注射接受50mg/kg BrdU，使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行免疫組織化學(xué)使BrdU摻入DNA的復(fù)制細(xì)胞肉眼可見。選擇的組織用過(guò)碘酸-希夫(PAS)、Alcian blue pH2.5和Masson-Trichrome染色。
使用校準(zhǔn)的目鏡測(cè)量胃粘膜的高度和胃粘膜PAS染色的深度。同樣測(cè)量了絨毛長(zhǎng)度和十二指腸隱窩深度以及結(jié)腸隱窩的深度。為了定量杯狀細(xì)胞產(chǎn)物的變化，沿十二指腸絨毛基部開始100μm的長(zhǎng)度上計(jì)數(shù)PBS陽(yáng)性杯狀細(xì)胞數(shù)。在消化道的所有區(qū)域，僅對(duì)與下層粘膜肌層垂直的腺體或絨毛進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果以微米或以每單位面積小腸杯狀細(xì)胞平均數(shù)來(lái)記載。另外，測(cè)定了在結(jié)腸限定長(zhǎng)度內(nèi)的結(jié)腸隱窩數(shù)和增生(兩叉或三叉的)隱窩數(shù)。每動(dòng)物重復(fù)測(cè)量5至10次進(jìn)行平均。使用未配對(duì)雙尾Student t-檢驗(yàn)或單邊ANOVA多組比較分析所有數(shù)據(jù)(Statview Ⅱ,Abacus Concepts,Berkeley,CA)。結(jié)果和討論首先進(jìn)行劑量應(yīng)答試驗(yàn)以鑒定KGF的有效劑量。每天注射KGF，四天后摘取器官。在胃腺、小腸和結(jié)腸中觀察到顯著的劑量應(yīng)答(圖15)。
每天以5mg/kg KGF處理1、4和7天后分析動(dòng)物。經(jīng)過(guò)大體尸體剖檢，經(jīng)過(guò)4天和7天處理的前腸折疊的粘膜總體上增厚。在4和7天時(shí)前腸、胃腺、十二指腸和結(jié)腸表現(xiàn)出明顯的重量增加，但在處理一天的大鼠并不如此。在7天時(shí)，KGF處理過(guò)的動(dòng)物胃腺為0.65±O.01g，而對(duì)照為0.48±0.02g(p=0.0001)。
在處理4和7天的動(dòng)物中不具腺體的前腸重量明顯增加。KGF處理過(guò)的動(dòng)物在組織學(xué)上不具腺體的前腸鱗狀上皮出現(xiàn)輕微的(4天)到顯著的(7天)增生。增生的上皮的賁門處突然改變，食管為正常的鱗狀上皮，而處理過(guò)的前腸為增生上皮。經(jīng)過(guò)一天處理后，胃腺粘膜在組織學(xué)上表現(xiàn)正常。在4和7天，在組織學(xué)上杯狀細(xì)胞數(shù)明顯增加，因?yàn)檫@些細(xì)胞具有清楚的開放細(xì)胞質(zhì)。以KGF處理4和7天的動(dòng)物粘膜厚度表現(xiàn)出輕微增加(圖21)。在7天，粘液頸細(xì)胞層變寬并移向漿膜表面。PAS染色處理4天和7天的大鼠證實(shí)PAS陽(yáng)性(產(chǎn)粘蛋白的)杯狀細(xì)胞的數(shù)目和大小顯著增加。BrdU染色切片進(jìn)一步鑒定這一層為胃腺的分裂細(xì)胞層且表明處理過(guò)的大鼠增生細(xì)胞增加。KGF處理4天和7天時(shí)，胃粘膜腔表面PAS陽(yáng)性層的厚度也顯著增加(圖21)。
小腸在所有試驗(yàn)點(diǎn)總體上正常。PAS染色證實(shí)產(chǎn)粘液的杯狀細(xì)胞數(shù)增加。這種差別在4和7天時(shí)顯著(圖22)。在任一時(shí)間點(diǎn)的絨毛高度沒有差別，但在1和7天時(shí)隱窩深度明顯變大(圖22)。
在7天處理組結(jié)腸粘膜伸出形成皺褶狀折疊，使總表面大量增加。在所有組(包括對(duì)照)觀察到增生指示物(兩叉和三叉狀結(jié)腸隱窩)，但在短期處理組(例如1天和4天)量最大且最顯著，長(zhǎng)期處理增生隱窩數(shù)減少(圖23)。相應(yīng)地，處理組結(jié)腸隱窩的深度增加(圖24)。
PAS和Alcian blue染色表明KGF處理后整個(gè)結(jié)腸的產(chǎn)粘液杯狀細(xì)胞增加。另外，在全部處理7天的動(dòng)物中腔表面Alcian blue陽(yáng)性杯狀細(xì)胞數(shù)增加。處理4天的動(dòng)物在結(jié)腸隱窩上部1/2和1/3的PAS陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的增加。
這些結(jié)果證實(shí)KGF對(duì)胃腸道的上皮組織具有有效的促有絲分裂和分化作用。BrdU標(biāo)記顯示出KGF啟動(dòng)胃粘膜粘液頸層細(xì)胞的增生。這些細(xì)胞組成胃腺的祖細(xì)胞。分裂后，細(xì)胞從該層向上遷移(向腸腔)形成表面細(xì)胞或向下(向漿膜表面)變成占據(jù)胃腺的細(xì)胞Toner etal.,1989,in Gastrointestinal and Esophageal Pathology,Churchill Livingstone,New York,NY at Pages 13-28)。而且，KGF啟動(dòng)粘液頸細(xì)胞的選擇性分化，細(xì)胞向上移動(dòng)變成杯狀細(xì)胞。處理4天和7天時(shí)胃粘膜的總厚度增加。在小腸和大腸看到相似的效果。KGF經(jīng)過(guò)刺激祖細(xì)胞啟動(dòng)細(xì)胞分裂的增加，導(dǎo)致隱窩延長(zhǎng)。KGF也誘導(dǎo)分裂的隱窩細(xì)胞分化，其證據(jù)為粘液產(chǎn)量增加和絨毛或隱窩杯狀細(xì)胞數(shù)增加。
雖然本發(fā)明描述了有關(guān)具體實(shí)施方案和實(shí)施例，但應(yīng)理解這并不是為了限制本說(shuō)明書。因此，例如，任何實(shí)質(zhì)上重復(fù)天然存在的KGF生物學(xué)特性之KGF形式都能用于實(shí)現(xiàn)所述的用途。這些形式包括純化的天然存在的KGF本身，以化學(xué)方法合成的KGF，使用上述例子外的其他表達(dá)系統(tǒng)重組得到的KGF，以及以天然存在的氨基酸順序?yàn)榛A(chǔ)的類似物、變異體、嵌合體等。所有這些形式都可用于本發(fā)明的實(shí)施中。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員也將意識(shí)到，各種宿主-載體系統(tǒng)可用于表達(dá)KGF蛋白質(zhì)編碼序列。它們包括但不局限于病毒感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(例如牛痘病毒、腺病毒等)；以病毒感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)(例如，桿狀病毒)；微生物如含有酵母載體的酵母，或除用噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘性質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的E.coli外的其他細(xì)菌。這些載體表達(dá)元件的強(qiáng)度和特異性不同。依賴于所使用的宿主-載體系統(tǒng)不同，可使用一些合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件中的任何一種。
一旦使用如本說(shuō)明書所述的方法或本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其他方法分離、純化了KGF cDNA表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物并試驗(yàn)了KGF活性，可將它配制成各種藥用組合物。典型地，該組合物包括合適的(通常是化學(xué)上定義的)用作治療劑(KGF)的載體或賦形劑，和依賴于所需投藥形式而選用的其它成份。該組合物可包括水性載體或由固相配制品組成，其中KGF摻入到非水相的載體如膠原蛋白、透明質(zhì)酸和各種多聚物中。該組合物可適于配制成按各種途徑用藥的形式，包括注射、口服、局部施用、鼻內(nèi)途徑和以肺釋放途徑。
技術(shù)人員將了解到，依賴于所治療的疾病和用藥途徑，制劑中的KGF量將隨之變化，但可能在某一范圍內(nèi)有效，例如，從每kg體重0.01mg到每kg體重500mg。依賴于疾病和患者的狀態(tài)可一次或重復(fù)用藥。它可以與其他治療結(jié)合使用，包括但不局限于其他細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)因子和用于治療皮膚、肺、肝臟和胃腸道疾病的其他藥用制品。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請(qǐng)人Amgen Inc.
(ⅱ)發(fā)明題目角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的治療用途(ⅲ)序列數(shù)4(ⅳ)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人Amgen Inc.
(B)街道Amgen Center 1840 Dehavilland Drive(C)城市Thousand Oaks(D)州加利福利亞州(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵編(ZIP):91320-1789(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型Diskette,3.5in.,DS,2.0Mb(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容性(C)操作系統(tǒng)MS-DOS(D)軟件Microsoft Word Version 5.1a(ⅵ)最近申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日26-03-1993(C)分類(2)SEQ ID NO:1資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度55堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:CGATTTGATT CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGTTAACGC GTTGGAATTC GGTAC 55(3)SEQ ID NO:2資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度49堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:CGAATTCCAA CGCGTTAACC ATATGTTATT CCTCCTTCTA GAATCAAAT 49(4)SEQ ID NO:3資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度164堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:#GAAUACGAAU UCCUUGCUGU UUGGGCAGGA CAGUGAGCCA GGCAGACUGGUUGGCCUGCC CUAUAUAAUU GGAGACCUUA CAUAUAUAUU CCCCAGCAUCCAUCUCCGUC ACAUUGAACA GAGCCAGCAC UUCUGCAUUG GAGCUAUUUAUCCCCGAGUG GAUC 164(5)SEQ ID NO:4資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度191堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:GGGAGACAAG CUUGCAUGCC UGCAGGUCGA CUCUAGAGGA UCCACUCGGGGAUAAAUAGC UCCAAUGCAG AAGUGCUGGC UCUGUUCAAU GUGACGGAGAUGGAUGCUGG GGAAUAUAUA UGUAAGGUCU CCAAUUAUAU AGGGCAGGCCAACCAGUCUG CCUGGCUCAC UGUCCUGCCC AAACAGCAAG G 19權(quán)利要求
1．一種刺激非角質(zhì)細(xì)胞的上皮細(xì)胞產(chǎn)生的方法，包括將該細(xì)胞與有效量的KGF接觸。
2．權(quán)利要求1的方法，其中的非角質(zhì)細(xì)胞的上皮細(xì)胞選自皮脂細(xì)胞、毛囊細(xì)胞、肝細(xì)胞、Ⅱ型肺細(xì)胞、產(chǎn)粘液杯狀細(xì)胞和其它上皮細(xì)胞及其祖細(xì)胞，這些細(xì)胞包含在皮膚、肺、肝臟和胃腸道中。
3．權(quán)利要求1的方法，其中以體內(nèi)用藥實(shí)施。
4．權(quán)利要求1的方法，其中KGF是重組KGF。
5．權(quán)利要求4的方法，其中重組KGF在細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生。
6．權(quán)利要求5的方法，其中細(xì)菌細(xì)胞是E.coli。
7．一種刺激皮脂腺和毛囊細(xì)胞產(chǎn)生來(lái)治療真皮損傷的方法，包括給需要醫(yī)治的患者施用治療有效量的KGF。
8．權(quán)利要求7的方法，其中真皮損傷是燒傷。
9．一種治療大泡性表皮松解的方法，包括給需要醫(yī)治的患者施用治療有效量的KGF。
10．一種治療化療誘導(dǎo)的脫發(fā)病之方法，包括給需要醫(yī)治的患者施用治療有效量的KGF。
11．一種治療男性型禿頭的方法，包括給需要醫(yī)治的患者施用治療有效量的KGF。
12．一種治療胃潰瘍的方法，包括給需要醫(yī)治的患者施用治療有效量的KGF。
13．一種治療十二指腸潰瘍的萬(wàn)法，包括給需要醫(yī)治的患者施用治療有效量的KGF。
14．一種治療胃和食道糜爛的方法，包括給需要醫(yī)治的患者施用治療有效量的KGF。
15．權(quán)利要求14的方法，其中所治療的疾病是糜爛性胃炎、食道炎或食道逆流(esophageal reflux)。
16．一種治療炎性腸疾病的方法，包括給需要醫(yī)治的患者施用治療有效量的KGF。
17．一種治療或預(yù)防放射或化療誘導(dǎo)的腸道毒性的方法，包括給需要醫(yī)治的患者施用治療有效量的KGF。
18．一種治療透明膜疾病的方法，包括給需要醫(yī)治的患者施用治療有效量的KGF。
19．一種治療由口吸入劑引起的呼吸道上皮壞死的方法，包括給需要醫(yī)治的患者施用治療有效量的KGF。
20．一種治療肺氣腫的方法，包括給需要醫(yī)治的患者施用治療有效量的KGF。
21．一種治療肺炎和纖維化的方法，包括給需要醫(yī)治的患者施用治療有效量的KGF。
22．一種治療肝硬化的方法，包括給需要醫(yī)治的患者施用治療有效量的KGF。
23．一種治療暴發(fā)性肝衰竭的方法，包括給需要醫(yī)治的患者施用治療有效量的KGF。
24．一種治療急性病毒性肝炎的方法，包括給需要醫(yī)治的患者施用治療有效量的KGF。
全文摘要
根據(jù)對(duì)動(dòng)物的廣泛體內(nèi)研究,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn):除了角質(zhì)細(xì)胞外,角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)還刺激上皮組織的各種細(xì)胞的增生、生長(zhǎng)和分化。這種對(duì)KGF體內(nèi)生物學(xué)作用的較好認(rèn)識(shí)使得這一多肽用作治療劑成為可能,它適于配制成藥用組合物,以特異性地治療損害組織和器官如皮膚附屬物、肝臟、肺和胃腸道的疾病和病變。
文檔編號(hào)C07KGK1217022SQ9419203
公開日1999年5月19日 申請(qǐng)日期1994年3月24日 優(yōu)先權(quán)日1993年3月26日
發(fā)明者G·F·皮爾斯, R·M·豪斯利, C·F·莫里斯 申請(qǐng)人:安姆根有限公司